腫瘤微環(huán)境促進子宮內(nèi)膜癌細胞分泌雌激素

車 祺， 劉素英， 董 曦

復旦大學附屬中山醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200032

子宮內(nèi)膜癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率在發(fā)達國家占女性惡性腫瘤的第4位，在發(fā)展中國家占女性惡性腫瘤的第7位，且近年來呈持續(xù)上升趨勢[1]。子宮內(nèi)膜癌的高發(fā)病率及高死亡率嚴重危害婦女健康及生存質(zhì)量，早期診斷及有效治療至關重要[2]。

已有研究[3-4]證實，子宮內(nèi)膜癌組織中雌激素的濃度高于正常組織，說明雌激素不僅能以傳統(tǒng)的內(nèi)分泌方式作用于靶器官，還可能以局部分泌的方式，促進腫瘤的發(fā)展。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，但是其在子宮內(nèi)膜癌中的具體作用機制至今仍不清楚[5]。本研究通過子宮內(nèi)膜癌細胞與間質(zhì)細胞的共培養(yǎng)模型，研究子宮內(nèi)膜癌細胞中芳香化酶及間質(zhì)細胞中雌激素的合成關系，并篩查相關細胞因子。

1 資料與方法

1.1 子宮內(nèi)膜癌間質(zhì)細胞的提取 子宮內(nèi)膜癌組織標本來自復旦大學附屬中山醫(yī)院。無菌條件下獲取子宮內(nèi)膜癌組織，0.9%氯化鈉液洗滌，除去血塊及黏液后，剪成1 mm3左右小塊。離心后，加入0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫孵箱內(nèi)消化。分別用100目和400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾消化后的細胞懸液。

1.2 雙重免疫熒光染色鑒定間質(zhì)細胞 細胞經(jīng)甲醛固定，血清封閉后，同時用小鼠抗人波形蛋白抗體和兔抗人角蛋白抗體4℃孵育過夜；次日磷酸鹽溶液(PBS)沖洗，滴加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔 (綠色)熒光和羅丹明標記的羊抗小鼠(紅色)熒光二抗，避光放置2 h；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察染色結果。

1.3 子宮內(nèi)膜癌細胞系的選取和培養(yǎng) 選取雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性的子宮內(nèi)膜癌細胞系RL95-2(ERα和ERβ均陽性)、HEC-1A(ERα和ERβ均陽性)和HEC-1B(ERβ陽性)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)， 在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞增殖至80%時，用0.25%胰酶(含有0.02%EDTA)消化傳代，每2～3 d換液或傳代1次，觀察細胞生長情況。

1.5 細胞培養(yǎng)模式及雌激素合成檢測 24孔細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。Tanswell小室濾膜孔徑為0.4 μm，膜為聚碳酸酯膜，保證細胞之間不直接接觸，而培養(yǎng)液和可溶性因子可自由通過。共培養(yǎng)組24孔板下室中以2.3×105/L的密度接種子宮內(nèi)膜癌間質(zhì)細胞；Transwell小室中以(1～1.5)×105/L的密度接種3種子宮內(nèi)膜癌細胞株(RL95-2、HEC-1A和HEC-1B)。單獨培養(yǎng)組只在Transwell小室中接種子宮內(nèi)膜癌細胞株。2組均培養(yǎng)5 d后，留取一部分培養(yǎng)液用于后續(xù)芯片篩查細胞因子，余培養(yǎng)液用于檢測雌激素的含量。用化學發(fā)光免疫(UniCel DxI 800全自動化學發(fā)光免疫分析儀)雌激素的含量；熒光定量real-time PCR法檢測腫瘤細胞內(nèi)芳香化酶mRNA的表達。

1.6 細胞因子芯片篩查 選取差異最明顯的一組細胞，留取細胞培養(yǎng)液上清，進行子宮內(nèi)膜癌局部雌激素合成相關調(diào)控細胞因子的芯片篩查。人細胞因子芯片(RayBioTM抗體芯片)購自上海BioTNT公司，含507個人源性細胞因子抗體。根據(jù)芯片說明書，通過激光熒光檢測芯片信號，芯片亮度越強說明相應的細胞因子含量越高。

1.7 生長分化因子-15(GDF-15)刺激芳香化酶的表達 將RL95-2、HEC-1A和HEC-1B分別接種于24孔板，孵育24 h至密度70%～80%融合，PBS洗3遍，換無血清培養(yǎng)液孵育過夜，分別用5、10、20、50、100 ng/mL濃度的GDF-15刺激24 h，提取細胞mRNA，經(jīng)real-time PCR檢測芳香化酶表達情況。

2 結 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌間質(zhì)細胞鑒定 雙重免疫細胞熒光染色結果圖1顯示，間質(zhì)細胞的特征性蛋白(波形蛋白)為陽性染色，上皮細胞的特征性蛋白(角蛋白)為陰性染色，證實成功提取和培養(yǎng)了子宮內(nèi)膜癌間質(zhì)細胞。

