玉米肽Tyr-Phe-Cys-Leu-Thr對(duì)酒精性HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

于亞莉 宋雪梅 關(guān) 玉 王 瑩 張 婷 劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室 長(zhǎng)春130062）

酒是人類生活中的飲料之一，中國(guó)制酒歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。中國(guó)不僅是是世界三大酒系的發(fā)源地之一，而且也是世界上最早釀造酒的國(guó)家之一[1]。酒滲透于整個(gè)中華五千年的文明史中，從文學(xué)藝術(shù)創(chuàng)作、文化娛樂(lè)到飲食烹飪、養(yǎng)生保健等各方面，在中國(guó)人生活中都占有重要的位置。然而，過(guò)量飲酒不僅導(dǎo)致酒精依賴，還會(huì)增加人們患病的危險(xiǎn)。酒精可對(duì)人體帶來(lái)很多影響，如過(guò)量、長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致酒精性脂肪肝、肝硬化、酒精性肝炎、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)障礙等多種疾?。贿€會(huì)造成一系列社會(huì)問(wèn)題，如飲酒后造成的酒精依賴、交通事故、暴力等違法犯罪行為等[2]。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）又稱酒精性肝損傷，是因長(zhǎng)期或過(guò)量攝入酒精而導(dǎo)致的肝臟疾病，發(fā)病過(guò)程伴隨氧化應(yīng)激、脂肪積累、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理生理反應(yīng)。由于酒精性肝病與遺傳因素和外界環(huán)境因素有關(guān)，所以酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今沒(méi)有特異性且效果顯著的治療方法[3]。

玉米肽（Corn peptides，CPS）是以玉米蛋白粉為原料，經(jīng)蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵，再經(jīng)分離、超濾和層析等手段分離純化的低分子質(zhì)量的寡肽混合物，其分子質(zhì)量一般在1 000 u 左右，平均有5～7 個(gè)氨基酸[4]。玉米肽不僅能夠提供人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有特殊的生理功能特性，可以降低血脂和膽固醇，延緩衰老，抗氧化，緩解疲勞、增強(qiáng)記憶力等[5]，受到消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。目前，玉米肽作為功能因子已被添加到多種食品中，其加工制品具有很大的市場(chǎng)前景。日本研究者Yamaguchi最先在玉米醒酒肽方面做研究，首先采用堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉，獲得具有醒酒作用的玉米肽，其次比較玉米肽、小麥肽和豌豆肽的醒酒效果，得到的結(jié)果是玉米肽的醒酒效果最好，其通過(guò)提高血液中的丙氨酸（Ala）和亮氨酸（Leu）濃度，降低血液中的乙醇濃度[6]。大量研究表明，玉米肽在神經(jīng)系統(tǒng)、血管疾病、腫瘤等多方面有顯著療效，并且可應(yīng)用于臨床治療中[7-8]。在肝臟保護(hù)方面，將玉米肽應(yīng)用于大量動(dòng)物及臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明玉米肽具有一定的保肝護(hù)肝作用，研究其保護(hù)機(jī)制具有重要作用。

前人在玉米肽的護(hù)肝活性上開(kāi)展了大量研究，然而關(guān)于玉米肽對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。本文以從玉米蛋白粉中鑒定得到的玉米肽Tyr-Phe-Cys-Leu-Thr（YFCLT）為研究對(duì)象，從氧化應(yīng)激與脂質(zhì)代謝兩個(gè)方面研究對(duì)HepG2 細(xì)胞酒精性損傷的保護(hù)作用機(jī)制，以期為玉米肽的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米肽Tyr-Phe-Cys-Leu-Thr（YFCLT），吉爾生物有限公司；二苯代苦味肼基（DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、熒光素鈉、AAPH，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST/GPT）測(cè)定試劑盒、甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)定試劑盒、人腫瘤壞死因子ELISA 測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；活性氧檢測(cè)試劑盒（ROS）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6/12/96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning 公司；BioTek Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；HF-90 型CO2恒溫培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；TS100 倒置顯微鏡、Ti 熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 體外抗氧化能力的測(cè)定

