少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響及機(jī)制研究

楊也，楊家福，鐘霞，黃銳，羅兵，瞿剛波，郝攀登，曾智江，袁俊，袁毅*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州）

0 引言

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨組織微結(jié)構(gòu)異常和骨量減少為特征，導(dǎo)致骨的脆性增加、骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)退行性變化和易發(fā)生骨折的一種全身性代謝性骨病[1]。隨著我國(guó)逐漸步入老齡化社會(huì)，骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥將會(huì)給社會(huì)、醫(yī)療系統(tǒng)及家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，骨質(zhì)疏松癥這一公共健康問(wèn)題也將受到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。破骨細(xì)胞占骨骼細(xì)胞的1%～2%，是一種由單核巨噬細(xì)胞前體分化而來(lái)的具有吞噬骨組織能力的多核巨噬細(xì)胞，也是主導(dǎo)骨吸收的關(guān)鍵細(xì)胞[3]。破骨細(xì)胞的數(shù)量和功能與骨重建的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)，因此減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞的活性和功能，是當(dāng)前預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)[4]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》中最早明確提出了“少陽(yáng)主骨”的觀(guān)點(diǎn)，《素問(wèn)·熱論》曰：“少陽(yáng)主骨”?！吧訇?yáng)主骨”可能是世界上最早認(rèn)識(shí)到骨質(zhì)疏松是一種全身性的骨骼病癥,具有非常重要的理論指導(dǎo)意義和臨床價(jià)值[5]。我院王鴻度教授基于“少陽(yáng)生骨”理論自擬出了少陽(yáng)生骨方，以“和解少陽(yáng)”為治療原則，通過(guò)體表足少陽(yáng)膽經(jīng)調(diào)控骨強(qiáng)度的生理和病理變化，從而對(duì)以骨痛和易發(fā)骨折為主要臨床表現(xiàn)的骨質(zhì)疏松癥有良好的治療作用[6]。少陽(yáng)生骨方在臨床治療骨質(zhì)疏松癥方面取得了良好的療效，但對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥的具體作用機(jī)制仍缺乏相關(guān)研究。本次實(shí)驗(yàn)將以小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Mouse leukemia cells of monocyte macrophage，Raw264.7）為研究對(duì)象，通過(guò)核因子κB 受體活化因子配體（Receptor Activator of Nuclear Factor-KB Ligand，RANKL ） 將Raw264.7細(xì)胞誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞，同時(shí)加入不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色下不同組的破骨細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目，并從基因蛋白水平上研究少陽(yáng)生骨方對(duì)Raw264.7 向破骨細(xì)胞分化的影響和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

25 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有SD 大鼠均按實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化操作流程執(zhí)行。Raw264.7 細(xì)胞系（上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 藥物與試劑高糖

DMEM 培養(yǎng)基（HyClone 公司，美國(guó)）、優(yōu)質(zhì)胎牛血清（gibco公司，美國(guó)）、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒（Solarbio公司，中國(guó)）、RANKL 誘導(dǎo)劑（Peprotech 公司，美國(guó)）、CCK-8 試劑盒（Dojindo 公司，中國(guó)）、RNA 抽提試劑盒（tiangen 公司，中國(guó) ）、NF-κB p65 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)）、Phospho-NF-κB p65 抗 體（Cell Signaling Technology 公 司，美國(guó)）、GAPDH 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)）、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） Secondary Antibody, HRP Conjugate 二抗（BOSTER 公司，美國(guó)）。

1.3 主要儀器和設(shè)備

F50 倒置生物顯微鏡攝像（Olympus，日本）、3K15 低溫高速離心機(jī)（Sigma 公司，美國(guó)）、Bio-Tek 多功能酶標(biāo)儀（Nikon 公司，日本）、熒光定量 PCR 儀(DNA Engine Opticon 2，Bio-rad，美國(guó)）等。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

將25 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠隨機(jī)分為5 個(gè)組，每組5 只，設(shè)立1 個(gè)對(duì)照組（灌胃2mL 純凈水），4 個(gè)不同劑量的含藥血清組（將少陽(yáng)生骨方溶于2mL 純凈水中，含藥濃度分別為0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL）；每天灌胃3 次，連續(xù)灌胃5d，在最后一次灌胃后，將大鼠麻醉滿(mǎn)意并行腹主動(dòng)脈取血，制作4 組含藥血清、1 組無(wú)藥血清保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將Raw264.7 細(xì)胞放入含完全培養(yǎng)基（含10% Gibco 胎牛血清+100 IU/mL 雙抗+DMEM 高糖培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿中，并置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，每48h 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到約80%-90%融合度時(shí)，使用移液槍輕柔吹打皿底細(xì)胞、傳代備用。

