自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑、轉(zhuǎn)化生長因子β1表達情況及其與室性心律失常易感性的關系研究

梁宇明，何燕

骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI）是一種廣泛存在于心肌細胞的跨膜蛋白，可參與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達。既往研究表明，BAMBI可負反饋調(diào)節(jié)TGF-β信號通路，下調(diào)TGF-β表達并參與與TGF-β表達密切相關的生理病理過程［1］。TGF-β是分泌型多肽信號分子，在哺乳動物中存在多種亞型，其中TGF-β1亞型功能最為強大且分布最為廣泛。既往研究表明，TGF-β可導致左心室心肌纖維化、心功能降低，進而參與左心室重構［2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，人體心臟處于壓力負荷狀態(tài)時，心臟組織BAMBI表達升高［3］。動物實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟處于壓力負荷狀態(tài)時，左心室BAMBI表達上調(diào)以對抗TGF-β1的致纖維化作用，進而抑制左心室重構，發(fā)揮心臟保護作用［3］。因此，BAMBI和TGF-β1均介導壓力負荷下左心室心肌纖維化進程，參與左心室重構，而心肌纖維化又與室性心律失常（ventricular arrhythmias，VA）的發(fā)生密切相關［4］。本研究旨在分析自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況及其與VA易感性的關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018年7月—2019年7月，選取6只14周齡雄性Wistar大鼠作為對照組，6只與Wistar大鼠同源的雄性自發(fā)性高血壓大鼠作為實驗組，兩組大鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，體質(zhì)量300～340 g。所有大鼠飼養(yǎng)至22周齡，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度15～25 ℃，每籠3～5只大鼠，以普通干飼料喂養(yǎng)，不限飲水，光照-黑暗各12 h交替進行。每日固定時間通過鼠尾測壓計檢測大鼠心率、血壓，以Wistar大鼠收縮壓≤140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓≥160 mm Hg為滿足實驗要求。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 無水乙醇和二甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司，檸檬酸（pH值為6.0）抗原修復液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液及DAB顯色試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司，BAMBI一抗、TGF-β1一抗及山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自Abcam公司，SYBR GREEN qPCR Super Mix購自Invitrogen公司，ImProm-ⅡTMReverse Transcription System、dNTP、Random Primer、M-MLV、DNAse、RNasin Ribonuclease Inhibitor購自美國Promega公司，BCA法蛋白含量檢測試劑盒、磷酸酶抑制劑購自南京凱基生物發(fā)展有限公司，蛋白預染Marker購自Thermo公司，SDS、甘油、β-巰基乙醇、過硫酸銨購自北京鼎國生物技術有限責任公司，30%丙烯酰胺溶液購自上海申能博彩生物科技有限公司，顯影粉購自天津市世紀奧博商貿(mào)有限公司。

1.2.2 主要儀器 智能無創(chuàng)血壓計購自北京軟隆生物技術有限公司（型號：BP-2010A），生物信號采集儀器購自安徽正華生物儀器設備有限公司（型號：MD3000），彩色多普勒B超儀購自意大利百勝公司（型號：MyLabSeven），脫水機（型號：JJ-12J）、包埋機（型號：JB-P5）購自武漢俊杰電子有限公司，病理切片機（型號：RM2016）購自上海徠卡儀器有限公司，脫色搖床（型號：TSY-B）、渦旋混合器（型號：MX-F）購自武漢賽維爾生物科技有限公司，免疫組化筆（型號：GT1001）購自Genetech公司，ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國愛普拜斯公司，核酸蛋白測定儀（型號：22331 Hamburg）購自德國Eppendorf公司，垂直電泳槽（型號：VE180）、轉(zhuǎn)移電泳槽（型號：VE186）購自上海天能科技有限公司，電泳儀（型號：BG-Power 600i）購自北京百晶生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 收縮壓和心率檢測方法 22周齡時采用鼠尾測壓計檢測兩組大鼠收縮壓及心率，每只大鼠在安靜狀態(tài)下檢測3次并取平均值。

