茯磚茶中金花菌群的研究進(jìn)展

呂嘉櫪，楊柳青，孟雁南

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

茯磚茶是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵黑茶的代表，是我國(guó)獨(dú)有且是真正意義上有微生物參與的全發(fā)酵茶。茯磚茶主要以黑毛茶為原料，經(jīng)過汽蒸、渥堆、發(fā)花、干燥、包裝等一系列復(fù)雜工藝由多種微生物發(fā)酵精制而成，其中發(fā)花是茯磚茶加工最關(guān)鍵的一步，決定著茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌的種類和數(shù)量[1]，也對(duì)茯磚茶的質(zhì)量有重要作用。經(jīng)過發(fā)花的茯磚茶內(nèi)部有大量?jī)?yōu)勢(shì)金花菌，可形成茯磚茶的黑茶花色和獨(dú)特風(fēng)味，具有多方面的促健康作用，如抗氧化、助消食、調(diào)節(jié)血脂、減肥、逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)腸道健康等[2-5]?；诮鸹ň鷮?duì)茯磚茶的重要作用，研究者們對(duì)茯磚茶中金花菌的分類鑒定進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)金花菌是一群形態(tài)結(jié)構(gòu)相似、生理生化特性相近的微生物的統(tǒng)稱，但其種屬關(guān)系及命名尚無定論，目前較為認(rèn)可的是冠突散囊菌為茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌的含量和種類相差較大[6];同時(shí)，由于茯磚茶的加工較多基于傳統(tǒng)工藝，對(duì)天然微生物的依賴性較大，導(dǎo)致不同批次甚至是同一批次生產(chǎn)的茯磚茶發(fā)花程度和品質(zhì)良莠不齊，嚴(yán)重影響茯磚茶的品質(zhì)和產(chǎn)量。且黑曲霉等其他霉菌的大量生長(zhǎng)會(huì)引起茯磚茶的發(fā)花異常，金花菌數(shù)量無法達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，從而影響茯磚茶的品質(zhì)，一些腐敗微生物的生長(zhǎng)也容易導(dǎo)致制茶的失敗或者生產(chǎn)貯存過程中的霉變[7]，使得茯磚茶中有效成分降低，品質(zhì)下降[8]，給消費(fèi)者帶來安全隱患。因此，只有茯磚茶的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)才能保證并提高茯磚茶的品質(zhì)及產(chǎn)量，這也是未來茯磚茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路，而茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)在于茯磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌的準(zhǔn)確鑒定以及金花菌優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的篩選，這對(duì)茯磚茶品質(zhì)檢測(cè)、避免污染以及標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)有重要作用。本文將對(duì)茯磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌的分類鑒定現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群的研究現(xiàn)狀

茯磚茶加工過程中的發(fā)花工藝是形成茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶發(fā)花過程是多種微生物共同參與的[9-10]，這些微生物有的本來存在于茶葉表面，有的是在后期加工工藝中自然生長(zhǎng)的，而金花菌是在發(fā)花過程中逐漸成為茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌。自19世紀(jì)40年代開始，就有學(xué)者對(duì)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行研究，但對(duì)于茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌群的鑒定一直存在爭(zhēng)議。

