母乳嬰兒源乳桿菌的篩選及其免疫調(diào)節(jié)能力研究

張 娜 張 波 趙麗娜 王妙姝 康紅艷 田洪濤* 羅云波

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000 2 保定學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院 河北保定071000 3 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071000 4 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定071000 5 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083）

腸道菌群由數(shù)萬億微生物、數(shù)百萬功能基因組成，在人體發(fā)育、腸道屏障、物質(zhì)代謝、營養(yǎng)吸收等方面發(fā)揮著巨大的作用。嬰兒時期是機體腸道菌群建立的關(guān)鍵時期，最初的腸道組分可顯著影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育，甚至對健康產(chǎn)生長期影響[1]。母乳是嬰兒最理想的天然食品，可為嬰兒持續(xù)提供能夠定植于腸道的益生菌, 從而促進嬰兒腸道發(fā)育與免疫系統(tǒng)的成熟[2]。據(jù)報道[3]：中國中西部地區(qū)純母乳喂養(yǎng)率為76.8%，超過6 個月者僅為16.4%，與《中國兒童發(fā)展綱要（2011—2020）》[4]提出的0～6 個月嬰兒純母乳喂養(yǎng)率達到50%以上的要求相差甚遠。為了解決不能接受母乳喂養(yǎng)或母乳喂養(yǎng)不足嬰兒的營養(yǎng)支持問題，人們開始在配方奶中添加益生菌來模仿母乳的成分。母乳喂養(yǎng)與配方食品喂養(yǎng)嬰兒之間的顯著差別是腸道微生物，母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中微生物以雙歧桿菌（Bifidobacteria）為主，乳桿菌（Lactobacillus）次之，而在配方食品喂養(yǎng)的嬰兒糞便中，占主導(dǎo)的是擬桿菌屬（Bacteroides），約為40%[5]。母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中的雙歧桿菌和乳桿菌屬菌株可作為篩選益生菌的備選菌株。

乳桿菌屬細(xì)菌作為腸道主要益生菌之一，不僅可以增強非特異性免疫（增強吞噬功能和自然殺傷細(xì)胞活力），而且對特異性免疫（增強抗體的產(chǎn)生，增強細(xì)胞因子的表達）也發(fā)揮重要作用[6]。目前，提高機體免疫力的益生菌在國際市場上方興未艾，母乳嬰兒源具有免疫調(diào)節(jié)功能益生菌的篩選與研究也在世界范圍如火如荼地進行。例如：Plaza[7]以體外粘附腸黏液能力，對抗生素敏感性以及對膽鹽和低pH 值的耐受性為標(biāo)準(zhǔn)，從嬰兒糞便中篩選出副干酪乳桿菌CNCM I-4034 和鼠李糖乳桿菌CNCM I-4036，并通過志愿者雙盲實驗評價菌株的免疫調(diào)節(jié)能力。Pan[8]從嬰兒糞便中分離到的嗜酸乳桿菌NIT 能夠耐受低pH 值和膽鹽環(huán)境，并可在Caco-2 細(xì)胞上粘附，具有免疫調(diào)節(jié)的潛能。妥彥峰[9]通過模擬胃、腸液對HT-29 的粘附能力，與人外周血單核細(xì)胞共同培養(yǎng)，從健康嬰兒糞便中篩選出1 株具有免疫調(diào)節(jié)能力的菌株：鼠李糖乳桿菌IN1ANL。研究表明：同一種屬的益生乳酸菌，其生理功能可能差別很大[10]。菌株OR-1 和LGG 均為鼠李糖乳桿菌，OR-1 適于防治女性陰道炎，而LGG 適于緩解嬰兒濕疹。我國民族眾多，具有豐富的嬰幼兒源益生乳酸菌資源，篩選具有自主知識產(chǎn)權(quán)的嬰幼兒源益生乳酸菌優(yōu)良菌種，開發(fā)嬰幼兒益生乳酸菌新食品，勢在必行。

本研究以母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中分離出的4 株乳桿菌為出發(fā)菌株，通過體外試驗篩選具有一定抗逆性的潛在益生菌，對其免疫調(diào)節(jié)活性作初步評價，為開發(fā)模擬母乳嬰幼兒配方奶粉及其益生菌產(chǎn)品提供菌種資源與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 鼠李糖乳桿菌BF-1、植物乳桿菌BF-15、唾液乳桿菌BF-29、干酪乳桿菌BF-55 分離自母乳源嬰兒糞便，由本實驗室保藏；鼠李糖乳桿菌GG（ATCC53103），購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923，購自中科院微生物研究所。