1.3.2 心臟彩超檢查 兩組大鼠均于22周齡時進行心臟彩超檢查，具體操作如下：大鼠給予10%水合氯醛行腹腔注射誘導麻醉，后剔除大鼠胸壁毛，于大鼠左側(cè)胸骨旁取左心長軸和左心室乳頭肌短軸，采用彩色多普勒B超儀檢測左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）及左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.3.3 VA誘發(fā)實驗 兩組大鼠均于心臟彩超檢查完畢后進行VA誘發(fā)實驗，具體操作如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛誘導麻醉，后固定于實驗臺，四肢皮下連接Ⅱ?qū)?lián)心電圖（MD3000生物信號采集處理系統(tǒng)），之后將食管電極經(jīng)食管插入至能捕獲心室心電圖的位置，電極尾端連接生物信號采集處理系統(tǒng)，通過刺激儀發(fā)出脈沖波以起搏左心室，脈沖波電壓10 V，電流50 Hz，刺激時間60 s/次，重復兩次，需要注意的是第2次電刺激前需確認大鼠心率已恢復至正常。以VA持續(xù)時間＞2 s為VA誘發(fā)成功，VA持續(xù)時間＞30 s為持續(xù)性VA［5］。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR） 采用RT-qPCR檢測兩組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1 mRNA相對表達量，具體操作如下：每組選取3只大鼠，安樂死后立即取出心臟，剪下左心室心肌組織約100 mg，加入1 ml預冷的Trizol并在冰上充分研磨，提取總RNA，后將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并置于-20 ℃冰箱中保存待測。采用Primer 5.0設計引物并由生工生物工程（上海)股份有限公司合成引物，采用SYBR GREEN qPCR Super Mix檢測目的基因mRNA相對表達量，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s讀板，共進行40個循環(huán)；融解曲線：溫度65～95 ℃。以GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt方法計算各目的基因mRNA相對表達量，實驗重復3次并取平均值。BAMBI、TGF-β、GAPDH引物序列及大小見表1。

表1 BAMBI、TGF-β1、GAPDH引物序列及大小Table 1 Primer sequence and size of BAMBI，TGF-β1 and GAPDH

1.3.5 Western blotting 采用Western blotting檢測兩組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量，具體操作如下：每組選取3只大鼠，安樂死后立即取出心臟，將剪下的左心室心肌組織（約100 mg）剪碎并按照20 mg∶150～250 μl的比例加入裂解液，采用勻漿器勻漿直至其完全裂解。裂解后的樣品于4 ℃環(huán)境下12 000×g離心15 min，取上清液進行蛋白質(zhì)定量檢測，然后置于-80 ℃冰箱中保存。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中4 ℃過夜，分別加入一抗（1∶500稀釋的BAMBI抗體和1∶2 000稀釋的TGF-β1抗體）和1∶1 500稀釋的β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。采用TBST洗滌3次，后加入1∶1 500稀釋的山羊抗兔IgG二抗并于室溫下孵育1 h，然后采用TBST洗膜3次。將膜與ECL反應1～5 min后曝光于感光膠片上，顯影、定影。BAMBI、TGF-β1相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3.6 免疫組化染色法 將兩組大鼠安樂死后剪下的左心室心肌組織用10%中性甲醛溶液固定，然后進行常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度大約為4 μm，將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用免疫組化染色法定性觀察左心室心肌組織中BAMBI、TGF-β1表達情況，具體如下：（1）抗原修復：將組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液的修復盒中，并置于微波爐內(nèi)進行抗原修復，自然冷卻后將玻片置于PBS（pH值為7.4）中，在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次。（2）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，然后將玻片置于PBS中，在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次。（3）血清封閉：在組化圈內(nèi)滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。（4）加一抗。（5）加二抗。（6）DAB顯色：將玻片置于PBS中，在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次，切片稍甩干后在組化圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。（7）復染細胞核：蘇木素復染3 min左右，自來水沖洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流動水沖洗。（8）脫水封固。（9）顯微鏡鏡檢：圖像采集分析。（10）蘇木素復染：細胞核為藍色，BAMBI、TGF-β1陽性表達為棕黃色。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 收縮壓、心率及心臟彩超檢查結果 兩組大鼠22周齡時心率和LVEDD比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組大鼠22周齡時收縮壓高于對照組，LVESD大于對照組，LVEF和LVFS低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 VA誘發(fā)成功率 對照組大鼠22周齡時VA誘發(fā)成功率為16.7%（2/12）；實驗組大鼠22周齡時VA誘發(fā)成功率為66.7%（8/12），其中持續(xù)性VA誘發(fā)成功率為25.0%（2/8）。實驗組大鼠22周齡時VA誘發(fā)成功率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.286，P=0.038，見圖1）。

