馬尾藻巖藻聚糖分離純化及其對小鼠黑尾血栓的效果

劉海韻，王維民，諶素華,*，呂佳桐，陳華英，廖森泰

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610）

馬尾藻屬于大型經(jīng)濟褐藻。研究表明褐藻含有巖藻聚糖[1]、褐藻多酚[2]、巖藻黃素[3]等多種生物活性成分，尤其是巖藻聚糖，具有保濕[4]、鎮(zhèn)痛[5]、抗菌[6]、抗血小板聚集[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、抗癌[10]、抗獲得性免疫缺陷綜合征[11]、抗脂肪生成[12]、保肝[13]、保護神經(jīng)[14]、治療胃潰瘍[15]及肺結(jié)核[16]、免疫調(diào)節(jié)[17]等多種功效，具有較高的開發(fā)價值。血栓是一種常見的血管疾病，血栓的形成與凝血系統(tǒng)息息相關(guān)。目前有不少關(guān)于巖藻聚糖抗血栓及抗凝血活性的報道，多集中在海帶、萱藻、裙帶菜等食用型褐藻[18-25]，對馬尾藻的研究報道甚少，廖敏等[26]通過體外溶栓實驗、小鼠肺栓塞實驗以及出血實驗對馬尾藻巖藻聚糖初級純化組分F和次級純化組分F1進行抗血栓活性評價，結(jié)果表明兩種純化組分均能降低肺栓塞模型小鼠的死亡率且顯著延長出血時間。在此基礎(chǔ)上，本實驗擬采用DEAE C-52和Sepharose CL-6B柱層析法制得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的不同巖藻聚糖組分，建立小鼠黑尾模型以探究馬尾藻巖藻聚糖對黑尾長度的抑制效果，并通過毛細(xì)管法測定凝血時間，為研究馬尾藻巖藻聚糖抗血栓活性提供進一步的實驗數(shù)據(jù)和理論支持，同時為馬尾藻資源利用及巖藻聚糖生物活性深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性KM小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，日齡21～28 d，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004，購回后自由攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

亨氏馬尾藻，采摘于廣東省湛江市硇洲島附近海域。將采摘的新鮮馬尾藻除去爛葉、黃葉、根等不可食部分，反復(fù)用自來水沖洗干凈，用烘箱在50 ℃溫度烘干后粉碎，過80 目篩，干燥后裝袋貯藏備用。

巖藻糖等7 種單糖（分析標(biāo)準(zhǔn)品）、角叉菜膠（生化試劑）、Sepharose CL-6B瓊脂糖上海源葉生物科技有限公司;DEAE C-52纖維素北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl注射液 湖南科倫制藥有限公司;阿司匹林 江蘇平光制藥有限責(zé)任公司;氯吡格雷 樂普藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UX42OH電子天平、ATY1124電子分析天平 日本島津公司;Evolution300紫外分光光度計 美國熱電公司;1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 不同馬尾藻巖藻聚糖組分的制備

初級純化組分（F）的制備：參考蔡璐[27]的方法，略有改動。將干燥的馬尾藻粉用80 ℃熱水浸提，350 W超聲輔助，磷酸鹽緩沖液將pH值調(diào)節(jié)至6.0。粗提物使用乙醇沉淀，丙酮洗去雜質(zhì)，Sevag試劑脫蛋白，最后透析除去有機溶劑，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后得到馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的粗多糖，命名為F。

次級純化組分（FD1）的制備：參考廖敏[28]的方法，將DEAE C-52纖維素依次用0.5 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L HCl溶液、0.5 mol/L NaCl溶液進行活化處理，蒸餾水反復(fù)洗滌除鹽后裝入層析柱（80 cm×2.6 cm），在距離柱口約10 cm處時停止裝柱，蒸餾水平衡24 h。將粗多糖F配制成15 mg/mL溶液，上樣量為20 mL，上樣后先用蒸餾水洗脫，流速為1 mL/min，流出的組分是中性多糖，棄去。接著用1.3 mol/L NaCl溶液洗脫，對應(yīng)洗脫出的組分命名為FD1。

