線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠血脂代謝和血管內(nèi)皮損傷的影響及相關(guān)機制研究

謝玉霞，姜海兵，楊潔，劉文寧，梁鋮，張靜

冠心病屬于缺血性心臟病，是指冠狀動脈粥樣硬化致使管腔狹窄或閉塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病。有研究表明，年齡、吸煙、血壓、血脂有關(guān)成分、代謝相關(guān)因子、炎性因子、基因多態(tài)性、心理因素等與冠心病發(fā)生密切相關(guān)，其中血脂異常是誘發(fā)冠心病的一個重要因素［1］。目前，臨床針對冠心病除采用擴張血管藥物對癥治療外，還需給予控制心率、血脂、血糖等病因治療。據(jù)《全球疾病負擔研究》報道，冠心病是全球人類死亡的首要原因［2］。近年臨床研究表明，多數(shù)冠心病患者伴嚴重高血脂及血管內(nèi)皮損傷，因此調(diào)節(jié)血脂、減輕血管內(nèi)皮損傷至關(guān)重要［3-4］。線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑是一種可延緩冠心病病情發(fā)展的有效藥物，其對心肌缺血及再灌注損傷具有有效的保護作用［5］。二氮嗪是一種典型的線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑，常用于冠心病的臨床治療［6-7］，但其對血脂和血管內(nèi)皮損傷影響及作用機制的報道相對較少。本研究旨在探討線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠血脂代謝和血管內(nèi)皮損傷的影響及機制，以為臨床研究提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018年8月—2019年2月，選取6周齡健康清潔級SD大鼠50只，雌雄各半，平均體質(zhì)量（180±20）g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SYXK（x-2019-00002）。50只大鼠均在新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院實驗室適應性飼養(yǎng)5 d，室溫20～23 ℃，人工光照，陰暗各12 h，自由飲食。

1.2 主要藥物、儀器 二氮嗪（上海博頓生物化工有限公司生產(chǎn)）、垂體后葉素（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）、成纖維細胞生長因子2（FGF-2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、β-actin抗體、山羊抗鼠二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；HITACH17080全自動生化分析儀（上海曼普生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 實驗方法 將50只6周齡大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。除對照組外，其他組大鼠均喂養(yǎng)高脂飼料（包含膽固醇1.0%，蛋黃粉5.0%，豬油10.0%，膽酸鈉0.5%，基礎(chǔ)飼料83.5%）6周，而后腹腔注射垂體后葉素6 U/kg，1次/d，持續(xù)3 d，進行造模。造模結(jié)束后，低、中、高劑量組大鼠分別按照二氮嗪3、5、7 mg/kg進行灌胃治療，1次/d，而對照組、模型組大鼠給予相同體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d；5組大鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.4 標本采集 治療后處死所有大鼠并采集其頸總動脈標本，以4%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蠟包埋標本后連續(xù)切片，按照以下步驟進行HE染色：將石蠟切片置入烘箱（溫度60 ℃）烤1～2 h→石蠟切片常規(guī)予以二甲苯，乙醇溶液脫蠟至水→蘇木精染10 min→流水沖洗，去余色→0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘→流水沖洗，切片變藍約15 min→95%乙醇溶液沖洗30 s→酒精性伊紅染30 s→Ⅰ 95%乙醇溶液沖洗30 s→Ⅱ 95%乙醇溶液沖洗30 s→Ⅰ 100%乙醇溶液沖洗30 s→Ⅱ100%乙醇溶液沖洗30 s→石碳酸二甲苯?jīng)_洗30 s→Ⅰ二甲苯浸泡30 s→Ⅱ二甲苯浸泡30 s→中性樹膠封固，最后置于光鏡下觀察。

1.5 觀察指標

1.5.1 血脂指標 分別于治療前后采集五組大鼠眼角靜脈叢血2 ml，室溫靜置4 h，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，利用全自動生化分析儀檢測血脂指標，包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.5.2 羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶活性 治療后摘除五組大鼠眼球并取血5 ml 3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液800 μl，而后依次加入還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）100 μl、反應緩沖液（包括0.2 mol/L KCl、0.16 mol/L K2HPO4、4 mmol/L EDTA和10 mmol/L 二硫蘇糖醇）100 μl，反應總體積為1 ml，先進行37 ℃預溫浴20 min，而后采用紫外分光光度法檢測OD340值，OD340值越高提示HMG-CoA還原酶活性越弱，反之活性越強。