1.1.2 細(xì)胞株 Caco-2 細(xì)胞來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)液、0.25%胰酶〔含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）〕、二甲基亞砜（DMSO）、4-甲基偶氮唑鹽（MTT）、刀豆球蛋白（ConA），北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；酵母浸出粉、蛋白胨和牛肉膏等均為分析純級。

1.2 試驗動物

昆明系6 周齡雌性小鼠，體重（20 ± 2）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.3 主要儀器和設(shè)備

酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；DL-CJ-1N 型超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HF90 型二氧化碳培養(yǎng)箱，HealForce 公司；5417R高速冷凍離心機，德國Eppendorf。

1.4 試驗方法

1.4.1 供試菌株的生理特性

1.4.1.1 菌懸液的制備 將供試菌株按1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，待菌體生長至穩(wěn)定期（16～18 h），離心（6 000 r/min，7 min，4 ℃），收集，用PBS 洗滌2 次。洗滌后的菌體懸浮于PBS中，調(diào)整菌體含量為（1～2）×109CFU/mL，備用。

1.4.1.2 菌株對人工胃液和胰液的耐受性 人工胃液和胰液參照Usman[11]的方法制備。準(zhǔn)確吸取1.0 mL 供試菌液加到9 mL 人工胃液（pH 3.0）中，于37 ℃消化3 h，然后再吸取1.0 mL 消化3 h pH 3.0 的人工含菌胃液，加到9 mL 人工腸液（pH 8.0）中，37 ℃放置4 h，分別對人工消化液處理0 h和7 h 的菌液進行活菌計數(shù)，計算存活率[12]。

1.4.1.3 供試菌株對膽鹽的耐受性 耐膽鹽基礎(chǔ)液參照J(rèn)aya Prasad[13]的方法制備。將調(diào)整好濃度的供試菌懸液以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到上述處理過的培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0，4 h 取樣，用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。計算存活率[11]。

1.4.1.4 供試菌株對Caco-2 細(xì)胞粘附能力的測定 參照熊濤等[14]的方法制備Caco-2 細(xì)胞和菌懸液，采用血球計數(shù)板計算細(xì)胞濃度，平板計數(shù)法計算黏附的細(xì)菌數(shù)，計算獲得單個細(xì)胞黏附菌株的數(shù)量。

1.4.2 供試菌株的安全性研究

1.4.2.1 藥敏性試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法[15]，按使用說明書將藥敏片均勻放在各涂布均勻的培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑。以標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923作為對照。

1.4.2.2 質(zhì)粒的提取 用質(zhì)粒小量抽提試劑盒（康為世紀(jì)）提取，將提取的質(zhì)粒進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 供試菌株體外免疫調(diào)節(jié)活性研究

1.4.3.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液及菌懸液的制備參照李艾黎等[16]的方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液及菌懸液。

1.4.3.2 供試菌株體外對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

參照李艾黎等[16]的方法，用酶標(biāo)儀在波長570 nm 處測定OD 值，計算淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）。

式中：OD1——試驗組OD 值；OD2——陰性對照組OD 值；OD3——乳酸菌OD 值；PI ＞1 時促進增殖；PI ＜1 時抑制增殖。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有試驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)處理采用Excel2003 軟件，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性（P＜0.05）分析采用SPSS17.0 軟件，多重比較采用Duncan 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的生理特性

2.1.1 菌株對人工胃液和胰液的耐受性 采取連續(xù)培養(yǎng)方式測定供試菌株對人工消化液的耐受情況，結(jié)果見表1。

表1 供試菌株對模擬消化液的耐受性Table1 The artificial digestive fluid-tolerant of the tested strains

表1可見：經(jīng)人工消化液處理7 h，供試菌株的存活率分別為（54.48±1.31）%，（59.97±7.60）%，（47.15±2.65）%，（57.39±3.62）%，其中以植物乳桿菌BF-15 的存活率最高，略低于陽性對照菌株LGG（62.76 ±4.65）%，差異不顯著（P＞0.05），表明供試菌株在較低pH（3.0）的人工胃液環(huán)境下能夠較好地存活并生長，這與Mcdonaldm 等[17]發(fā)現(xiàn)在植物乳桿菌中存在酸耐受反應(yīng)系統(tǒng)相符。

2.1.2 菌株對膽鹽的耐受性 將供試菌株于膽鹽質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中作用4 h，測定其活菌數(shù)的變化情況，結(jié)果見表2。