次級純化組分（FS1）的制備：將Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠經(jīng)過蒸餾水反復(fù)洗滌干凈，用0.1 mol/L NaCl溶液攪拌均勻，裝入層析柱（100 cm×1.6 cm），在距離柱口約10 cm處停止裝柱，洗脫液（0.1 mol/L NaCl溶液）平衡24 h。將粗多糖F配制成3 mg/mL溶液，上樣量為10 mL，洗脫流速為1 mL/min，每2 min收集一管。苯酚硫酸法對糖洗脫峰進行跟蹤監(jiān)測，以吸光度為縱坐標(biāo)，洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，作洗脫曲線，將第一個洗脫峰對應(yīng)的組分命名為FS1。

1.3.2 馬尾藻巖藻聚糖化學(xué)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用苯酚-硫酸法[29];巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用半胱氨酸鹽酸鹽法[30];硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用氯化鋇-明膠比濁法[31];糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用咔唑比色法[32]。

1.3.3 馬尾藻巖藻聚糖單糖組成測定

HPLC條件：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18;紫外檢測波長245 nm;柱流量1 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;流動相為磷酸鹽緩沖液（pH 6.74）-乙腈（83∶17，V/V）;pH 6.74。

1.3.4 角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠黑尾實驗

小鼠分組及操作：將適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后的130 只小鼠隨機分成13 組：空白對照組、模型對照組、陽性藥物（阿司匹林和氯吡格雷）組以及巖藻聚糖硫酸酯F、FD1和FS1各3 個濃度組，每組各10 只，分別給各組小鼠做好標(biāo)記，分組情況如表1所示。每次給藥100 μL/10 gmb，連續(xù)灌胃7 d，每天一次。灌胃期間每隔2 d給小鼠稱一次體質(zhì)量。

表 1 小鼠分組及操作方式Table 1 Mouse grouping and operation procedure

試劑的配制：將阿司匹林和氯吡格雷用研缽研磨至粉末狀，參考趙偉等[33]的方法確定最終給藥量，分別稱量好后用蒸餾水配制成30 mg/kg和11 mg/kg。準(zhǔn)確稱量冷凍干燥后得到的馬尾藻巖藻聚糖F、FD1和FS1各個劑量所需的質(zhì)量后用蒸餾水溶解。角叉菜膠用生理鹽水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。注射量為100 μL/10 g。

血栓模型的制備：第7天灌胃給藥1 h后，除空白組外其他各組小鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%角叉菜膠。注射角叉菜膠后將動物置于（17±2）℃環(huán)境中，因為小鼠難以在高于20 ℃的環(huán)境下出栓。期間正常進食，之后觀察、測量和記錄小鼠注射角叉菜膠24、48、72 h后小鼠的黑尾長度[34]。

1.3.5 馬尾藻巖藻聚糖對小鼠凝血時間的影響

作為衡量藥物體內(nèi)抗凝血活性的重要指標(biāo)之一，凝血時間是指血液離開血管后在體外凝固所需的時間。

測定方法：采用毛細(xì)玻管法，待角叉菜膠注射72 h后，于室溫（15 ℃）下將除空白組外的其他組小鼠用毛細(xì)管（內(nèi)徑1 mm）于小鼠內(nèi)眥框后眼靜脈叢取血，至毛細(xì)管內(nèi)血柱達到5 cm開始計時。每隔30 s將毛細(xì)玻管折斷約5～10 mm，觀察有無血凝絲出現(xiàn)。凝血時間即從毛細(xì)玻管采血到凝血出現(xiàn)的時間[35]。凝血時間延長率按下式計算。

式中：ti為給藥組平均凝血時間/s;t0為模型對照組平均凝血時間/s。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖F Sepharose CL-6B洗脫曲線