1.3.1.1 DPPH 自由基清除活性的測(cè)定 于96 孔板中，每孔加入160 μL 125 μmol/L DPPH 溶液，40 μL 不同濃度的樣品溶液。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，室溫避光靜置反應(yīng)30 min 后，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度值[9]。DPPH 自由基清除率的計(jì)算公式：

式中：A1——試驗(yàn)組的吸光度；A2——對(duì)照組的吸光度；A3——空白組吸光度。

1.3.1.2 ABTS 自由基清除活性的測(cè)定 每孔加入180 μL ABTS 工作液，20 μL 不同濃度的樣品溶液。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，室溫避光靜置反應(yīng)30 min 后，在734 nm 處測(cè)定其吸光度值[10]。ABTS 自由基清除率的計(jì)算公式：

式中：A1——試驗(yàn)組吸光度；A2——對(duì)照組吸光度；A3——空白組吸光度。

1.3.1.3 Fe2+螯合能力的測(cè)定 將試驗(yàn)分為兩組，于96 孔板中進(jìn)行。試驗(yàn)組每孔加入2 mmol/L FeCl2溶液50 μL，加入50 μL 樣品溶液或EDTA溶液，靜置反應(yīng)30 min，加入5 mmol/L 菲洛嗪溶液100 μL，室溫避光靜置反應(yīng)10 min，在波長(zhǎng)562 nm 處測(cè)定其吸光度值，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔[11]。亞鐵離子螯合率計(jì)算公式：

式中：A1——對(duì)照組的吸光度；A0——試驗(yàn)組的吸光度。

1.3.1.4 氧自由基吸收能力（ORAC）的測(cè)定 取120 μL 熒光素鈉工作液和20 μL 樣品溶液至黑色96 孔板中混合，在37 ℃下預(yù)熱2 min。加入60 μL AAPH 溶液，立即將黑色96 孔板放入酶標(biāo)儀中，在37 ℃下檢測(cè)。設(shè)置酶標(biāo)儀熒光激發(fā)波長(zhǎng)為（485±20）nm，發(fā)射波長(zhǎng)為（528±20）nm，相鄰兩個(gè)測(cè)定的時(shí)間間隔為2 min，測(cè)定前振板2 s，連續(xù)測(cè)定180 min[12]。

相對(duì)熒光強(qiáng)度的計(jì)算公式：

式中，n——測(cè)定的第n 分鐘；fn——第n 個(gè)測(cè)定時(shí)間的相對(duì)熒光強(qiáng)度；f0——時(shí)間點(diǎn)為0 時(shí)的熒光強(qiáng)度。

1.3.2 建立HepG2 肝細(xì)胞酒精損傷模型 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的含量為1.5×105個(gè)/mL，將細(xì)胞均勻鋪滿96 孔底，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h 后，加入不同濃度的無(wú)水乙醇溶液，置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)結(jié)束后，采用MTS 法每孔加入20 μL MTS 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定每孔的吸光度值[13]。

1.3.3 YFCLT 對(duì)酒精性損傷模型細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的作用

1.3.3.1 細(xì)胞AST、ALT 的泄漏量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，每孔加入1 mL 細(xì)胞懸液于12 孔培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h，加入無(wú)水乙醇溶液200 μL，孵育2 h，再加入玉米肽溶液200 μL，孵育24 h。收集培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各上清液中ALT、AST 活力值。