1.5.3 頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量 治療后在無菌條件下取五組大鼠頸動脈組織，加入裂解液和蛋白酶抑制劑后于4 ℃勻漿后繼續(xù)裂解30 min，12 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），提取總蛋白；BCA蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對聚偏二氟乙烯（PVDF）凝膠電泳膜封閉2 h，而后以稀釋后的β-actin、FGF-2及VEGF一抗于4 ℃孵育過夜，洗膜后室溫孵育二抗1.5 h，洗膜后將PVDF膜浸入發(fā)光液，曝光并拍照，采用Western blotting法進行檢測，并使用Image J軟件對曝光結(jié)果進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠治療前血脂指標比較 治療前五組大鼠TC、TG、LDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療前五組大鼠HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療前模型組及低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 五組大鼠治療前血脂指標比較（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of blood lipid parameters in the five groups before treatment

表1 五組大鼠治療前血脂指標比較（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of blood lipid parameters in the five groups before treatment

注：TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇；與對照組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) TC TG LDL-C HDL-C對照組 10 1.34±1.13 0.61±1.10 0.19±0.91 0.55±1.21模型組 10 2.10±1.19a0.84±1.18a0.59±1.16a0.60±0.97低劑量組 10 1.98±1.24a0.83±1.11a0.60±0.92a0.58±1.16中劑量組 10 2.08±0.88a0.79±1.13a0.61±0.94a0.49±1.15高劑量組 10 2.00±0.97a0.81±1.09a0.57±1.18a0.62±0.99 F值 75.113 31.040 62.453 1.772 P值 0.001 0.018 0.001 0.211

2.2 五組大鼠治療后血脂指標比較 治療后五組大鼠TC、TG、LDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后五組大鼠HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后模型組及低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平高于對照組，低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平低于模型組，中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平低于低劑量組，高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平低于中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 五組大鼠治療后眼球血OD340值比較 治療后五組大鼠眼球血OD340值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后模型組大鼠OD340值低于對照組，中、高劑量組大鼠OD340值高于對照組，低、中、高劑量組大鼠OD340值高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.4 五組大鼠治療后頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量比較 治療后五組大鼠頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后模型組及低、中劑量組大鼠頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量高于對照組，低、中、高劑量組大鼠頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表4、圖1）。

表2 五組大鼠治療后血脂指標比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups after treatment

表2 五組大鼠治療后血脂指標比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups after treatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05

組別 只數(shù) TC TG LDL-C HDL-C對照組 10 1.41±1.08 0.70±1.13 0.17±1.01 0.54±2.18模型組 10 4.50±2.11a 3.93±1.16a 2.68±0.93a0.58±1.81低劑量組 10 3.60±0.81ab 2.98±0.63ab 1.56±1.07ab0.56±1.69中劑量組 10 2.50±1.12abc2.01±1.15abc0.89±1.10abc0.47±1.72高劑量組 10 1.90±1.04abcd1.46±0.81abcd0.46±1.08abcd0.63±2.08 F值 20.190 71.353 375.844 2.390 P值 0.034 0.011 0.001 0.120

表3 五組大鼠治療后眼球血OD340值比較（±s，mmol/L）Table 3 Comparison of eyeball blood OD340 in the five groups after treatment

表3 五組大鼠治療后眼球血OD340值比較（±s，mmol/L）Table 3 Comparison of eyeball blood OD340 in the five groups after treatment

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) O D 340值對照組 1 0 0.4 5±4.3 2模型組 1 0 0.2 4±3.6 7 a低劑量組 1 0 0.4 2±4.1 1 b中劑量組 1 0 0.6 3±4.8 7 ab高劑量組 1 0 0.7 0±3.9 8 ab F值 2 9.0 2 6 P值 0.0 1 1

表4 五組大鼠治療后頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量比較（± s，%）Table 4 Comparison of relative expression quantity of FGF-2 and VEGF of carotid vascular endothelial cells in the five groups after treatment

表4 五組大鼠治療后頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF相對表達量比較（± s，%）Table 4 Comparison of relative expression quantity of FGF-2 and VEGF of carotid vascular endothelial cells in the five groups after treatment