將粗多糖F經(jīng)過Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱，苯酚-硫酸法對洗脫管數(shù)的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行跟蹤檢測，繪制的洗脫曲線如圖1所示。

圖 1 粗多糖Sepharose CL-6B洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of the crude polysaccharide F on Sepharose CL-6B column

由圖1可以看出，粗多糖F經(jīng)過柱層析后，被分離成兩個不同的組分，分離度較好，從峰面積可以看出各組分的回收率差異明顯?？紤]到后續(xù)動物實驗對原料的消耗巨大，所以只對第一個峰所對應(yīng)的管數(shù)進行合并收集，并命名為FS1。

2.2 馬尾藻巖藻聚糖化學(xué)組成分析結(jié)果

由表2可知，粗多糖F經(jīng)過DEAE C-52纖維素純化后得到的FD1多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所提高，分別上升了4.827%、16.068%、5.493%，硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高十分明顯，而巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)則下降了8.954%。F經(jīng)過Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠層析后（FS1）多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯提高，提升了15.002%，硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)和巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有提高，分別為0.556%、4.419%，而糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)則明顯地下降了19.600%。F、FD1、FS1 3 個組分經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，采用柱層析的方式進行次級純化均能提高巖藻聚糖多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即提高了純度，且瓊脂糖凝膠層析比纖維素離子交換層析的純化效果更為顯著。由于巖藻聚糖的主要成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯，所以除了純度指標(biāo)外，對于巖藻糖和硫酸基的保護/破壞效果也是評價一種巖藻聚糖純化方式是否優(yōu)良的重要指標(biāo)。DEAE C-52纖維素的純化雖然能明顯提高巖藻聚糖硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但對巖藻聚糖的巖藻糖鏈破壞較為嚴(yán)重。而Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠對硫酸基的純化效果不明顯，但對巖藻糖鏈的保護很好，巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有提升，并且能極其明顯地降低糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，綜合純化效果更好。

表 2 馬尾藻巖藻聚糖化學(xué)組成Table 2 Chemical composition of fucoidans from Sargassum

2.3 馬尾藻巖藻聚糖單糖組成分析結(jié)果

表 3 馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯各組分單糖組成Table 3 Monosaccharide composition of fucoidans from Sargassum

圖 2 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide standards

結(jié)合表3和圖2、3可以看出，3 種巖藻聚糖組分均不含阿拉伯糖。F經(jīng)過DEAE C-52纖維素層析后，F(xiàn)D1中的甘露糖、鼠李糖、木糖以及巖藻糖的比例明顯提高，而葡萄糖和半乳糖所占比例則分別下降了21.700%和8.652%。F經(jīng)過Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠純化后得到的FS1中的葡萄糖占比下降25.423%，巖藻糖占比上升23.569%。FS1與FD1相比，除了半乳糖和巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有提升以外，其余種類的單糖均有不同程度的下降。綜合分析，由于巖藻糖為巖藻聚糖的主要特征單糖，半乳糖為第二特征單糖，所以可以看出FS1是3 種巖藻聚糖中最純凈的組分。對比3 種組分的色譜圖，F(xiàn)D1的巖藻糖峰高和峰面積均小于其他2 種組分，說明FD1的巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，這和化學(xué)組成測定的結(jié)果一致。

圖 3 各巖藻聚糖組分HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatogram of three fucoidans

2.4 馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠體質(zhì)量的影響

表 4 實驗前后小鼠體質(zhì)量的變化（n＝ 10）Table 4 Changes in body mass of mice (n= 10)

由表4可以看出，在7 d的灌胃期間，各組平均體質(zhì)量一直處在增長狀態(tài)。其中，給藥各組體質(zhì)量增長都稍低于空白組和模型對照組，但差異不明顯。在實驗正式開始前，各組間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）。灌胃7 d蒸餾水、陽性藥物或馬尾藻巖藻聚糖后，各組體質(zhì)量都顯著增加（P＜0.05）。在最后一次給小鼠稱體質(zhì)量時，給藥組的小鼠體質(zhì)量與空白組、模型對照組這兩組的體質(zhì)量沒有顯著性差異，說明巖藻聚糖對小鼠的正常生長不會造成影響。

