黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠抗炎因子的調(diào)節(jié)作用

沈 蒙，王維浩,，康麗君，葛云飛，康子悅，肖金玲，全志剛，王 娟，劉德志，趙姝婷，王金滿，曹龍奎,,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319;3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 大慶 163319）

糖尿病是由于胰島功能部分缺失導(dǎo)致胰島素（insulin，INS）抵抗或INS分泌不足等癥狀引起的一種最常見的內(nèi)分泌疾病，通常伴有細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的發(fā)生[1]。調(diào)查結(jié)果顯示，現(xiàn)今，全世界已有2億多人患有糖尿病，到2025年，將有3億 人患糖尿病[2]，每年導(dǎo)致290多萬人死亡，未來30 年這一數(shù)字還將上升[3]。臨床上緩解糖尿病等癥狀的磺脲類或雙胍類降糖藥物，伴有嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、食欲下降、腹痛、腹瀉、過敏等癥狀[4]。因此，研究學(xué)者從飲食方面著手，探究尋找可以緩解預(yù)防糖尿病等癥狀的天然營養(yǎng)成分，既可以緩解糖尿病等癥狀，同時又無副作用[5]。

可溶性膳食纖維指不能被人體消化酶消化分解，可溶于熱水的非淀粉多糖，如低聚糖、果膠和樹膠之類的物質(zhì)等，可以調(diào)節(jié)血糖血脂、控制肥胖、抑制腫瘤生長、促進(jìn)腸道蠕動等[6-8]。研究表明，可溶性瓜爾膠纖維可以改善肥胖C57BL/6小鼠的體質(zhì)量、血糖水平、INS分泌量?？扇苄陨攀忱w維可以降低糖尿病大鼠餐后血糖濃度，增加INS分泌，改善糖尿病大鼠攝食量和體質(zhì)量，降低血漿中葡萄糖的濃度[9-11]。黑豆皮是黑豆加工制油過程中的副產(chǎn)物，其價格低廉，且在加工過程中大多被遺棄，少部分被用作飼料，這無疑是一種浪費(fèi)。黑豆皮中除了有較高含量的色素、油脂和蛋白質(zhì)外，膳食纖維的含量也較高[12]。

本實驗在Ma Mengmei[13]和佐兆杭[14]等的研究基礎(chǔ)上，以低劑量鏈脲佐菌素多次腹腔注射建立2型糖尿病小鼠模型，黑豆皮膳食纖維灌胃劑量為600 mg/kgmb（250 μL/只），研究其對糖尿病和炎癥因子水平的影響，為黑豆皮可溶性膳食纖維降血糖功能提供理論依據(jù)，同時為黑豆皮副產(chǎn)物開發(fā)增加經(jīng)濟(jì)價值。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

7 周齡雄性C57/BL6小鼠，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0003。

黑豆皮可溶性膳食纖維粉（純度為95%以上）國家雜糧技術(shù)研究中心;鏈脲佐菌素 美國Sigma公司;二甲雙胍 沈陽市華東試劑廠;小鼠血清INS、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）測試盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析級。飼料配方如表1所示。

表 1 飼料配方Table 1 Diet formulation for mice

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀 上海羅氏診斷儀器有限公司;GDE-CSF6膳食纖維測定儀 意大利VELP公司;QBS-200B型氣爆工藝試驗臺 鶴壁正道生物能源公司;MR-96A酶標(biāo)儀深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;AR2140電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆皮可溶性膳食纖維的制備

制備工藝流程：黑豆皮→蒸汽爆破改性（壓強(qiáng)1.0 MPa、時間80 s、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%）→烘干→粉碎（60 目）→耐高溫α-淀粉酶處理→中性蛋白酶處理→葡萄糖苷酶處理→過濾→體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液醇沉→冷凍干燥→粉碎（100 目）→黑豆皮可溶性膳食纖維粉

1.3.2 模型建立

選擇7 周齡健康雄性C57/BL6小鼠35 只，體質(zhì)量（22±2）g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，稱量體質(zhì)量，按體質(zhì)量隨機(jī)抽取7 只作為空白組，其余小鼠禁食12 h后，腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kgmb，連續(xù)注射5 d后禁食12 h，斷尾取血測血糖濃度，當(dāng)血糖濃度大于11.11 mmol/L時，且陸續(xù)出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀的小鼠（21 只）為糖尿病模型小鼠[15]，共分為3 組（模型組、陽性藥物組和膳食纖維組），每組7 只。空白組及模型組灌胃給予生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl），陽性藥物組灌胃二甲雙胍（100 mg/kgmb），膳食纖維組灌胃給予（600 mg/kgmb）黑豆皮可溶性膳食纖維溶液，灌胃劑量為250 μL/只，連續(xù)灌胃28 d。實驗期內(nèi)，各組小鼠均不限制攝食量與飲水量，每周定時稱量小鼠體質(zhì)量1 次。恒定溫度（22±2）℃和相對濕度（55±10）%，晝夜交替12 h/d。動物飼養(yǎng)和處理遵循中國實驗動物科學(xué)協(xié)會實驗動物福利和倫理委員會的規(guī)定[16]。