倉(cāng)道平等[11]采用平板分離法從湖南茯磚茶中分離出的優(yōu)勢(shì)微生物為舍氏曲霉（Aspergillus chevalieri），屬于曲霉屬灰綠曲霉群，可形成茯磚茶表面的金花，此外還分離出了少量的黑曲霉（A. niger）、青曲霉（Penicillium frequenans）、白曲霉（Penicilliumsp.）。溫瓊英[12]研究也發(fā)現(xiàn)曲霉屬灰綠曲霉群中的A. chevalieri是湖南茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)微生物，占茯磚茶所有霉菌總數(shù)的90%以上。梁曉嵐[13]認(rèn)為四川茯磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌為冠突曲霉（A. cristatus）和舍氏曲霉（A. chevalieri），而黑曲霉（A. niger）等其他霉菌僅占霉菌總數(shù)的10%左右。趙仁亮等[14]發(fā)現(xiàn)陜西、湖南、浙江地區(qū)茯磚茶樣品中優(yōu)勢(shì)菌群為金花菌，并通過形態(tài)學(xué)觀察、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS）和β-tubulin系列的系統(tǒng)發(fā)育分析將金花菌鑒定為曲霉屬，鑒定陜西、湖南茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群為冠突曲霉（A. cristatus），浙江產(chǎn)區(qū)茯磚茶優(yōu)勢(shì)金花菌為謝瓦曲霉（A. chevalieri）。之后又通過高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了曲霉屬在茯磚茶中占優(yōu)勢(shì)，而金花菌則是曲霉屬內(nèi)的主要菌群[7]，Rui Ying等[15]也通過Illumina Miseq技術(shù)得到了相同的結(jié)果。

以上研究者認(rèn)為，不同產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌屬于曲霉屬內(nèi)的真菌，其中茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌主要有A. cristatus和A. chevalieri。而趙仁亮等[16]則認(rèn)為茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌為散囊菌屬內(nèi)的真菌，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是金花菌中的優(yōu)勢(shì)菌，但還有謝瓦散囊菌（E. chevalieri）、間型散囊菌（E. intermedius）、匍匐散囊菌（E. repens）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）、赤散囊菌（E. rubrum）和蠟葉散囊菌（E. herbariorum）等其他散囊菌的組成。

對(duì)于茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群的研究主要集中在湖南產(chǎn)區(qū)的茯磚茶，趙仁亮[17]和張浩[18]等采用平板分離鑒定的方法發(fā)現(xiàn)湖南茯磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌是散囊菌屬真菌，黑曲霉和青霉是天然發(fā)花茯磚茶中出現(xiàn)頻率較高的微生物，但含量較少。劉石泉[19]采用平板梯度稀釋法從湖南茯磚茶中分離出了蠟葉散囊菌（E. herbariorum）、產(chǎn)紫青霉（P. purpurogenum）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum）、青霉（Penicilliumsp.）和醬油曲霉（A. sojae），其中E. herbariorum是優(yōu)勢(shì)金花菌，其余為非優(yōu)勢(shì)菌，含量相對(duì)少。胡治遠(yuǎn)等[20]根據(jù)微生物經(jīng)典鑒定法發(fā)現(xiàn)湖南產(chǎn)區(qū)茯磚茶樣品中優(yōu)勢(shì)微生物為散囊菌屬內(nèi)的真菌，主要有冠突散囊菌（E. cristatum）、謝瓦散囊菌（E. chevalieri）、肋狀散囊菌（E. costiforme）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）和蠟葉散囊菌（E. herbariorum），其次還有黑曲霉（A. niger）的存在。Xu Aiqing等[21]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)發(fā)現(xiàn)湖南茯磚茶中主要微生物是散囊菌屬中的冠突散囊菌（E. cristatum）。文杰宇[22]結(jié)合傳統(tǒng)分離純化及PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)湖南茯磚茶樣品中優(yōu)勢(shì)微生物為金花菌，主要由冠突散囊菌（E. cristatum）、蠟葉散囊菌（E. herbariorum）、赤散囊菌（E. rubrum）和匍匐散囊菌（E. repens）等散囊菌屬真菌組成。宋偉[23]通過形態(tài)學(xué)及ITS序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)散囊菌屬內(nèi)的E. cristatum和E. amstelodami是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌，還有少量塔賓曲霉（A. tubingensi）、斑點(diǎn)青霉（P. meleagrinum）和泡盛曲霉（A. awamori）。