2.5 馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠黑尾長度的影響

表 5 巖藻聚糖硫酸酯對角叉菜膠引起的小鼠黑尾長度的影響（n＝10）Table 5 Effect of fucoidans on carrageenan-induced black tail length of mice (n= 10)

由表5可以看出，注射角叉菜膠后，各組小鼠的黑尾長度隨時間延長略有增加，高劑量FD1組的小鼠黑尾長度略有縮短，但縮短的程度不明顯。從表5中明顯可以看出注射角叉菜膠后的24、48 h和72 h不同組分的馬尾藻巖藻聚糖各劑量組的小鼠黑尾長度均短于模型對照組，說明馬尾藻巖藻聚糖可以抑制小鼠體內(nèi)血栓的形成并有預(yù)防作用。純化后的FD1和FS1抑制小鼠血栓的效果均比粗多糖顯著（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)S1抑制血栓的效果優(yōu)于FD1，但差異不明顯。其中，F(xiàn)各劑量組的結(jié)果表明：隨著劑量的增加，小鼠黑尾的長度有所縮短，表現(xiàn)出劑量依賴性，但無統(tǒng)計意義（P＞0.05）;FD1各組中，高劑量FD1組抑制效果極顯著（P＜0.01）;而FS1各劑量組抑制效果都極顯著（P＜0.01），其中，低劑量組的抑制效果最佳。另外陽性藥物組中的氯吡格雷極顯著地縮短了小鼠的黑尾長度，而阿司匹林抑制血栓的效果不明顯。FD1和FS1抗血栓的作用較粗多糖F的強，可能與其純度更高有關(guān)。

2.6 馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯對小鼠凝血時間的影響

表 6 巖藻聚糖硫酸酯對小鼠凝血時間的影響（n＝ 10）Table 6 Effect of fucoidans on coagulation time of mice (n= 10)

由表6可以看出，與模型對照組相比較，不同組分的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯各劑量組均可延長小鼠的凝血時間。粗多糖F各劑量組和FD1各劑量組凝血時間呈現(xiàn)劑量依賴性，但粗多糖F低、中劑量組與模型對照組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而FD1和FS1各劑量組與模型對照組間有極顯著差異（P＜0.01），延長凝血時間的效果FS1＞FD1＞F（P＜0.01）。模型對照組的凝血時間為（250.50±15.41）s，阿司匹林組，氯吡格雷組，F(xiàn)低、中、高劑量組，F(xiàn)D1低、中、高劑量組，F(xiàn)S1低、中、高劑量組（15、30、60 mg/kgmb）的凝血時間延長率分別為12.77%、42.12%、7.58%、15.37%、27.25%、32.29%、48.75%、51.20%、57.19%、76.00%、72.60%。阿司匹林和氯吡格雷這兩種藥物的作用原理都是抗血小板聚集，它們都使血液不易凝固。雖然說氯吡格雷的安全性跟阿司匹林的類似，但其效力高于阿司匹林的。而馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯可以延長小鼠的凝血時間，可能與影響凝血系統(tǒng)有關(guān)。

3 討 論

本研究采用DEAE C-52纖維素和Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠對粗多糖F進行進一步純化，與廖敏等[26]所制備的巖藻聚糖純化組分相比，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有較大幅度的提升，所占比均超過60%，最純凈的FS11甚至達到了近79%。