CCK-8 細(xì)胞增殖試驗(yàn)：將Raw264.7 細(xì)胞以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，分為5 組，1 個(gè)對(duì)照組（不處理組：只加入完全培養(yǎng)基），和4 個(gè)不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清實(shí)驗(yàn)組（0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL），每組3 個(gè)復(fù)孔。在孵育箱培養(yǎng)24h、48h、72h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入10ul 的CCK-8 試劑和90ul 的完全培養(yǎng)基，并設(shè)立空白孔，只含有培養(yǎng)基和CCK-8 溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)在450nm 吸光度值并記錄結(jié)果,重復(fù)試驗(yàn)3 次。

2.3 TRAP 染色試驗(yàn)

將生長(zhǎng)良好的Raw264.7 細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于24 孔板中，加入完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞貼壁12h 后，去掉原培養(yǎng)基，加入含RANKL 的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化，并根據(jù)不同的需求分組干預(yù)：1 組對(duì)照組：50ng/mLRANKL 完全培養(yǎng)基+10%0g/mL 含藥血清；4 組實(shí)驗(yàn)組：50ng/mLRANKL 完全培養(yǎng)基+10%含藥血清（濃度0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL）。每組均設(shè)3 個(gè)平行孔。待各組細(xì)胞誘導(dǎo)至第5 d 時(shí)進(jìn)行TRAP 染色，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。觀(guān)察TRAP 染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞的形態(tài)（胞體較大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶活性部位呈紫紅色，細(xì)胞核數(shù)目≧3）。并在100 倍視野下隨機(jī)選取10 個(gè)視野，分別對(duì)5 組細(xì)胞中TRAP 染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)

將生長(zhǎng)趨勢(shì)良好的Raw264.7 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為6 組,每組3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)3d 后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞的總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-PCR 擴(kuò)增儀對(duì)cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行RTPCR 反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)基因引物序列見(jiàn)表1，使用2-△△CT法分析Ctsk、C-fos、NFATc1 的mRNA 的表達(dá)，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟3 次。

表1 CTsK、NFATcl、c-Fos 和GADPH 的引物序列

2.5 Western bolt 測(cè)定蛋白表達(dá)

將Raw264.7 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代后，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為6 組（1 組空白組、1 組對(duì)照組、4 組實(shí)驗(yàn)組）。培養(yǎng)3d 后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取6 個(gè)組細(xì)胞的蛋白，并通過(guò)BCA 法進(jìn)行蛋白定量，高溫100℃煮沸5min，使蛋白充分變性，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1h，加入一抗(1：1 000 稀釋)，4℃搖床過(guò)夜，印跡膜用TBST 緩沖液漂洗3 次后，加入二抗(1：1 000 稀釋)，置于搖床上室溫孵育1h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光并拍照；采用Image j 圖像分析軟件，對(duì)光密度積分值進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)Raw264.7 細(xì)胞增殖的影響

CCK8 檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示：培養(yǎng)第24h 時(shí)，與對(duì)照組相比，少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)各實(shí)驗(yàn)組Raw264.7 細(xì)胞增殖的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.155）；培養(yǎng)第48h 時(shí)，與對(duì)照組相比，少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)各實(shí)驗(yàn)組Raw264.7 細(xì)胞增殖的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.173）；培養(yǎng)第72h 時(shí)，與對(duì)照組相比，少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)各實(shí)驗(yàn)組Raw264.7 細(xì)胞增殖的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.070）。

圖1 不同濃度少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)Raw264.7 細(xì)胞增殖的影響

3.2 不同濃度少陽(yáng)生骨方對(duì)Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響

根據(jù)圖2 所示，5 組Raw264.7 細(xì)胞在加入50ng/mLRANKL 和不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清干預(yù)5d 后，分化形成了TRAP 染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞：破骨細(xì)胞的形態(tài)不一，有偽足和突起，細(xì)胞體積大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶活性部位呈紫紅色，且細(xì)胞核數(shù)目≧3。從圖3可知，與對(duì)照組（0g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL）相比，隨著少陽(yáng)生骨方含藥濃度的增加，各實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞的數(shù)目逐漸下降，在含藥濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。0.56g/mL 濃度的少陽(yáng)生骨方對(duì)Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的抑制作用最強(qiáng)。