圖1 雙重免疫細胞熒光染色堅定子宮內(nèi)膜癌間質(zhì)細胞

2.2 雌激素合成和芳香化酶表達情況 結果(圖2)表明：共培養(yǎng)組培養(yǎng)上清中雌激素的濃度及腫瘤細胞中芳香化酶mRNA的含量均高于單獨培養(yǎng)組。

2.3 2組差異性表達細胞因子的篩選 HEC-1A細胞中芳香化酶的表達的在2組間差異性最大，因此將其用于細胞因子篩查，結果表明，與代謝相關的細胞因子中，2組GDF-15的表達差異性最大(P<0.01)，見圖3。

圖2 2種培養(yǎng)模式下上清液中雌激素和腫瘤細胞內(nèi)芳香化酶mRNA的表達

圖3 2種培養(yǎng)模式下GDF-15的表達

2.4 不同濃度GDF-15對內(nèi)膜癌細胞株芳香化酶表達的調(diào)節(jié) real-time PCR結果(圖4)顯示：5、10、20、50、100 ng/mL的GDF-15刺激3種子宮內(nèi)膜癌細胞株后，以10 ng/mL的GDF-15刺激細胞株中芳香化酶表達的作用最明顯(P<0.01)。

圖4 不同濃度的GDF-15對3種子宮內(nèi)膜癌細胞株中芳香化酶表達的影響

3 討 論

長期過量的雌激素可誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[6]，而子宮內(nèi)膜癌中雌激素濃度遠高于健康婦女血液和子宮內(nèi)膜[3]。由此推測，子宮內(nèi)膜癌中原位雌激素合成在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。芳香化酶是雌激素合成的限速酶，在卵巢的顆粒細胞、脂肪細胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細胞和腦細胞等多種雌激素合成部位表達[5]。已有研究[7-8]表明，子宮內(nèi)膜癌中芳香化酶的異常表達與腫瘤預后密切相關；在口服孕激素無效的絕經(jīng)前子宮內(nèi)膜癌患者中，芳香化酶抑制劑的治療效果較好。

本研究中，子宮內(nèi)膜癌細胞與間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組培養(yǎng)液上清中的雌激素及腫瘤細胞中的芳香化酶mRNA含量均高于子宮內(nèi)膜癌細胞單獨培養(yǎng)組，證實了腫瘤微環(huán)境對雌激素原位合成的作用。進一步培養(yǎng)液上清進行細胞因子芯片篩查，顯示共培養(yǎng)組GDF-15升高。

GDF-15是一種應激反應蛋白，1997年由Bootcov等[9]首次在激活的巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)。其定位于19p12.1～13.1，含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，主要參與組織修復和調(diào)節(jié)器官生長、分化等生物學進程。GDF-15可促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，但也可促進腫瘤細胞的凋亡，這2種相互矛盾的作用及具體機制尚未被完全闡明[10]。研究[11]顯示，血漿GDF-15的濃度可以作為前列腺癌、胰腺癌和結腸癌等多種惡性腫瘤的生物學預測指標。而且，GDF-15可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境(如巨噬細胞的功能)來促進早期腫瘤的發(fā)展[12]。本研究中，GDF-15可以促進3種子宮內(nèi)膜癌細胞株中芳香化酶的表達。由此推測，在子宮內(nèi)膜癌微環(huán)境中，腫瘤間質(zhì)細胞通過分泌GDF-15，調(diào)控癌細胞中芳香化酶的合成，進而導致子宮內(nèi)膜癌原位雌激素的增加。

在卵巢癌患者血清中，GDF-15表達水平升高，可與CA125一起作為卵巢癌的早期診斷指標[13-14]。李會平等[15]發(fā)現(xiàn)，GDF -15 在子宮內(nèi)膜癌組織中表達較高，且與肌層浸潤深度正相關。國外研究[16-17]也表明，子宮內(nèi)膜癌患者血清GDF-15 水平與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移和預后密切相關，且可以作為腫瘤進展的獨立預測因子，因此可作為子宮內(nèi)膜癌進展、復發(fā)和預后的有效預測指標。另外，GDF-15與肥胖及新陳代謝之間存在明顯的相關性[18]。GDF-15可通過延遲胃排空、激活末梢區(qū)神經(jīng)元及促進脂肪分解的作用方式預防及治療肥胖[19]。本研究證實，GDF-15可促進子宮內(nèi)膜癌中芳香化酶的表達，這可能是GDF-15促進子宮內(nèi)膜癌發(fā)展的新機制。

腫瘤細胞通過產(chǎn)生多種生長因子和趨化因子，并以旁分泌的方式激活間質(zhì)細胞而活化腫瘤基質(zhì)，而間質(zhì)細胞被腫瘤細胞誘導后，也產(chǎn)生多種細胞因子及酶，進一步促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[20]。正常細胞與周圍的組織微環(huán)境之間存在著動態(tài)平衡，進而使維持細胞的正常生長和凋亡。而腫瘤惡變則破壞了這一平衡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌中GDF-15可以促進局部雌激素合成，這一細胞因此可能成為子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制研究和治療的潛在靶點。