對(duì)于其他產(chǎn)區(qū)茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群的研究報(bào)道較少，丁婷[24]通過形態(tài)學(xué)及ITS序列鑒定發(fā)現(xiàn)陜西茯磚茶優(yōu)勢(shì)金花菌為冠突散囊菌（E. cristatum）。呂嘉櫪等[25-26]根據(jù)陜西茯磚茶中金花菌的孢子形態(tài)、ITS及18S rDNA序列分析，認(rèn)為陜西茯磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌有E. chevalieri、E. cristatum、E. amstelodami、E. costiforme4種，但I(xiàn)TS序列在該屬內(nèi)保守。阮林浩[27]通過平板分離法發(fā)現(xiàn)浙江茯磚茶主要為冠突散囊菌（E. cristatum）。

以上研究者通過傳統(tǒng)平板分離鑒定、ITS序列鑒定、18S rDNA序列鑒定、β-tubulin序列鑒定、PCR-DGGE、Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)等多種方法對(duì)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行了分析，其中研究最多的是湖南產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)四川、浙江產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的菌群也有研究，對(duì)陜西產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌群研究較少。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌群都是金花菌，金花菌是形態(tài)學(xué)及功能性相似的特定菌群，由于研究者對(duì)該菌群的鑒定大多運(yùn)用的是單一的分類鑒定方法，且每種方法的分辨率不同，所以不同的鑒定方法有不同的屬名及種名鑒定結(jié)果，導(dǎo)致對(duì)這個(gè)菌群的種屬鑒定結(jié)果尚未有定論，給金花菌的科學(xué)命名帶來混亂。

2 茯磚茶中金花菌的鑒定

根據(jù)目前茯磚茶中金花菌的研究現(xiàn)狀，分析得出茯磚茶中金花菌組成多樣，且并非是傳統(tǒng)上認(rèn)為的冠突散囊菌（E. cristatum），而是由多種目前分類歸在散囊菌屬和曲霉屬曲霉組內(nèi)的菌群組成，這些菌形態(tài)結(jié)構(gòu)相近、生理生化特性相似，是茯磚茶中特定存在的微生物，且E. cristatum是金花菌中的主要菌種，其他散囊菌在金花菌中的占比不同，金花菌中微生物的組成和含量對(duì)茯磚茶的品質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生影響。所以對(duì)金花菌進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定是有效區(qū)分茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群的重要環(huán)節(jié)，也可為茯磚茶產(chǎn)業(yè)菌種的穩(wěn)定性和優(yōu)良性提供依據(jù)。但目前研究者對(duì)金花菌的屬名及種名的鑒定結(jié)果并不一致，對(duì)茯磚茶中金花菌的屬名及種名鑒定現(xiàn)狀如下。

2.1 茯磚茶中金花菌的屬名鑒定

茯磚茶中金花菌的屬名有其發(fā)展歷程，且在鑒定時(shí)存在屬一級(jí)的分歧，主要分歧為曲霉屬（Aspergillus）和散囊菌屬（Eurotium）兩種。傳統(tǒng)上金花菌的鑒定是以形態(tài)學(xué)為依據(jù)的，金花菌兼具有性型和無性型兩種繁殖特征，且金花菌的有性和無性繁殖特征需要通過不同條件誘導(dǎo)才可出現(xiàn)，最早徐國(guó)楨由于未觀察到有性形態(tài)，僅根據(jù)分生孢子梗有隔膜初步將茯磚茶中的金花菌歸為曲霉屬灰綠曲霉群（Aspergillus glaucusGroup），并將其稱為黃霉菌[28]。