圖2 不同濃度含藥血清組TRAP 染色陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞光鏡下（×100）

圖3 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組TRAP 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

3.3 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)圖4 所示，RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，加入50ng/mL RANKL 誘導(dǎo)劑后，對(duì)照組的破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因Ctsk、C-fos和NFATc1 分 別 為4.360±0.499 、3.192±0.130 、6.271±0.490，與空白組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)少陽(yáng)生骨方含藥血清濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時(shí)，Ctsk mRNA 的表達(dá)分別為3.403±0.118、2.472±0.309、1.589±0.319，與對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)少陽(yáng)生骨方含藥血清濃度為0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL時(shí)，NFATc1 mRNA 的表達(dá)分別為2.743±0.229、2.147±0.086、1.644±0.060、1.175±0.040，與對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)少陽(yáng)生骨方含藥血清濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時(shí)，C-fos mRNA 的表達(dá)分別為3.950±0.541、2.999±0.483、1.928±0.258，與對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

（空白組：0g/mL 含藥血清+0ng/mLRANKL；對(duì)照組：0g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組1：0.07g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組2：0.14g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組3：0.28g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組4：0.56g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL。C-fos:傷害性信息與即刻早期基因；Ctsk：組織蛋白酶K；NFATc1：核轉(zhuǎn)錄因子激活的T 細(xì)胞1。與空白組比較：***P＜0.001；與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。）

3.4 Western blot 法檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)圖5 所示，在使用不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清干預(yù)Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的3d 后，與空白組相比，加入50ng/mL RANKL 的對(duì)照組出現(xiàn)了NF-κB P65 蛋白磷酸化的高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（***P＜0.001）；與對(duì)照組相比，在實(shí)驗(yàn)組含藥血清濃度為0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 時(shí)，隨著濃度的增加，NF-κB P65 蛋白磷酸化水平逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（***P＜0.001）。

空白組：0g/mL 含藥血清+0ng/mLRANKL；對(duì)照組：0g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組1：0.07g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組2：0.14g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組3：0.28g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL；實(shí)驗(yàn)組4：0.56g/mL 含藥血清+50ng/mLRANKL。與空白組比較：***P＜0.001；與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

4 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折的全身代謝性骨病。骨質(zhì)疏松是人體骨重建動(dòng)態(tài)平衡失衡的結(jié)果，即破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收超過(guò)成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成所致[7]。因此當(dāng)前對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療原則為抑制破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收，以及促進(jìn)成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成。目前通過(guò)抑制破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收從而改善骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有雙磷酸鹽類(lèi)、雌激素及其受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素等[8]，但這些藥物具有價(jià)格昂貴、不良風(fēng)險(xiǎn)高等副作用，需要嚴(yán)格掌握其適應(yīng)癥及使用時(shí)間。而我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥具有價(jià)格低廉、效果較好且副作用小等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在臨床對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[9]。

我院王鴻度教授基于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“少陽(yáng)主骨”理論，在柴胡桂枝湯上加減自擬出了少陽(yáng)生骨方，具體組成為：柴胡、桂枝、法半夏、黨參、甘草、黃芩、大棗、骨碎補(bǔ)、川牛膝、山茱萸等[10]。少陽(yáng)生骨方以“少陽(yáng)主骨”為理論依據(jù)，全方旨在寒熱平調(diào)、和解少陽(yáng)、補(bǔ)腎健骨，通過(guò)多靶點(diǎn)的治療來(lái)改善骨質(zhì)疏松癥的臨床癥狀，同時(shí)具有價(jià)格低廉、毒副作用低等優(yōu)勢(shì)。課題組在前期研究中探索發(fā)現(xiàn)了少陽(yáng)生骨方能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖并向成骨細(xì)胞分化，從而改善骨質(zhì)疏松癥相關(guān)癥狀，同時(shí)發(fā)現(xiàn)少陽(yáng)生骨方促進(jìn)BMSCs 成骨分化的機(jī)制可能與上調(diào)BMP-2 和Runx2 mRNA 和蛋白的表達(dá)有關(guān)[11]。但對(duì)于破骨細(xì)胞的作用及機(jī)制研究尚不明確，因此本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)RANKL 誘導(dǎo)Raw264.7 細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞，探索不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞增殖分化的影響和作用機(jī)制。