注：FGF-2=成纖維細胞生長因子2，VEGF=血管內(nèi)皮生長因子；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) FGF-2 VEGF對照組 10 20.63±2.12 24.57±1.13模型組 10 106.95±3.23a 100.66±2.97a低劑量組 10 68.80±2.76ab 74.93±1.68ab中劑量組 10 56.77±2.97ab 63.74±1.03ab高劑量組 10 25.56±2.46b 30.65±2.37b F值 570.478 1103.593 P值 0.024 0.011

3 討論

圖1 五組大鼠Western blotting檢測結(jié)果Figure 1 Western blotting detection results in the five groups

冠心病是指冠狀動脈粥樣硬化導致管腔狹窄或閉塞，進而出現(xiàn)心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病。研究表明，血脂異常是誘發(fā)心血管事件的危險因素，血脂指標長期升高會破壞動脈完整性，導致血管破損，若血小板及血脂長期聚集于破損處或發(fā)生鈣化，則會導致動脈管腔狹窄甚至閉塞，進而導致心臟病發(fā)生［8-9］。二氮嗪是一種線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑，現(xiàn)已廣泛用于冠心病的治療，但其對血脂和血管內(nèi)皮損傷影響的相關(guān)報道相對較少［10］。本研究通過構(gòu)建冠心病大鼠模型，探究線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠血脂代謝及血管內(nèi)皮損傷的影響及機制。

高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥與冠心病存在一定關(guān)聯(lián)［11］。高甘油三酯血癥是冠心病的獨立危險因素，LDL-C、TG、TC水平異常升高可誘發(fā)心血管斑塊形成，長期積累加之肢體活動等可進一步導致斑塊破裂，繼而發(fā)生嚴重的心血管事件［12］。HMG-CoA還原酶是人體生物合成血脂過程中的限速酶，可催化底物HMG-CoA生成甲羥戊酸，是體內(nèi)合成膽固醇的限速步驟，因此HMG-CoA還原酶活性與血脂水平密切相關(guān)，也是調(diào)節(jié)血脂藥物的重要作用靶點［13-14］。本研究結(jié)果顯示，治療前模型組和低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平高于對照組，提示冠心病大鼠造模成功。治療后模型組與低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均高于對照組，低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于模型組，中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于低劑量組，高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于中劑量組，但五組大鼠HDL-C水平間無差異，可見二氮嗪可明顯降低冠心病大鼠LDL-C、TG、TC水平，但不明顯改變HDL-C水平。另外，治療后模型組大鼠OD340值低于對照組，中、高劑量組大鼠OD340值高于對照組，低、中、高劑量組大鼠OD340值高于模型組，表明該藥物可通過抑制HMGCoA還原酶活性達到降血脂的作用。

在血管形成過程中，有諸多血管生長因子如FGF-2、VEGF參與調(diào)節(jié)。FGF-2可刺激蛋白酶原活化因子與內(nèi)皮細胞分泌蛋白酶，導致血管基底膜降解，使細胞侵入周圍基質(zhì)，從而形成新的、具有空腔的血管。VEGF能夠特異性促進血管內(nèi)皮細胞分裂及增殖，促進血管生成，增強血管通透性，使血管內(nèi)成分滲漏，但FGF-2、VEGF過表達可導致血管內(nèi)皮破損［15-16］。本研究結(jié)果顯示，治療后低、中、高劑量組大鼠FGF-2、VEGF相對表達量低于模型組，表明二氮嗪能夠明顯降低冠心病大鼠FGF-2和VEGF表達量，提示可通過下調(diào)FGF-2和VEGF表達量達到減輕血管內(nèi)皮損傷的目的。

綜上所述，線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑可通過抑制HMG-CoA還原酶活性而改善冠心病大鼠血脂代謝，并可通過下調(diào)頸動脈血管內(nèi)皮細胞FGF-2及VEGF的表達量而減輕血管內(nèi)皮損傷，但本研究并未對FGF-2及VEGF相關(guān)信號通路中其他蛋白的表達進行研究，因此線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠的血脂及血管保護作用具體機制還需進一步探討。

作者貢獻：謝玉霞、姜海兵、楊潔進行文章的構(gòu)思與設(shè)計；謝玉霞、楊潔、劉文寧、梁鋮進行研究的實施與可行性分析；謝玉霞、梁鋮、張靜進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；楊潔、劉文寧、張靜進行結(jié)果分析與解釋；謝玉霞撰寫論文，進行論文的修訂；謝玉霞、姜海兵負責文章的質(zhì)量控制及審校；姜海兵對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。