重組高遷移率組蛋白N2蛋白入胞與細(xì)胞定位研究

馬 驍， 徐恩杰， 尹 佳， 周許輝

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院脊柱四科，上海 200003

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，特點(diǎn)為易早期轉(zhuǎn)移。15%～25%的患者在確診骨肉瘤時(shí)可檢測(cè)到肺部轉(zhuǎn)移[3]。骨肉瘤的主要治療方法為腫瘤切除術(shù)和非特異性聯(lián)合化療[4-5]。隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤患者的長(zhǎng)期生存率有所提高[6]，但合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的生存率仍很低[7-9]。因此，抑制其轉(zhuǎn)移仍是抗腫瘤治療的關(guān)鍵。

高遷移率組蛋白N2(high mobility group chromosal protein N2,HMGN2)的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[10-14]。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，HMGN2能抑制膀胱癌細(xì)胞和口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡。本課題組以往研究[17]也表明，在骨肉瘤細(xì)胞中以慢病毒感染的方式過(guò)表達(dá)HMGN2會(huì)抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，提示HMGN2是一類抗腫瘤轉(zhuǎn)移因子，促進(jìn)其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可作為一種治療骨肉瘤的臨床策略。但是，慢病毒過(guò)表達(dá)方法有潛在危險(xiǎn)性。

有研究[18-20]表明，人外周血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞可在受到外界刺激后向胞外分泌HMGN2。這種分泌的HMGN2可能也具有抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的功能，而能否自行入胞是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，目前鮮見相關(guān)研究。因此，本研究探討了外源性HMGN2蛋白能否進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞及其細(xì)胞定位，期望能為未來(lái)研發(fā)類HMGN2結(jié)構(gòu)藥物或刺激HMGN2釋放的藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料 U-2OS骨肉瘤細(xì)胞和HEK-293FT細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院科院細(xì)胞庫(kù)。慢病毒載體以及病毒包裝質(zhì)粒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，牛血清白蛋白、FLAG M純化試劑盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，一抗及ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam公司，二抗購(gòu)自CST公司，ECL曝光液購(gòu)自Pierce公司，DMEM購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，TRIzol試劑、Lipofactamine 2000、雙抗(青霉素、鏈霉素)均購(gòu)自Invitrogen公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、SYBR Green預(yù)混液購(gòu)自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司，NE-PER核蛋白提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U-2OS骨肉瘤細(xì)胞和HEK-293 FT細(xì)胞置入含10% 胎牛血清、青霉素 (100 U/L) 和 鏈霉素(100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基中，于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 HMGN2 過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建與包裝 過(guò)表達(dá)慢病毒載體元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，以BamHI和AgeI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，切膠回收。用TRIzol提取U-2OS細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以獲得的cDNA為模板擴(kuò)增HMGN2片段。擴(kuò)增引物序列正向：5′-AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC GCC ACC ATG CCC AAG AGA AAG GCT GAA G-3′，反向：5′-TCC TTG TAG TCC ATA CCC TTG GCA TCT CCA GCA CCT TC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL、模板1 μL、上游擴(kuò)增引物1 μL、下游擴(kuò)增引物1 μL、dNTP Mix 4 μL、5×PS Buffer 10 μL、無(wú)酶水32.5 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳并切膠回收。

將PCR產(chǎn)物交換入酶切后的GV492載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將菌落PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌落接種于LB培養(yǎng)基。菌落PCR引物序列正向：5′-GGG TCA ATA TGT AAT TTT CAG TG-3′，反向：5′- CCT TAT AGT CCT TAT CAT CGT C -3′。將菌液于37℃培養(yǎng)12 h后取適量進(jìn)行測(cè)序。用DNA序列無(wú)誤的菌液抽提質(zhì)粒。過(guò)表達(dá)組：將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293FT細(xì)胞；空白組：將空載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293FT細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收取培養(yǎng)基上清，0.45 μm濾器過(guò)濾，以30 000 r/min 4℃離心3 h。離心結(jié)束后棄上清，加入Opti-MEM培養(yǎng)基1 mL吹打重懸，深低溫(-80℃)保存病毒液。

1.4 HMGN2 的過(guò)表達(dá)和蛋白純化 用過(guò)表達(dá)慢病毒(HMGN2-flagoe組)和空白慢病毒(oeCON組)感染HEK-293FT細(xì)胞。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定U-2OS細(xì)胞病毒感染的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10。為了增加陽(yáng)性細(xì)胞的比例，在細(xì)胞感染3 d后進(jìn)行流式分選，并繼續(xù)培養(yǎng)攜帶綠色熒光的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，收集并提取RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率。確認(rèn)HMGN2過(guò)表達(dá)效率后，收集過(guò)表達(dá)HMGN2的細(xì)胞，用NE-PER核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，并應(yīng)用FLAG M純化試劑盒純化HMGN2-flag蛋白。通過(guò)ELISA法(ab49763)檢測(cè)HMGN2的濃度。