1.3.3 動物檢測指標(biāo)測定

1.3.3.1 動物體質(zhì)量的測定

實驗期間觀察實驗小鼠日常行為狀況并記錄，末次給藥并禁食禁水24 h后，稱量并記錄小鼠體質(zhì)量，每周一次[14,17]。

1.3.3.2 動物降血糖指標(biāo)的測定

眼眶采血法收集血液，12 000 r/min離心10 min，血清于-20 ℃保存，通過相應(yīng)試劑盒測定INS、TNF-α、IL-4、CRP質(zhì)量濃度。

1.3.3.3 組織病理學(xué)觀察

將小鼠的胰腺置于體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林溶液中，用乙醇脫水，包埋在石蠟中，切成4 μm切片，并用蘇木精-伊紅染色，制成切片，在顯微鏡下觀察胰腺的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗重復(fù)3 次，得到的測試數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，通過Microsoft Excel 2003和SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

圖 1 各組小鼠體質(zhì)量及攝食量的變化Fig. 1 Changes in body mass and food intake of mice in each group

由圖1A可知，0 周時，低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型組明顯低于非糖尿病組小鼠體質(zhì)量。經(jīng)灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維后，1～4 周實驗期間內(nèi)，糖尿病組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，空白組、陽性藥物組和可溶性膳食纖維組小鼠的體質(zhì)量隨著時間的延長，呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，相較于0 周時，4 周實驗后，分別增長了9.58%、7.84%和6.95%。由圖1B可知，0 周時，低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型組明顯高于非糖尿病組小鼠攝食量。經(jīng)灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維后，1～4 周實驗期間內(nèi)，空白組和糖尿病組小鼠攝食量持續(xù)上升，陽性藥物組和可溶性膳食纖維組小鼠的攝食量隨著時間的延長，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。該結(jié)果說明黑豆皮可溶性膳食纖維可以有效改善糖尿病小鼠的體質(zhì)量和攝食量。

2.2 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠血糖濃度的影響

圖 2 各組小鼠空腹血糖濃度變化Fig. 2 Change in blood glucose concentration of mice in each group

由圖2可知，在0 周時，空白組與低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的空腹血糖濃度有顯著性差異（P＜0.05），但糖尿病小鼠各組間空腹血糖濃度均沒有顯著差異。在1～4 周實驗期間的每個時間段，相較于糖尿病模型組，陽性藥物組和可溶性膳食纖維組小鼠的空腹血糖濃度顯著降低（P＜0.05），但陽性藥物組與可溶性膳食纖維組無顯著差異。該結(jié)果表明，黑豆皮可溶性膳食纖維可顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖濃度。

2.3 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠INS水平的影響

圖 3 各組小鼠INS水平變化Fig. 3 Changes in insulin concentration of mice in each group

由圖3可知，與空白組相比，糖尿病模型組小鼠血清INS水平增加了71.28%（P＜0.05）;相較于糖尿病模型組，灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維組小鼠血清INS水平分別降低了29.52%（P＜0.05）和11.10%，且可溶性膳食纖維組與陽性藥物組小鼠血清INS水平?jīng)]有顯著性差異。說明黑豆皮可溶性膳食纖維可降低糖尿病小鼠的INS水平。據(jù)調(diào)查研究結(jié)果表明，糖尿病INS水平與INS敏感性呈負(fù)相關(guān)，即當(dāng)INS水平較低時，INS敏感性較高[18]。富含膳食纖維的谷物、果皮類可以有效地改善糖尿病小鼠INS敏感性[19]。本研究表明，改性黑豆皮SDF可以有效地提高糖尿病小鼠INS敏感性，對II型糖尿病有一定的緩解作用，與上述學(xué)者研究結(jié)果相一致。

2.4 黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠抗炎因子水平的影響

圖 4 各組小鼠血清TNF-α（A）、IL-4（B）和CRP（C）水平的變化Fig. 4 Changes in serum TNF-α (A), IL-4 (B) and CRP (C) levels in mice in each group

由圖4可知，糖尿病模型組小鼠相較于空白組，TNF-α和CRP質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），IL-4質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）。灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維組小鼠相較于模型組小鼠的TNF-α質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），且陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠的TNF-α質(zhì)量濃度存在顯著差異（P＜0.05）;陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠相較于模型組小鼠的IL-4質(zhì)量濃度顯著提高（P＜0.05），且陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠的TNF-α質(zhì)量濃度存在顯著差異（P＜0.05）;陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠相較于模型組小鼠的CRP質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），且陽性藥物和可溶性膳食纖維組小鼠的TNF-α質(zhì)量濃度存在顯著差異（P＜0.05）。