胡建程等[29]認(rèn)為茯磚茶中的黃霉菌可能是灰綠曲霉黃色粉末狀的有性孢子，但也有可能是米曲霉的黃色粉末狀孢子，故而僅將茯磚茶中分離到的黃霉菌鑒定為曲霉屬（Aspergillus），并未鑒定到種。之后，胡建程等[30]確定了茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌為曲霉屬灰綠曲霉群。在之后的幾年中，研究者均參考Powell等[31]的The Genus Aspergillus，將分離得到的金花菌歸為曲霉屬灰綠曲霉群。齊祖同等[32]認(rèn)為金花菌既可產(chǎn)生有性型，也可產(chǎn)生無性型，按國(guó)際植物命名法規(guī)，真菌分類的主要依據(jù)是有性繁殖的方式，所以它的正確名稱應(yīng)當(dāng)是以有性型來命名，而該專著違反了當(dāng)時(shí)的國(guó)際植物命名法規(guī)，從而將金花菌歸為散囊菌屬（Eurotium）。劉作易[33]在其金花菌研究進(jìn)展綜述中，認(rèn)同了齊祖同等將茯磚茶中金花菌歸為散囊菌屬，尹旭敏[34]采用形態(tài)學(xué)方法分離出了茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌，根據(jù)其有性繁殖特征和無性繁殖特征，將無性型鑒定為曲霉屬，有性型鑒定為冠突散囊菌，分類學(xué)歸屬為真菌界-子囊菌門-不整子囊菌綱-散囊菌目-散囊菌科-散囊菌屬。自此，散囊菌這一屬名逐漸被大家認(rèn)可。2015年，王磊等[35]以Hubka對(duì)曲霉屬曲霉組的最新分類系統(tǒng)，將茯磚茶中金花菌歸為曲霉屬曲霉組。之后，有些學(xué)者將茯磚茶中金花菌歸為曲霉屬，而有些則仍然延用散囊菌屬，至今并未有定論。

2.2 茯磚茶中金花菌的種名鑒定

對(duì)于金花菌的種名，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為金花菌即冠突散囊菌，但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)茯磚茶中金花菌的組成具有多樣性，不同產(chǎn)區(qū)、不同發(fā)花季節(jié)茯磚茶金花菌中的散囊菌種類和組成有所差異[36]。有些學(xué)者將金花菌歸屬在散囊菌屬，茯磚茶中常見的有E. cristatum、E. amstelodami、E. chevalieri、E. intermedius、E. repens、E. herbariorum、E. costiforme、E. rubrum;有些學(xué)者則將同種的金花菌歸在曲霉屬，相對(duì)應(yīng)的分別為A. cristatus、A. amstelodami、A. chevalieri、A. intermedius、A. pseudoglaucus、A. glaucus、A. costiformis、A. ruber，可以看出有的菌雖然種名一致，但屬名存在爭(zhēng)議，如E. amstelodami和A. amstelodami，有的菌其種名和屬名都不一致，如E. cristatum和A. cristatus等。這些金花菌的培養(yǎng)特征為金黃色或近似黃色，均可產(chǎn)生黃色閉囊殼，子囊孢子表面光滑或具不同紋飾;其無性型大多為灰綠色的分生孢子頭，肉眼觀察差異較小，高分辨率電子顯微鏡可觀察到差異。