Raw264.7 細(xì)胞是小鼠源性的單核巨噬細(xì)胞，也是破骨前體細(xì)胞的一種，通過(guò)RANKL 誘導(dǎo)Raw264.7 細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞是目前體外研究破骨細(xì)胞最常用的培養(yǎng)方法[12]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK8法發(fā)現(xiàn)不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清對(duì)Raw264.7 細(xì)胞增殖的影響無(wú)明顯差異，表明少陽(yáng)生骨方對(duì)Raw264.7 細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，可以將0.07、0.14、0.28、0.56g/mL 的藥物濃度選為本實(shí)驗(yàn)少陽(yáng)生骨方含藥血清的藥物干預(yù)濃度。當(dāng)RANKL 誘導(dǎo)劑與破骨前體細(xì)胞表面的受體RANK 結(jié)合，進(jìn)一步激活NF-KB、NFAT 等下游信號(hào)通路。這些通路被激活后，破骨細(xì)胞分化的相關(guān)特異性基因如C-fos、NFATc1、Ctsk 等出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，使破骨前體細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞[13,14]。本次實(shí)驗(yàn)在RANKL 誘導(dǎo)Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的第5 天，通過(guò)TRAP 染色觀(guān)察不同組破骨細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目，發(fā)現(xiàn)隨著少陽(yáng)生骨方藥物濃度的增加，TRAP 染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)目呈藥物依賴(lài)性降低。說(shuō)明少陽(yáng)生骨方能抑制破骨細(xì)胞的增殖，減少破骨細(xì)胞的生成。Ctsk 即組織蛋白酶K，是破骨細(xì)胞作用中最主要的酶，Ctsk 可以通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞的凋亡控制破骨細(xì)胞數(shù)量，在骨吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。C-fos 基因與NFATc1 是破骨細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，C-fos 基因通過(guò)激活下游因子NFATc1 促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，二者都是破骨細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中至關(guān)重要的一部分[16,17]。本次實(shí)驗(yàn)中，RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，加入RANKL 的對(duì)照組Ctsk、C-fos、NFATc1的mRNA 呈現(xiàn)高表達(dá)。而與對(duì)照組相比，不同濃度的少陽(yáng)生骨方含藥血清組Ctsk、C-fos、NFATc1mRNA 的表達(dá)，隨著濃度的增加呈濃度依賴(lài)性下降。說(shuō)明少陽(yáng)生骨方能抑制破骨細(xì)胞相關(guān)特異性基因Ctsk、C-fos、NFATc1 mRNA 的表達(dá)。

圖4 RT-PCR 比較不同組破骨細(xì)胞分化標(biāo)志性基因表達(dá)情況

圖5 Western blot 比較各組細(xì)胞NF-κBp65 蛋白磷酸化的水平

NF-κB 是一種存在于細(xì)胞當(dāng)中的至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與慢性炎癥的調(diào)節(jié)過(guò)程，同時(shí)也對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能起著重要的作用。當(dāng)RANKL 刺激NF-κB 活化后，IkB 激酶（IKK）復(fù)合物被激活，其中IKKβ 將IkB 磷酸化，使得IkB 被泛素化降解。IkB 被降解后，釋放的NF-κB p65 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與DNA 上的相關(guān)位點(diǎn)相結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞的形成和分化[18,19]。相關(guān)研究證實(shí)，通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)，可以抑制破骨細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松癥狀[20]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot 法檢測(cè)不同濃度少陽(yáng)生骨方對(duì)破骨細(xì)胞NF-KBP65 蛋白磷酸化水平表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)少陽(yáng)生骨方含藥血清能抑制破骨細(xì)胞 NF-κB p65 蛋白磷酸化。說(shuō)明少陽(yáng)生骨方抑制Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的能力與抑制NFκB p65 蛋白磷酸化有關(guān)。

綜上所述，少陽(yáng)生骨方能抑制Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，當(dāng)少陽(yáng)生骨方含藥血清濃度為0.56g/mL 時(shí)，抑制作用最強(qiáng)。并且少陽(yáng)生骨方抑制Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化與對(duì)NFκB p65 蛋白磷酸化的抑制相關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)從基因蛋白層面證實(shí)了少陽(yáng)生骨方能抑制破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收，改善骨質(zhì)疏松癥狀，為少陽(yáng)生骨方治療骨質(zhì)疏松癥提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)資料。