胡三覺等[36]開發(fā)出的角叉菜膠誘導(dǎo)鼠尾部血栓模型，是利用其致炎作用而使機體產(chǎn)生血栓，該模型制備方法簡單易操作，所需用到的造模試劑（角叉菜膠）也容易購買，造模時在適宜的環(huán)境下即可實現(xiàn)較高的成功率。相對來說，這一模型對動物自身傷害不大，因為造模過程中動物不會被殺害。由于小鼠尾部是單血管供血，血栓會出現(xiàn)在尾部，這利于操作者的觀察和測量，也便于動態(tài)觀察血栓的形成過程。由于該實驗需要小鼠尾部產(chǎn)生血栓，而低溫環(huán)境會引起血管收縮，即更容易出栓;但是，過低的溫度會給小鼠健康帶來危害，以至于嚴(yán)重影響實驗結(jié)果，所以，對溫度的調(diào)控是本實驗的核心問題之一。一般鼠尾血栓模型采用皮下注射[37-40]角叉菜膠的方式造模，但小鼠的皮膚很薄，稍微用力即可刺穿，所以皮下注射具有一定的技術(shù)難度。本實驗參考劉彥霞等[41]的研究，采用相對容易的腹腔注射進行造模，取得了良好效果。研究凝血時間的過程中，最初采用的是摘眼球取血挑絲的方法，但在實驗中發(fā)現(xiàn)此法弊端較多。一是摘眼球容易產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，造成血液無法凝固而產(chǎn)生實驗誤差;二是摘眼球會致死小鼠，死亡的小鼠血流速變慢，易造成出血不足的現(xiàn)象，使實驗進展受阻。所以，參考武桂娟等[35]的研究，在后續(xù)的實驗中變更為毛細(xì)管法眼眶靜脈叢取血，避免了各種問題。

綜上，雖然有相關(guān)研究報道了巖藻聚糖的生物活性與硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，且FD1的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于FS1，但動物實驗卻表明FD1的活性卻弱于FS1的，究其原因，除了FD1純度沒有FS1高以外，也可能與巖藻糖和硫酸基比例有關(guān)。FD1的巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，所以很可能其所含硫酸基很大一部分并未與巖藻糖結(jié)合形成L-巖藻糖-4-硫酸酯，而FS1雖然硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)并不是特別高，但巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)突出，可能結(jié)合形成的L-巖藻糖-4-硫酸酯總量是要高于FD1的，所以導(dǎo)致FS1表現(xiàn)出更好的活性。

本研究探究了馬尾藻巖藻聚糖對小鼠尾血栓的抑制活性，并進行了凝血實驗，結(jié)果具有一定的成效，但要對馬尾藻巖藻聚糖抗血栓活性下定論還為時尚早，需要進行更多諸如頸動脈血栓模型、下腔靜脈模型、血瘀模型等一系列的血栓模型實驗共同論證，并且并不局限于動物體內(nèi)實驗，還需要從血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌情況入手，探究馬尾藻巖藻聚糖的抗血栓機制。

4 結(jié) 論

對于各組巖藻聚糖組分的攝入并不會影響小鼠的體質(zhì)量，說明巖藻聚糖是安全的。角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾血栓形成實驗結(jié)果表明，不同組分的馬尾藻巖藻聚糖各劑量組的小鼠黑尾長度均短于模型對照組，表明巖藻聚糖可以抑制小鼠體內(nèi)血栓的形成并有預(yù)防作用。且純化后的FD1和FS1抑制小鼠血栓的效果均比粗多糖F更好。通過比較F、FD1及FS1的化學(xué)組成、單糖組成及抗血栓效果，可以推測巖藻聚糖的抗血栓活性與其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)和單糖組成情況有密切關(guān)聯(lián)。多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和特征單糖（巖藻糖）的占比共同反映了巖藻聚糖組分的純度，而巖藻糖和硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與比例則影響巖藻聚糖組分的活性。本研究結(jié)果表明巖藻聚糖能夠有效縮短角叉菜膠引起小鼠尾部血栓的長度和延長凝血時間，且純化組分FD1和FS1抗血栓效果優(yōu)于粗多糖F，F(xiàn)S1為最佳組分。