1.3.3.2 細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH 的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)/mL，每孔加入2 mL 細(xì)胞懸液于6 孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液清洗3 次。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，收集細(xì)胞懸液，5 000 r/min 離心3 min，棄清液，加入200 μL 細(xì)胞裂解液（V細(xì)胞裂解液∶VPMSF=9∶1），在冰上靜置使其裂解約30 min。在事先預(yù)冷的4 ℃高速冷凍離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)速為14 000 r/min。吸取離心后的上清液用于測(cè)定HepG2 細(xì)胞中抗氧化酶SOD、CAT、GSH 的活力值[14]。計(jì)算公式如下：

式中：A1——對(duì)照組的吸光度；A2——試驗(yàn)組的吸光度；b——反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)；c——樣品蛋白的質(zhì)量濃度（mg 蛋白/mL）。

式中：A1——對(duì)照組的吸光度；A2——試驗(yàn)組的吸光度；V——樣品消耗體積（mL）；c——樣品蛋白質(zhì)量濃度（mg 蛋白/mL）。

式中：A0——對(duì)照組的吸光度；A1——試驗(yàn)組的吸光度；A2——標(biāo)準(zhǔn)組的吸光度；c——樣本蛋白的質(zhì)量濃度（mg 蛋白/mL）。

1.3.3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS 的測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)、加藥與1.3.3.1 節(jié)相同。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μmol/L的DCFH-DA 工作液500 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育20 min。收集DCFH-DA 工作液，用PBS 緩沖液沖清洗。用熒光倒置顯微鏡拍照，該過(guò)程需避光。

1.3.3.4 細(xì)胞TNF-α 釋放量的測(cè)定 試驗(yàn)分組、細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板、加藥步驟同1.3.3.1 節(jié)。采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液后按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入抗體，孵育后用PBS 緩沖液洗滌，在450 nm 處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α含量。

1.3.4 YFCLT 對(duì)酒精性損傷模型細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響

1.3.4.1 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量 細(xì)胞培養(yǎng)、鋪板、加藥的方法同1.3.3.1 節(jié)。將裂解后的HepG2細(xì)胞提取液先用BCA 蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，混合液不離心，使用甘油三酯測(cè)試盒測(cè)定甘油三酯水平。甘油三酯含量的計(jì)算公式：

式中：A0——空白組的吸光度；A1——試驗(yàn)組的吸光度；A2——對(duì)照組的吸光度；2.26（mmol/L）——標(biāo)準(zhǔn)品濃度；c——試驗(yàn)組蛋白質(zhì)量濃度（mg蛋白/mL）。

1.3.4.2 細(xì)胞內(nèi)MDA 的測(cè)定 采用硫代巴比妥酸法（TBA）測(cè)定MDA 含量，試驗(yàn)分組及細(xì)胞預(yù)處理同1.3.3.1 節(jié)，以細(xì)胞裂解后離心獲得的上清液作為樣品，按照測(cè)定盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

式中：A0——對(duì)照組的吸光度；A1——試驗(yàn)組的吸光度；A2——標(biāo)準(zhǔn)組的吸光度；A3——空白組的吸光度；10——標(biāo)準(zhǔn)品濃度10nmol/mL；c——樣本蛋白質(zhì)量濃度（mg 蛋白/mL）。

1.3.4.3 細(xì)胞內(nèi)脂滴的測(cè)定 采用油紅O 染色法判斷脂滴的積累量。細(xì)胞鋪板、加藥方法同1.3.3.1節(jié)，培養(yǎng)結(jié)束后用PBS 緩沖液清洗2 遍，加入1 mL 細(xì)胞固定液固定30 min，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，吸棄固定液。每孔加入800 μL 油紅O 工作液染色10 min，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，吸棄染色液。用60%異丙醇-PBS 溶液清洗3 遍，直至洗滌液呈無(wú)色，以除去多余的染色液。在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與處理 本章所有數(shù)據(jù)均以X±SD 表示，畫(huà)圖軟件為Origin，使用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，具有顯著性差異；當(dāng)P＜0.01 時(shí)，具有極顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米肽的DPPH 自由基清除率