金花菌種名的鑒定與其屬名的命名歷程有關(guān)，胡建程等[29-30]對(duì)茯磚茶中霉菌進(jìn)行研究時(shí)，根據(jù)顯微鏡下子囊果的形態(tài)將其鑒定為灰綠曲霉（A. glaucus），并確定了與茯磚茶品質(zhì)息息相關(guān)的金花菌是A. glaucus的有性繁殖特征。1981年，倉(cāng)道平等[11]主要根據(jù)金花菌子囊果和子囊孢子光學(xué)顯微特征將其鑒定為灰綠曲霉群的舍氏曲霉（A. chevalieri）。1986年，溫瓊英[12]在掃描電子顯微鏡下觀察到金花菌的有性孢子表面粗糙，而謝瓦氏曲霉有性孢子表面光滑，之后與齊祖同等[32]對(duì)湖南茯磚茶優(yōu)勢(shì)菌的鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后，認(rèn)為金花菌種名應(yīng)為冠突曲霉（A. cristatus）。齊祖同[32]和溫瓊英[37]等研究認(rèn)為金花菌是產(chǎn)生有性型（子囊孢子階段）和無性型（分生孢子階段）的全型真菌，此菌的主要特征是具冠狀突起及表面明顯粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子。根據(jù)冠突曲霉的有性型將其更名為冠突散囊菌（E. cristatum），而根據(jù)無性型命名為針刺曲霉（A. spiculosus），異名為小冠曲霉（A. cristatus）。劉作易等[38]在電子顯微鏡下觀察到的金花菌分生孢子表面呈瘤狀突起，無刺，這與齊祖同[32]、溫瓊英[37]等描述的分生孢子表面粗糙、具小刺的特征有所不同，他根據(jù)The Genus Aspergillus中對(duì)灰綠曲霉群的描述，將金花菌鑒定為謝瓦曲霉間型變種（A. chevalierivar.intermediusThom and Raper）。隨后劉作易[33]在其金花菌研究進(jìn)展綜述中，認(rèn)同了齊祖同將金花菌歸為散囊菌屬，并將謝瓦曲霉間型變種（A. chevalierivar.intermediusThom and Raper）的鑒定結(jié)果更名為間型散囊菌（E. intermediumBlaser）。之后冠突散囊菌這一命名被人們所接受。2011年，彭曉赟等[39]根據(jù)湖南地區(qū)茯磚茶上金花菌的菌落以及子囊孢子、分生孢子的形態(tài)特征將其鑒定為冠突散囊菌（E. cristatum），他認(rèn)為，冠突散囊菌分生孢子是否光滑不是一個(gè)穩(wěn)定的特征，可能與放大倍數(shù)有關(guān)，而分生孢子有無刺則與孢子發(fā)育程度有關(guān)。

以上研究對(duì)金花菌分種主要是根據(jù)子囊孢子和分生孢子的形態(tài)和大小，且對(duì)于金花菌的分類鑒定主要集中在冠突散囊菌（E. crsitatum）、謝瓦氏曲霉（A. chevalieri）、謝瓦氏曲霉間型變種（A. chevalierivar.Intermedius）3 個(gè)種名，冠突散囊菌與謝瓦氏曲霉間型變種的區(qū)別主要在于子囊孢子的大小，而謝瓦氏曲霉與其他兩者的區(qū)別在于分生孢子是否光滑，但這有可能與孢子的成熟程度、培養(yǎng)方法和檢測(cè)方法有關(guān)，所以以形態(tài)學(xué)為依據(jù)進(jìn)行鑒定具有很大的不確定性。近年來，隨著研究手段和研究方法的發(fā)展，研究者們開始將生理生化及分子生物學(xué)應(yīng)用于金花菌的分類鑒定中，對(duì)“金花菌”有了更深入的認(rèn)識(shí)。

王文濤[40]以形態(tài)學(xué)方法、18S rDNA和ITS序列分析、酯酶同工酶分析對(duì)全國(guó)茯磚茶中金花菌進(jìn)行了系統(tǒng)的分類研究，他認(rèn)為茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群為冠突散囊菌，且由于地域和環(huán)境的不同，冠突散囊菌在形態(tài)上存在差異，可能是其亞種或變種。黃浩等[41-42]根據(jù)菌落菌體形態(tài)特征、ITS序列分析及18S rDNA序列分析將金花菌鑒定為冠突散囊菌（E. cristatum），無性型為針刺曲霉（A. spiculosusBlaser）。王磊等[35]從廣西和湖南產(chǎn)區(qū)的黑磚茶中分離出兩株金花菌，根據(jù)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征，結(jié)合β-微管蛋白基因，鈣調(diào)節(jié)蛋白基因及RNA聚合酶II基因的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，以Hubka對(duì)曲霉屬曲霉組的最新分類系統(tǒng)，將2 株菌分別鑒定為假灰綠曲霉屬（A. pseudoglaucus）、冠突曲霉（A. cristatus），并認(rèn)為應(yīng)將之前報(bào)道的“金花菌”修訂為冠突曲霉，異名冠突散囊菌。譚玉梅等[43]同樣采用形態(tài)學(xué)和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析將貴州地區(qū)茯磚茶中金花菌鑒定為冠突曲霉（A. cristatus）。孟令緣等[44]根據(jù)菌落菌體形態(tài)，參考真菌鑒定手冊(cè)，將涇陽(yáng)茯磚茶中分離得到的26 株金花菌初步鑒定為子囊菌綱-真子囊菌亞綱-球殼菌目-冠囊菌科-冠散囊菌屬，之后根據(jù)26 株菌株的ITS及28S rRNA序列的分析鑒定結(jié)果，最終將26 株金花菌確定為冠突散囊菌（E. cristatum）。