2.3 BAMBI和TGF-β1 mRNA及其相對表達量 實驗組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1 mRNA及其相對表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3、圖2）。

2.4 免疫組化染色法結果 免疫組化染色法結果顯示，BAMBI和TGF-β1主要在細胞質(zhì)中表達，且實驗組大鼠左心室心肌組織BAMBI和TGF-β1陽性表達多于對照組，見圖3。

表2 兩組大鼠22周齡時收縮壓、心率及心臟彩超檢查結果比較（± s）Table 2 Comparison of SBP，heart rate and color Doppler echocardiography examination results between the two groups at 22 weeks old

表2 兩組大鼠22周齡時收縮壓、心率及心臟彩超檢查結果比較（± s）Table 2 Comparison of SBP，heart rate and color Doppler echocardiography examination results between the two groups at 22 weeks old

注：LVEDD=左心室舒張末期內(nèi)徑，LVESD=左心室收縮末期內(nèi)徑，LVEF=左心室射血分數(shù)，LVFS=左心室短軸縮短率

組別 只數(shù) 收縮壓（mm Hg）心率（次/min）LVEDD（mm）LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）對照組 6 122±11 449±96 6.1±0.5 2.7±0.2 89.0±2.8 54.0±3.9實驗組 6 179±8 461±35 6.3±0.7 3.3±0.5 84.3±2.9 48.2±3.1 t值 10.31 0.28 0.48 2.67 -2.87 -2.88 P值 ＜0.001 0.789 0.643 0.023 0.017 0.016

表3 兩組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1 mRNA及其相對表達量比較（± s）Table 3 Comparison of BAMBI and TGF-β1 mRNA and their relative expression quantity in left ventricular myocardial tissue between the two groups at 22 weeks old

表3 兩組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1 mRNA及其相對表達量比較（± s）Table 3 Comparison of BAMBI and TGF-β1 mRNA and their relative expression quantity in left ventricular myocardial tissue between the two groups at 22 weeks old

m R N A T G F-β 1 m R N A B A M B I T G F-β 1對照組 3 1.0 0±0.0 8 1.0 0±0.0 6 1.0 0±0.0 3 1.0 0±0.0 1實驗組 3 9.2 4±0.3 9 4.2 3±0.4 8 5.3 6±0.0 4 4.0 3±0.0 3 t值 3 5.8 5 1 1.7 6 1 6 7.4 0 1 4 2.8 0 P 值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1組別 只數(shù) B A M B I

3 討論

《中國心血管病報告2015》顯示，我國高血壓患者人數(shù)高達2.7億，高血壓患者數(shù)量龐大［6］。高血壓與VA密切相關：高血壓主要通過引起血流動力學改變、神經(jīng)內(nèi)分泌因素、心室重構（如心肌纖維化）等機制而引發(fā)VA［7］；VA除引起血流動力學障礙外，還可導致高血壓患者心臟機械功能惡化，加重高血壓患者病情。因此，防治高血壓患者發(fā)生VA尤為重要，而《高血壓與心律失常2017年歐洲專家共識》曾指出，降低心肌纖維化是高血壓合并VA治療急需解決的問題之一［8］。