DPPH 作為一種穩(wěn)定自由基，在一些有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出紫色，當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑時(shí)，其顏色由紫色變淺至無(wú)色，根據(jù)吸光度的變化程度可反映該抗氧化劑清除DPPH 自由基的能力[15]。由圖1可以看出，玉米肽YFCLT 具有一定的DPPH 自由基清除活性，其濃度分別為1，10，100，1 000 μmol/L 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基清除率分別為（13.05 ± 0.82）%，（16.50 ± 0.71）%，（39.75 ±0.55%）%，（65.09 ± 0.15）%。以水溶性維生素E（Trolox）作為陽(yáng)性參照物，其濃度400 μmol/L 時(shí)DPPH 自由基清除率為（96.77±1.19）%，說(shuō)明玉米肽YFCLT 濃度1 000 μmol/L 時(shí)DPPH 自由基清除能力弱于Trolox。從肽的結(jié)構(gòu)上看，YFCLT 具有強(qiáng)DPPH 清除率可能是其氨基酸組成含有半胱氨酸（Cys），Cys 是一種含硫氨基酸，其側(cè)鏈中含有巰基（-SH）。Cys 的DPPH 清除能力為20 種氨基酸中最高的。

2.2 玉米肽的ABTS 自由基清除能力

ABTS 自由基清除法可以應(yīng)用于親脂性和親水性化合物，是評(píng)價(jià)細(xì)胞、組織、血漿等或植物提取液或各種抗氧化物溶液的抗氧化能力的重要方法[16]。由圖2可以看出，玉米肽YFCLT 具有一定的ABTS 自由基清除率，在濃度為1，10，100，1 000 μmol/L 時(shí)，其ABTS 自由基清除率分別為（19.38±0.50）%，（32.00±1.02）%，（49.00±1.94）%，（87.46±0.10）%。400 μmol/L Trolox 的ABTS 自由基清除率為（96.93±3.07）%。YFCLT 具有較高的ABTS 自由基清除能力。

圖1 玉米肽對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging activity of corn peptide

圖2 玉米肽對(duì)ABTS 自由基清除活性Fig.2 ABTS radical scavenging activity of Corn peptide

2.3 玉米肽的Fe2+螯合能力

Fe2+是生物系統(tǒng)產(chǎn)生的關(guān)鍵金屬離子，通過(guò)測(cè)定樣品對(duì)Fe2+的螯合能力反映其抗氧化能力。本試驗(yàn)以EDTA 為陽(yáng)性參照物，采用4 種濃度（1，10，100，1 000 μmol/L）的YFCLT 考察其抗氧化能力。由圖3可以看出，五肽YFCLT 在低濃度1 μmol/L 時(shí)，仍具有鰲合Fe2+的能力，為（22.78 ±0.90）%；在高濃度1 000 μmol/L 時(shí)表現(xiàn)為較高的鰲合Fe2+的能力，即（86.75±0.88）%。

2.4 玉米肽的氧自由基吸收能力

通過(guò)測(cè)定玉米肽樣品的氧自由基吸收能力（ORAC）反映其抗氧化活性，其原理是通過(guò)抑制氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，來(lái)終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。ORAC法是目前國(guó)際上評(píng)價(jià)總抗氧化能力的公認(rèn)方法，已成為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）評(píng)價(jià)食品抗氧化能力的重要標(biāo)準(zhǔn)[17]。圖4顯示：0.1 μmol/L 的玉米肽YFCLT 熒光衰退最早，在100 min 左右相對(duì)熒光強(qiáng)度接近0。與陽(yáng)性對(duì)照物10 μmol/L 的Trolox 相比，1，2，10 μmol/L 的玉米肽，分別在160，160，180 min 時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度為0，熒光衰退時(shí)間晚于10 μmol/L Trolox 的140min，說(shuō)明1，2，10 μmol/L 的玉米肽YFCLT 氧自由基吸收能力強(qiáng)于10 μmol/L 的Trolox。