歷年來對(duì)茯磚茶中金花菌的鑒定結(jié)果見表1，可以看出對(duì)茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定還存在諸多分歧，首先是鑒定為同一種的菌應(yīng)該使用其有性名稱還是無性名稱的分歧，其次是金花菌是哪一種的分歧。這兩種分歧與屬名的鑒定不一致有關(guān)，而研究者對(duì)金花菌的形態(tài)學(xué)觀察也是基于不同培養(yǎng)基，可能也導(dǎo)致了茯磚茶中金花菌鑒定的不同結(jié)果。此外，這些分歧與金花菌的形態(tài)學(xué)多樣性也有關(guān)，胡治遠(yuǎn)等[45]研究發(fā)現(xiàn)鑒定為冠突散囊菌的7 種金花菌其形態(tài)學(xué)及生理特征表現(xiàn)出較為明顯的分化。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，金花菌的ITS序列[25,46]及18S rDNA[47]序列是相對(duì)保守的，這也有可能導(dǎo)致茯磚茶中金花菌的鑒定結(jié)果存在差異。

表 1 歷年學(xué)者對(duì)茯磚茶中優(yōu)勢(shì)微生物的鑒定結(jié)果Table 1 Dominant microbes in Fuzhuan brick tea identified by previous researchers

2.3 曲霉屬和散囊菌屬的分類現(xiàn)狀

通過分析茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌群的研究現(xiàn)狀及種屬名鑒定，可以看出茯磚茶中優(yōu)勢(shì)金花菌主要集中在曲霉屬和散囊菌屬，屬名及種名上存在不一致現(xiàn)象，這個(gè)現(xiàn)象與曲霉屬和散囊菌屬的分類現(xiàn)狀及命名歷程有關(guān)。

散囊菌屬EurotiumLink由Link[49]命名，該屬內(nèi)的物種是兼具有性型和無性型的全型真菌，通常產(chǎn)生黃色子囊果、凸透鏡狀子囊孢子、灰綠色的單列分生孢子頭以及黃色、橙色或紅色的菌絲。Powell等[31]認(rèn)為產(chǎn)生有性階段的曲霉占少數(shù)，大部分曲霉是以無性階段存在的，而目前只有無性繁殖特征的曲霉可能也存在有性繁殖特征，研究者也已經(jīng)接受了曲霉屬內(nèi)無性繁殖物種的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，所以應(yīng)將曲霉屬（Aspergillus）的名稱應(yīng)用于所有曲霉屬的真菌，并將散囊菌屬作為單獨(dú)的一個(gè)群（灰綠曲霉群A. glaucusGroup）劃分至曲霉屬。Malloch等[50]對(duì)散囊菌屬重新定義，并將曲霉屬曲霉組（又稱作灰綠曲霉群（A. glaucusGroup））作為散囊菌屬對(duì)應(yīng)的無性型。