表2 供試菌株的耐膽鹽試驗結(jié)果Table2 Bile salt tolerance test result of the tested strains

表2可見：植物乳桿菌BF-15 的存活率高達（77.69±0.29）%，而其余供試菌株和陽性對照菌株LGG 在0.3%膽鹽含量下作用3 h 后生長完全被抑制，表明植物乳桿菌BF-15 在一定程度上可有效消除膽鹽脅迫所帶來的不利影響，在人體膽鹽生理濃度范圍保持較高的活性，較好的膽鹽耐受性。

2.1.3 菌株對細(xì)胞的黏附性能 利用Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)物對4 株乳桿菌的黏附能力進行評價，結(jié)果見表3。

表3 供試菌株對Caco-2 細(xì)胞的黏附作用Table3 Adhesion of the tested strains to Caco-2

表3所示：黏附率依次為植物乳桿菌BF-15＞鼠李糖乳桿菌LGG＞干酪乳桿菌BF-55＞唾液乳桿菌BF-1＞鼠李糖乳桿菌BF-29，其中BF-15 的黏附能力最強（7.10±0.30）CFU/cell，顯著高于陽性對照菌株LGG：（3.90±0.30）CFU/cell（P＜0.05），表明供試菌株具有腸道定植的潛力。綜合考慮2.1 節(jié)和2.2 節(jié)試驗結(jié)果，篩選具有較強抗逆性和粘附性菌株——植物乳桿菌BF-15 為候選菌株。

2.2 候選菌株的安全性

候選菌株對常用8 大類21 種抗生素的敏感性見表4，質(zhì)粒提取結(jié)果見圖1。

表4可見：受試植物乳桿菌BF-15 對氨芐西林、青霉素G、頭孢哌酮、頭孢他啶、紅霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、阿莫西林、哌拉西林、氯霉素、利福平均敏感，對苯唑西林、頭孢噻吩、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、萬古霉素均耐藥。與LGG 相比，對頭孢他啶、卡那霉素、哌拉西林表現(xiàn)出不同的耐藥性。圖1可見：植物乳桿菌BF-15 不含質(zhì)粒。由此表明BF-15 雖對部分抗生素耐受，但不含有耐藥性質(zhì)粒，具有一定的安全性。

2.3 活性和熱致死菌株體外對小鼠脾細(xì)胞的增殖作用

植物乳桿菌BF-15 和鼠李糖乳桿菌LGG 體外對小鼠脾細(xì)胞增殖作用見圖2。

表4 植物乳桿菌BF-15 和鼠李糖乳桿菌GG對常見抗生素的敏感性Table4 Sensitivity of L.plantarum BF-15 and L.rhamnosus GG to common antibiotics

圖1 BF-15 質(zhì)粒提取電泳圖Fig.1 Electrophoresis strip map of plasmid

圖2 不同種屬、劑量的活菌和熱致死乳桿菌對淋巴細(xì)胞增值指數(shù)的影響Fig.2 Effect of active/heat-killed Lactobacillus strains of different species and concentrations on lymphocyte proliferation index of spleen cells

圖2所示：對于活菌而言，菌含量為107CFU/mL 時，BF-15 和LGG 對脾淋巴細(xì)胞的增值效果與ConA 組沒有顯著差異（P＞0.05），而菌終含量為106CFU/mL 時，BF-15 和LGG 的促增殖效果顯著低于ConA 組（P＜0.05）。對于死菌而言，在菌含量為107CFU/mL 時，BF-15 和LGG 對脾細(xì)胞的增值效果低于ConA 組，差異不顯著（P＞0.05）；在菌含量為106CFU/mL 時，BF-15 對脾細(xì)胞的增值效果顯著低于ConA 組（P＜0.05）。無論活菌還是死菌，在相同菌濃條件下，BF-15 和LGG 的促增殖效果沒有顯著差異（P＞0.05），表明植物乳桿菌BF-15或其代謝產(chǎn)物對小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用有促進效果，具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。