圖3 玉米肽的鐵螯合能力Fig.3 Fe2+ chelating capability of corn peptide

圖4 玉米肽熒光衰退曲線Fig.4 Fluorescence decay curve of corn peptide

2.5 HepG2 肝細(xì)胞酒精損傷模型

通過(guò)MTS 法，考察不同濃度酒精、不同酒精處理時(shí)間對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明（表1），在培養(yǎng)基中加入酒精培養(yǎng)12 h 時(shí)后，當(dāng)培養(yǎng)基中酒精終濃度為10～100 mmol/L 時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率與空白組無(wú)顯著差異；酒精濃度為500 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞增殖活力降至（66.67±7.66）%（P＜0.01），表明在該濃度條件下酒精對(duì)HepG2 細(xì)胞造成損傷。在培養(yǎng)基中加入酒精培養(yǎng)24 h 后，當(dāng)培養(yǎng)基中酒精終濃度為500 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞增殖活力降至（59.61±6.07）%，與空白組相比具有顯著差異（P＜0.01），造成HepG2 細(xì)胞接近50%損傷；在培養(yǎng)基中加入酒精培養(yǎng)48 h 后，當(dāng)培養(yǎng)基中酒精終濃度為20 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞增殖活力降至（82.21±15.78）%（P＜0.01），表明當(dāng)酒精作用細(xì)胞48 h 時(shí)，即使作用濃度低也會(huì)對(duì)細(xì)胞HepG2 的增殖活力產(chǎn)生影響。HepG2 細(xì)胞酒精損傷模型建立的適宜酒精終濃度為500 mmol/L，在該濃度酒精作用HepG2 細(xì)胞24 h 條件下建立細(xì)胞酒精性損傷模型。

表1 不同濃度酒精處理不同時(shí)間的HepG2 細(xì)胞存活率Table1 Cell viability of HepG2 cells treated with different concentrations and time of alcohol

2.6 ALT、AST 的測(cè)定結(jié)果

在正常狀態(tài)下，AST、ALT 只存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜受到刺激時(shí)AST、ALT 被釋放到胞外，使培養(yǎng)液中酶活力升高，因此AST、ALT 兩個(gè)指標(biāo)的高低可以反映肝細(xì)胞的受損程度[18]。由表2可知，當(dāng)用酒精誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞后，損傷組細(xì)胞培養(yǎng)基中ALT 與AST 酶活力相對(duì)對(duì)照組顯著升高，分別達(dá)到（10.97 ± 0.34）U/L 及（25.19 ± 1.08）U/L；用不同濃度玉米源活性肽YFCLT 處理?yè)p傷模型細(xì)胞后，培養(yǎng)液中的ALT 與AST 活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)YFCLT 濃度為100 μmol/L 時(shí)，ALT 與AST 達(dá)到最低值，分別為（6.43±0.16）U/L 和（13.18±0.34）U/L，與損傷組具有顯著差異（P＜0.05）。上述結(jié)果說(shuō)明，玉米源活性肽YFCLT 對(duì)HepG2 酒精性損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)基中ALT、AST 的活力Table2 The activity of ALT and AST in cell culture medium

2.7 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的含量

超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)重要的酶類抗氧化劑，能清除超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起重要作用，SOD數(shù)值的高低反映機(jī)體清除氧自由基的能力。還原型谷胱甘肽（GSH）是機(jī)體中重要的非酶類抗氧化物，能防止血紅蛋白及其它因子受到氧化損傷，GSH 含量與機(jī)體抗氧化能力密切相關(guān)；細(xì)胞中產(chǎn)生的CAT 能在一定條件下分解H2O2，達(dá)到抗氧化的效果[19-20]。

表3 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶含量Table3 Enzyme system in cells