齊祖同[51]則認(rèn)為，雖然將有性型歸為曲霉屬有其方便之處，但該方法違反了《國(guó)際植物命名法規(guī)》，且“群”并不是一個(gè)分類學(xué)單位，并認(rèn)為全型真菌（即包括有性型和無性型的全部階段）的正確名稱是以有性型來命名，承認(rèn)了散囊菌屬的分類地位，并將無性型作為曲霉組轉(zhuǎn)移至散囊菌屬。Pitt[52]重新評(píng)價(jià)了Eurotium（Aspergillus）的命名和分類，并根據(jù)其子囊孢子的獨(dú)特性質(zhì)接受了E. amstelodamiMangin、E. chevalieriMangin、E. cristatum(Raper and Fennell) Malloch &Cain、E. echinulatumDelacroix、E. herbariorum(Wiggers)Link、E. repens(Corda) De Bary和E. rubrumKonig 7 個(gè)種名。Peterson[53]通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，證明了散囊菌屬是曲霉屬曲霉組的有性型，兩者具有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

Hubka等[54]利用ITS區(qū)、β-微管蛋白具基因（BenA）、鈣調(diào)蛋白基因（CaM）及RNA聚合酶II基因（RPB2）序列，從微觀和宏觀形態(tài)以及生理學(xué)特征角度對(duì)曲霉屬曲霉組的分類做了全面的修訂，并根據(jù)最新國(guó)際植物命名法規(guī)，將散囊菌屬各種作為曲霉組移入曲霉屬，最終確認(rèn)接受的種名減少到16 種。Chen等[55]應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征、生化特征和系統(tǒng)發(fā)育的多相方法來對(duì)曲霉屬曲霉組（散囊菌屬）的物種進(jìn)行研究，只承認(rèn)了無性型曲霉屬的名稱，并確認(rèn)了31 種，包括7 個(gè)新種。將研究者們對(duì)該屬分類的研究結(jié)論的比較進(jìn)行了整理，具體見表2。

表 2 不同文獻(xiàn)對(duì)曲霉屬曲霉組的物種分類Table 2 Overview of species belonging to Aspergillus reported by different authors

由表1、2可以看出，研究者們除了對(duì)曲霉屬和散囊菌屬的屬名存在爭(zhēng)議以外，對(duì)該屬下的物種分類也存在分歧。尤其是茯磚茶中較常出現(xiàn)的A. cristatus、A. montevidensis、A. pseudoglaucus、A. ruber和A. glaucus等的分類?；靵y存在的原因主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)種的分生孢子形態(tài)基本一致，子囊孢子雖然可以用來區(qū)分不同的物種，但必須在電子顯微鏡下才可觀察到不同種的子囊孢子的差異性。造成了一些研究者將A. ruber與A. glaucus或者將A. pseudoglaucus與A. glaucus視為同一種名的同義詞。此外，Pitt[52]還將A. intermedius作為A. cristatus的同義詞，齊祖同[51]將A. cristatus更名為E. cristatum，無性型為A. cristatellus，而A. intermedius和A. cristatus又容易被誤認(rèn)為是A. montevidensis。Powell等[31]將A. montevidensis和A. amstelodami視為不同種，齊祖同將這兩種歸為E. amstelodami，無性型為A. vitis，而Hubka[54]和Chen[55]等卻認(rèn)為A. amstelodami、E. amstelodami兩個(gè)種的有效名應(yīng)為A. montevidensis。

以上分類觀點(diǎn)的差異性也導(dǎo)致了該屬內(nèi)種名的差異性，表3陳列了目前散囊菌屬（曲霉屬曲霉組）內(nèi)的物種及其同義詞，可以看出該屬內(nèi)的物種存在著嚴(yán)重的一菌多名的問題，有的種，如A. montevidensis最多有7 個(gè)同義種名，而最少的也有兩個(gè)種名，說明該屬內(nèi)真菌不止在屬名上鑒定有分歧，在種名的鑒定上也有較大差異。此外，菌株具有多個(gè)同義詞使得研究者在對(duì)茯磚茶中金花菌進(jìn)行鑒定時(shí)，極有可能將相同的種鑒定為不同種，而不同研究者鑒定為不同種的菌，可能是同一種，例如針刺曲霉A. spiculosus，一直以來，分類學(xué)家把A. spiculosus作為E. cristatum的異名[32,37,41-42,51]，但Hubka等[54]研究發(fā)現(xiàn)A. spiculosus實(shí)為A. intermedius的異名。