2.5 糖尿病小鼠胰腺組織病理學(xué)觀察與分析結(jié)果

圖 5 各組小鼠胰腺病理組織切片F(xiàn)ig. 5 Pathological sections of pancreatic tissue of mice in each group

由圖5可知，空白組小鼠的胰島呈橢圓形或近似圓形，面積較大、結(jié)構(gòu)完整，β細(xì)胞分布規(guī)則、大小均勻、排列完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)INS的分泌顆粒多，而且染色較深，未見變性，且胰島與β細(xì)胞邊界清晰可見。糖尿病模型組小鼠的胰腺重度萎縮，胰島面積重度縮小，β細(xì)胞嚴(yán)重變性，分布不均勻，排列松散，邊界不規(guī)則且模糊不清。灌胃給予二甲雙胍和可溶性膳食纖維后，糖尿病小鼠的胰腺有明顯的改善，胰島面積顯著增大，β細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，且細(xì)胞水腫變形程度改善，細(xì)胞間隙偶有炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的INS分泌顆粒增加，邊界較清晰。胰腺病理組織切片結(jié)果表明：黑豆皮可溶性膳食纖維對2型糖尿病小鼠的胰島面積和β細(xì)胞有明顯的修復(fù)能力，進(jìn)而在一定程度上增加INS的分泌量和糖原合成量，導(dǎo)致機(jī)體血糖水平降低。

3 討 論

膳食纖維作為第七大類營養(yǎng)物質(zhì)，具有不易被機(jī)體消化吸收的特點[20]，攝入可溶性膳食纖維可有效延緩和降低餐后血糖和血清INS水平的升高，維持餐后血糖水平，從而降低機(jī)體血液中葡萄糖含量，緩解2型糖尿病等癥狀[21]。

研究表明，膳食纖維具有調(diào)節(jié)餐后血糖濃度、升高血清INS水平及維持血糖平衡和穩(wěn)定等功能[25]，其中可溶性膳食纖維可以改善INS敏感性和葡萄糖耐量，從而預(yù)防和治療2型糖尿病的發(fā)生[26]。攝入黏性膳食纖維（主要是可溶性膳食纖維）有助于降低血漿膽固醇水平、調(diào)節(jié)血糖濃度和使INS水平正?；?，因此可以降低糖尿病和心腦血管疾病的發(fā)病率[16]。在機(jī)體消化道內(nèi)，可溶性膳食纖維可以減緩餐后血糖及INS反應(yīng)，從而減少饑餓感[27]，降低體質(zhì)量及血糖水平。研究表明，TNF-α、IL-4和CRP等非特異性炎癥因子與糖尿病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[28-29]。通過研究糖尿病小鼠的空腹血糖濃度和INS水平，發(fā)現(xiàn)黑豆皮可溶性膳食纖維具有較好的血糖調(diào)節(jié)功能。其原因可能為黑豆皮可溶性膳食纖維刺激了殘存β細(xì)胞分泌INS，提高了末梢組織對INS的敏感性，顯著改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，降低了對INS的需求量，有利于糖原的合成作用，從而降低血糖水平和INS水平[22-24]。TNF-α能夠介導(dǎo)INS受體使之成為INS受體的抑制劑，因此TNF-α的過度表達(dá)會介導(dǎo)INS抵抗[30]。實驗結(jié)果顯示，灌胃給予黑豆皮可溶性膳食纖維組小鼠相較于糖尿病模型組小鼠的TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。IL-4是一種人體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生的具廣泛生物活性的細(xì)胞因子，IL-4是T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，參與激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分化，在調(diào)節(jié)體液免疫中起關(guān)鍵性作用[31]。研究結(jié)果表明，相較于模型組小鼠，可溶性膳食纖維組小鼠的IL-4水平顯著升高（P＜0.05）。CRP是預(yù)測糖尿病一個指標(biāo)，機(jī)體組織在損傷和各種炎癥刺激后才產(chǎn)生，且CRP的過度表達(dá)會導(dǎo)致INS對抗[32]。研究結(jié)果表明，相較于模型組小鼠，可溶性膳食纖維組小鼠的CRP質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）。上述結(jié)果說明黑豆皮可溶性膳食纖維對糖尿病小鼠抗炎因子具有調(diào)節(jié)作用。在誘導(dǎo)糖尿病模型階段，低劑量鏈脲佐菌素多次腹腔注射對小鼠胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，使其嚴(yán)重萎縮，從而減少INS的分泌，最終使小鼠血糖水平升高，引起2型糖尿病。在攝入黑豆皮可溶性膳食纖維后，糖尿病小鼠的胰島面積和β細(xì)胞數(shù)增加，胰島和β細(xì)胞有一定程度修復(fù)。

綜上所述，黑豆皮可溶性膳食纖維具有較好的緩解糖尿病小鼠體質(zhì)量，血糖、INS水平和抗炎因子的濃度，修復(fù)受損傷的胰島組織的功能。本實驗為黑豆皮可溶性膳食纖維產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。