3 討論

益生乳酸菌除經(jīng)胃消化外，還須經(jīng)小腸消化轉(zhuǎn)運才能到達目的地，定殖并發(fā)揮益生作用。對腸道上皮細(xì)胞的黏附作用有助于其在腸道定植，增強與腸道細(xì)胞之間的信號交流和提高機體的免疫力[18]。對消化液和膽鹽的耐受及其黏附能力是評價能否作為益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)[19]。Crociaco[20]研究發(fā)現(xiàn)不同雙歧桿菌在體外對Caco-2 細(xì)胞的黏附能力與其體內(nèi)黏附腸上皮細(xì)胞能力基本保持一致，從而明確了應(yīng)用Caco-2 細(xì)胞作為體外模型評價益生菌黏附性能的有效性。張莉等[21]從健康嬰兒糞便中分離的植物乳桿菌FA6，在pH 2.5 條件下存活率在70%以上，在0.3%膽鹽中的存活率在90%以上，而對Caco-2 細(xì)胞的黏附率僅2%，即2 CFU/cell。李曉穎[22]從嬰兒源分離的植物乳桿菌PBIL1-018 和PBIL1-027，在pH 3.0 人工消化液的存活率分別為95.83%和97.03%，在0.3%膽鹽中的存活率分別為21.17%和51.20%。與之相比，本研究從嬰兒源乳桿菌中篩選出的植物乳桿菌BF-15 具有較強綜合性能，在pH 3.0 人工消化液中存活率為59.97%，0.3%膽鹽中存活率為77.69%，對Caco-2 細(xì)胞的黏附率為7.10 CFU/cell，高于陽性對照菌株LGG。Argyri 等[23]認(rèn)為通過模擬胃、腸道條件對乳桿菌進行體外篩選，只能預(yù)測菌株在無食物保護條件下的體內(nèi)存活狀況，與菌株在機體腸道中的真實存活能力存在一定偏差。在實際應(yīng)用中，菌株的抗逆性還需通過體內(nèi)試驗來進一步驗證。

益生菌安全性評價指導(dǎo)原則將益生菌的耐藥性評價放在首位[24]。K-B 紙片擴散法因操作簡單、耗時短、成本小等優(yōu)點而成為目前應(yīng)用最廣泛的藥敏測定方法。據(jù)報道乳酸桿菌對萬古霉素、氨基糖苷類、糖肽類抗生素為固有耐藥[25～26]，而固有耐藥是由細(xì)菌染色體上的抗性基因操控著天然耐藥性狀是否表達，一般不具有傳遞性。本研究中植物乳桿菌BF-15 除具備固有耐藥性外，還對苯唑西林、頭孢噻吩有耐藥性，與李平蘭[27]報道的植物乳桿菌除對氨基糖苷類耐受/中度敏感外，還對苯唑西林耐受，對頭孢噻吩中度敏感相似。同時BF-15中不存在抗性質(zhì)粒，即不存在耐藥因子傳遞的危險，具備一定的安全性和潛在的應(yīng)用價值。

目前，常采用動物實驗方法篩選具有免疫活性的乳酸菌，因其周期長、耗費大、效率低，故實際應(yīng)用受到極大限制。細(xì)胞模型也是快速篩選功能性成分的重要方法之一。淋巴細(xì)胞是機體最重要的免疫細(xì)胞，可在許多非特異性物質(zhì)（包括菌體成分）的刺激下發(fā)生轉(zhuǎn)化、增殖或產(chǎn)生某些生物活性物質(zhì)（如細(xì)胞因子）等，通過檢測這些刺激效應(yīng)，篩選出具有直接刺激效應(yīng)的免疫活性物質(zhì)[28]。2010年李艾黎[16]通過體外評估7 種乳桿菌的免疫作用，在國內(nèi)首次證明正常離體小鼠脾臟淋巴細(xì)胞可用于體外初步篩選具有潛在免疫活性的乳桿菌。本研究參照李艾黎[16]的方法對植物乳桿菌BF-15 進行體外免疫評價，結(jié)果與其一致，即：活性和熱致死乳桿菌對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖均有不同程度的影響，活菌制劑的免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于熱致死菌體制劑（P＜0.05），并且在相同劑量條件下，與陽性對照菌株LGG 沒有顯著性差異（P＞0.05），表明植物乳桿菌BF-15 具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

本文通過體外試驗對母乳嬰兒源乳桿菌的生物學(xué)特性、安全性及免疫活性進行評價，最終篩選出1 株具有潛在免疫調(diào)節(jié)功能的菌株——植物乳桿菌BF-15。該菌株具備順利通過嬰兒胃、腸道并在腸道中定殖、繁殖及免疫調(diào)節(jié)的潛質(zhì)，可緩解因配方奶粉喂養(yǎng)而導(dǎo)致的嬰兒腸道內(nèi)乳桿菌數(shù)量衰減及免疫功能低下的癥狀，為今后開發(fā)用于嬰幼兒/免疫低下人群的益生菌產(chǎn)品提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。體外實驗雖然影響因素小，可控性好，效率高，但是是否能夠真正模擬體內(nèi)環(huán)境，還需設(shè)計體內(nèi)實驗加以印證。