表 3 目前曲霉屬曲霉組常見物種及其異名[31,51,54-56]Table 3 List of common Aspergillus species and their synonyms[31,51,54-56]

通過以上分析可以得出，國(guó)際上一些法規(guī)及專著對(duì)曲霉屬和散囊菌屬的分類觀點(diǎn)不一致，導(dǎo)致了研究者們對(duì)茯磚茶中金花菌屬名的最終命名存在爭(zhēng)議，包括美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）、UNITE等菌種鑒定常用數(shù)據(jù)庫(kù)中上傳的屬名也有不一致現(xiàn)象。此外，由于該屬內(nèi)真菌一種多名現(xiàn)象的存在、金花菌中真菌組成的多樣性、金花菌中的菌株形態(tài)學(xué)的高度相似性以及菌株培養(yǎng)基選擇的差異性、基因序列的高度保守性等多種原因，導(dǎo)致了不同研究者在對(duì)茯磚茶中真菌進(jìn)行種名鑒定時(shí)，可能將不同金花菌鑒定為同一種，或?qū)⑼环N金花菌鑒定為不同種。所以對(duì)茯磚茶中金花菌繼續(xù)進(jìn)行分離及鑒定是很有必要的。

3 結(jié) 語

茯磚茶中的金花菌數(shù)量是評(píng)價(jià)茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，所以對(duì)茯磚茶中金花菌種群的分類鑒定具有重要意義。早在19世紀(jì)40年代就有學(xué)者對(duì)茯磚茶中金花菌的種屬鑒定進(jìn)行分析研究，但由于技術(shù)有限，且金花菌的形態(tài)具有多樣性，金花菌的種名確定一直存在爭(zhēng)議，之后研究者將生理生化及分子生物學(xué)方法與形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合對(duì)金花菌進(jìn)行分類鑒定，使得金花菌的鑒定結(jié)果也更趨于客觀性和準(zhǔn)確性。

但由于曲霉屬及散囊菌屬分類觀點(diǎn)的不同、分類鑒定手段的局限以及茯磚茶產(chǎn)區(qū)及加工方法的不同，茯磚茶中金花菌的組成至今并未有定論，且并沒有一種單一的方法可以將茯磚茶中的金花菌準(zhǔn)確鑒定至種。筆者也采用菌落形態(tài)、有性產(chǎn)孢構(gòu)造和無性產(chǎn)孢構(gòu)造的形態(tài)學(xué)鑒定、ITS鑒定及18S rDNA鑒定等方法對(duì)陜西茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)金花菌群進(jìn)行了鑒定，將鑒定結(jié)果與目前散囊菌屬和曲霉屬的分類進(jìn)行綜合對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)可根據(jù)金花菌的無性產(chǎn)孢構(gòu)造和ITS、18S rDNA序列鑒定至屬水平，而有性產(chǎn)孢構(gòu)造可作為金花菌分種鑒定的主要依據(jù)，當(dāng)有性產(chǎn)孢構(gòu)造難以區(qū)分時(shí)，再以無性產(chǎn)孢構(gòu)造的形態(tài)差異進(jìn)行鑒定，如果有性和無性產(chǎn)孢構(gòu)造均無明顯差異時(shí)，以菌落形態(tài)的差異作為鑒定依據(jù)。而目前也有研究發(fā)現(xiàn)金花菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝物，如吲哚生物堿類、聚酮類化合物以及引起金花菌子囊果黃色的蒽醌類化合物等有所差異，可作為金花菌鑒定的依據(jù)。后期或許可以對(duì)有形態(tài)學(xué)差異的金花菌產(chǎn)生的一些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行生理生化方面的研究，以期探討出不同金花菌之間的差異性。此外，還需繼續(xù)探索需求更加準(zhǔn)確、分辨率更高的分子生物學(xué)方法，為金花菌的鑒定、金花菌優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的篩選以及茯磚茶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化方面提供依據(jù)。