T-SOD 活性在加入500 mmol/L 酒精后降至（4.27 ± 0.74）U/mg 蛋白。用1 μmol/L 玉米源肽YFCLT 預(yù)處理，酶的活力均提至（8.28 ± 0.73）U/mg 蛋白，與損傷組相比具有顯著差異（P＜0.01）。經(jīng)100 μmol/L 玉米源肽YFCLT預(yù)處理，T-SOD活力達(dá)到（16.38±0.37）U/mg 蛋白，與損傷組相比具有顯著差異（P＜0.01），與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）并呈現(xiàn)劑量-依賴關(guān)系。

CAT 活性在加入酒精后降至（36.07±0.34）U/mg 蛋白，使用1～100 μmol/L 玉米源肽YFCLT預(yù)處理后，酶的活力均顯著提升并呈劑量依賴關(guān)系，與損傷組相比有顯著差異（P＜0.01）。在加入1 μmol/L YFCLT 預(yù)處理時(shí)，CAT 活性升至（23.73±1.36）U/mg 蛋白；在加入100 μmol/L 玉米源肽YFCLT 預(yù)處理時(shí)，CAT 活性升至（35.65±0.73）U/mg 蛋白，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

酒精誘導(dǎo)后損傷組的GSH 含量降至（43.23±0.44）個(gè)活力單位，加入YFCLT 預(yù)處理后，GSH 活力升高。如加入100 μmol/L 玉米源肽YFCLT 預(yù)處理時(shí)，GSH 活力升至（64.61±0.35）個(gè)活力單位，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

上述結(jié)果表明，酒精處理后損傷細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系T-SOD、CAT、GSH 含量顯著下降，加入玉米源肽YFCLT 預(yù)處理?yè)p傷細(xì)胞，各抗氧化酶含量相對(duì)損傷組顯著升高，且均呈現(xiàn)劑量-依賴關(guān)系，進(jìn)一步表明玉米肽YFCLT 能有效保護(hù)酒精性損傷的HepG2 細(xì)胞，其可能的機(jī)制是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系T-SOD、CAT、GSH 活性，從而提高細(xì)胞的抗氧化能力有關(guān)。

2.8 TNF-α 釋放量

如圖5所示，損傷組培養(yǎng)基中TNF-α 水平是空白對(duì)照組的1.71 倍，而不同濃度的玉米肽YFCLT 處理酒精性損傷細(xì)胞后，細(xì)胞釋放的TNF-α水平顯著降低，且呈劑量-濃度關(guān)系。

當(dāng)加入低濃度（1 μmol/L）的YFCLT 時(shí)，培養(yǎng)基中TNF-α 水平與損傷組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。隨著濃度的增大，當(dāng)達(dá)到50 μmol/L 時(shí)，培養(yǎng)基中TNF-α 水平顯著下降，與損傷組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，一定濃度的玉米肽YFCLT 可有效降低酒精性損傷細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中TNF-α 水平。

圖5 YFCLT 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α 的影響Fig.5 Effects of the YFCLT on TNF-α in cultured media

2.9 玉米源肽對(duì)HepG2 細(xì)胞中ROS 水平變化

活性氧（ROS）是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成，含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。ROS 的測(cè)定常用DCFA-DA 探針，其可穿過(guò)細(xì)胞膜，被催化為DCFH，然后與細(xì)胞內(nèi)的ROS 形成具有熒光強(qiáng)度的DCF，通過(guò)測(cè)定DCF 的熒光強(qiáng)度，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平[21]。

如圖6所示，熒光倒置顯微鏡照片中熒光的強(qiáng)弱反映各組內(nèi)ROS 水平的高低。對(duì)照組圖6a熒光很弱，說(shuō)明正常細(xì)胞內(nèi)ROS 含量較少，未發(fā)生活性氧的累積；損傷組細(xì)胞圖6b 與對(duì)照組圖6a 相比，熒光顯著增強(qiáng)，說(shuō)明損傷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高。加入玉米肽YFCLT 后，YFCLT 組（圖6c-6f）的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，說(shuō)明添加玉米肽YFCLT 可抑制酒精引起的HepG2 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高。