圖1 VA誘發(fā)實驗心電圖表現(xiàn)Figure 1 ECG performance of VA induced experiment

圖2 兩組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1電泳圖Figure 2 Electrophoretogram for BAMBI and TGF-β1 in left ventricular myocardial tissue in the two groups at 22 weeks old

目前研究表明，心臟壓力超負荷狀態(tài)下心肌組織BAMBI表達上調(diào)，并通過下調(diào)TGF-β1表達而對抗心肌纖維化，進而發(fā)生與當前血流動力負荷狀況“平衡”的穩(wěn)健重塑反應［3］。但目前BAMBI對高血壓左心室重構的影響及其與高血壓后VA的關系研究報道少見，本研究主要探討了自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況及其與VA易感性的關系，旨在為高血壓后VA的防治工作提供新的思路。

圖3 兩組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況（免疫組化染色，×400，掃描本文首頁OSID碼可見高清彩圖）Figure 3 Expressions of BAMBI and TGF-β1 in left ventricular myocardial tissue in the two groups at 22 weeks old

TGF-β是公認的器官纖維化因子，其在心臟組織中的表達水平與心肌纖維化程度呈正相關［9-10］；BAMBI作為TGF-β家族信號傳導的負調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)TGF-β在各個組織中的表達而參與調(diào)節(jié)與TGF-β相關的器官纖維化病理進程［11-13］。本研究結果顯示，實驗組大鼠22周齡時左心室心肌組織TGF-β1 mRNA及其相對表達量均高于對照組，提示22周齡自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織中TGF-β1表達上調(diào)。本研究結果還顯示，實驗組大鼠22周齡時LVESD大于對照組，LVEF和LVFS低于對照組，提示22周齡自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生心室重構及心臟收縮功能下降，分析其原因可能為22周齡自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織中TGF-β1表達上調(diào)引起左心室纖維化，進而導致心室重構及傳導系統(tǒng)障礙，與既往研究結果相一致［14-15］；但22周齡自發(fā)性高血壓大鼠LVEF、LVFS在參考范圍內(nèi)，與LEGRICE等［16］研究結果一致，分析其原因可能與22周齡自發(fā)性高血壓大鼠尚未進展到心臟功能失代償期有關。本研究結果顯示，實驗組大鼠22周齡時VA誘發(fā)成功率高于對照組，提示22周齡自發(fā)性高血壓大鼠VA易感性增加，分析其原因主要為TGF-β1表達上調(diào)增加心肌纖維化發(fā)生風險，而心肌纖維化又是VA發(fā)生的重要原因［17-19］。本研究結果還顯示，實驗組大鼠22周齡時左心室心肌組織BAMBI mRNA及其相對表達量均高于對照組，提示22周齡自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織中BAMBI表達上調(diào)，與VILLAR等［3］研究結果一致，分析其原因主要為心臟壓力負荷導致左心室心肌組織BAMBI表達上調(diào)，而BAMBI表達上調(diào)可在一定程度上對抗TGF-β1的致纖維化作用，具有心臟保護作用，因此BAMBI、TGF-β1均介導了自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌纖維化，進而參與左心室重構；但BAMBI表達上調(diào)較TGF-β1表達上調(diào)更明顯，具體原因尚需進一步探究。

綜上所述，22周齡自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌組織中BAMBI和TGF-β1表達上調(diào)可導致心肌纖維化加重、左心室重構，進而增加VA易感性，有望為高血壓患者VA防治提供新的思路；但本實驗動物數(shù)量較少，且未通過藥物或病毒干預BAMBI表達而探究BAMBI對TGF-β信號通路的影響及其與VA的關系，這仍有待進一步研究。

作者貢獻：梁宇明進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結果分析與解釋，負責撰寫論文，進行論文的修訂；何燕負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。