圖6 熒光倒置顯微鏡拍攝照片F(xiàn)ig.6 The figure by fluorescence inversion microscope system

2.10 HepG2 細(xì)胞內(nèi)TG、MDA 含量

丙二醛（MDA）是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，是判斷生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo)，其數(shù)值的高低反映機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的程度。酒精作用細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自由基含量升高，進(jìn)而產(chǎn)生大量的MDA。由表4可看出，酒精作用HepG2細(xì)胞后，MDA 含量、TG 含量均增加。當(dāng)不同濃度的玉米源肽YFCLT 作用酒精性損傷細(xì)胞后，細(xì)胞中的MDA 含量、TG 含量逐漸下降，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明玉米肽YFCLT 具有抑制TG 生成及脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。

表4 細(xì)胞內(nèi)MDA、TG 含量Table4 MDA and TG in cells

2.11 HepG2 細(xì)胞內(nèi)的脂滴

細(xì)胞中的脂肪主要以脂滴的形式存在于細(xì)胞胞漿中。油紅O 是一種脂溶性染料，染色后其溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)中，使脂滴呈紅色，胞內(nèi)脂肪累積量越大，染色后呈現(xiàn)的紅色越明顯，且會(huì)大片密集[22]。由油紅O 染色照片圖7可知，空白組（a）HepG2 細(xì)胞正常生長(zhǎng)，無(wú)明顯的脂滴積累；酒精誘導(dǎo)后的損傷組（圖7b）中，細(xì)胞出現(xiàn)大量的脂滴積累，存在于細(xì)胞間隙及胞內(nèi)，說(shuō)明酒精誘導(dǎo)后對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的脂肪累積。利用不同濃度的玉米肽YFCLT（1，10，50，100 μmol/L）分別作用于損傷細(xì)胞（圖7c，7d，7e，7f），可觀察到隨著YFCLT 濃度的提高，紅色脂滴密集程度下降，即脂滴逐漸減少；當(dāng)YFCLT 濃度達(dá)到100 μmol/L 時(shí)（圖7f），脂滴積累明顯少于損傷組（圖7b）。這表明一定濃度的玉米肽YFCLT 能夠有效降低損傷細(xì)胞中脂肪的累積，具有潛在抑制脂肪堆積的作用。

3 結(jié)論

圖7 油紅O 染色照片F(xiàn)ig.7 The photo of oil red O staining

玉米肽Tyr-Phe-Cys-Leu-Thr（YFCLT）具有一定的DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、鐵螯合能力和氧自由基吸收能力（ORAC），其在低濃度1 μmol/L 時(shí)仍有較強(qiáng)的清除能力，在10.0 μmol/L 時(shí)氧自由基吸收能力強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照物Trolox。通過(guò)酒精誘導(dǎo)建立的酒精性肝細(xì)胞損傷模型，當(dāng)酒精濃度為500 mmol/L 時(shí)，其細(xì)胞增殖活力與細(xì)胞形態(tài)可滿足模型細(xì)胞需求。酒精作用細(xì)胞后會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的活力，玉米肽YFCLT 預(yù)處理酒精性損傷細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px 活力下降被抑制，恢復(fù)正常水平，表明玉米肽YFCLT 具有抑制氧化應(yīng)激的作用。玉米肽YFCLT 還可降低酒精性損傷細(xì)胞的ROS 水平，以及TNF-α 的釋放，表明其通過(guò)抗炎作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免受酒精性損傷的作用。同時(shí)，玉米源肽YFCLT 能夠有效降低酒精性損傷細(xì)胞的甘油三酯含量及MDA 含量，可以減少脂肪液滴的累積。綜上，玉米肽YFCLT 在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝方面具有對(duì)肝細(xì)胞酒精性損傷的保護(hù)作用。