1.5 RT-qPCR 使用SYBR Premix ExTaq和ABI Prism 7900HT進(jìn)行RT-qPCR，定量測(cè)定HMGN2的表達(dá)水平。應(yīng)用TRIzol提取每組細(xì)胞的總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增(以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參)。PCR引物序列：HMGN2正向?yàn)?′-CGA TTG TCT GCC CAT GTC CT-3′，反向?yàn)?′-GCA GAA CGT ACC CTG TTC CA-3′; β-actin正向?yàn)?′-ACC GAG CGC GGC TAC AG-3′，反向?yàn)?′-CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3′。采用2-ΔΔCt法分析并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。用相同的樣品和相同的引物重復(fù)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 Western印記 使用NE-PER核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。獲得的蛋白溶液在SDS-PAGE凝膠上電泳，分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在5%牛血清白蛋白中封閉，分別用抗HMGN2(1∶1 000稀釋，ab199679)和抗DDDDK(1∶1 000稀釋，ab49763)在4℃下孵育過(guò)夜，然后在室溫下用二抗孵育膜1 h。使用ECL曝光液顯影，并進(jìn)行觀察、拍攝。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué) 用濃度為10 μg/mL的純化HMGN2蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞24 h，然后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，用含0.1% Triton X-100的PBS溶液透化5 min，用1% BSA封閉細(xì)胞2 h。將細(xì)胞用抗DDDDK抗體(1∶100稀釋，ab49763)在4℃孵育過(guò)夜，然后用二抗孵育1 h，PBS洗滌后用DAPI封固。在共聚焦顯微鏡下觀察HMGN2-flag的細(xì)胞定位并拍攝。

2 結(jié) 果

2.1 HMGN2過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建 將獲得的HMGN2片段與慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(圖1A)連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得8個(gè)陽(yáng)性菌落(圖1B，泳道5～12)；糖凝膠電泳顯示成功獲得HMGN2的基因片段(圖1C)，PCR產(chǎn)物大小為314 bp。將陽(yáng)性菌送測(cè)序，結(jié)果顯示序列無(wú)誤，提取質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝。

2.2 HMGN2蛋白過(guò)表達(dá)與純化 以慢病毒感染的方式在HEK-293FT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HMGN2，以流式分選出陽(yáng)性細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡下顯示細(xì)胞帶綠色熒光(圖2A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，HMGN2-flagoe組HMGN2-mRNA的表達(dá)水平顯著高于oeCON組(P<0.001，圖2B)。Western印記結(jié)果顯示，HMGN2-flagoe組與oeCON組均有HMGN2表達(dá)，HMGN2-flagoe組HMGN2表達(dá)大于oeCON組，HMGN2-flagoe組HMGN2因帶標(biāo)簽分子量較oeCON組稍大(圖2C)；HMGN2-flagoe組和Flag-BAP組中有flag表達(dá)，在oeCON組中未檢測(cè)其表達(dá)(圖2D)。

2.3 外源性HMGN2轉(zhuǎn)運(yùn)骨肉瘤細(xì)胞及定位 用10 μg/mL的純化HMGN2-flag蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞24 h后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，外源性HMGN2蛋白轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞，主要定位于細(xì)胞核(圖3)。

圖1 HMGN2過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

A: 質(zhì)粒圖譜；B: PCR擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果；C: 構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后的菌液PCR驗(yàn)證. 1：ddH2O空白對(duì)照；2：空載體對(duì)照；3：連接GAPDH的對(duì)照；4：Marker；5～12：8個(gè)陽(yáng)性菌落結(jié)果

圖2 HMGN2蛋白過(guò)表達(dá)與純化

A: 白光下和綠色熒光下慢病毒感染的骨肉瘤細(xì)胞；B: 熒光定量PCR檢測(cè)HMGN2過(guò)表達(dá)效率；C: Western印記檢測(cè)純化HMGN2的表達(dá);D: Western印記檢測(cè)flag的表達(dá). oeCON組:空白載體對(duì)照；HMGN2-flagoe：帶有flag標(biāo)簽的HMGN2純化蛋白； flag-BAP：攜帶flag標(biāo)簽的融合蛋白，大小49.3 kDa.***P<0.001

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性HMGN2細(xì)胞定位

3 討 論

骨肉瘤是一類極易在早期轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，約20%的骨肉瘤患者在明確診斷時(shí)即發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移，而大多數(shù)患者即使在初診時(shí)未見轉(zhuǎn)移，也會(huì)隨著病情發(fā)展出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[22]。骨肉瘤的主要治療方法是化療和外科手術(shù)，但是目前沒有有效的抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的治療策略，大部分患者仍會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致死亡[23-25]。因此，抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的研究成為這類腫瘤治療的重點(diǎn)。

HMGN2是高遷移率族蛋白(HMG)的一員，主要定位于細(xì)胞核，且僅在真核生物中表達(dá)，具有穩(wěn)定核小體形態(tài)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能[26]。其是一種非組蛋白核蛋白，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中廣泛表達(dá)[27-28]。HMGN2蛋白含有核小體結(jié)合域(NBD)，其NBD的N末端與組蛋白結(jié)合，而C末端與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[28]。HMGN2能增加DNA在核小體上的纏結(jié)角度，促進(jìn)核衣殼結(jié)構(gòu)重塑[29]。HMGN2功能缺陷能增加DT40細(xì)胞對(duì)紫外線的敏感性，使細(xì)胞凋亡率增加[30]。較多研究[10-15]顯示，HMGN2的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)聯(lián)。HMGN2高表達(dá)還具有抑癌效果。研究[16]表明，HMGN2可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。本課題組以往研究[17]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HMGN2能抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。除了直接抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移外，Porkka等[19]還發(fā)現(xiàn)，HMGN2與腫瘤血管生成相關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制和腫瘤靶向肽研究[31-32]表明，HMGN2可能是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。研究人員從牛肝中提取了一種含21個(gè)氨基酸的肽，稱為侵襲抑制劑2(IIF2)，且鑒定顯示其與HMGN2的C末端片段一致[31-32]。體外研究[32-34]顯示，該肽能抑制多個(gè)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。而動(dòng)物研究[32]表明，同時(shí)將IIF2和肺癌細(xì)胞經(jīng)小鼠尾靜脈注射可使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移減少50%～60%。 IIF2與白蛋白結(jié)合可提高其穩(wěn)定性，并使轉(zhuǎn)移減少86%[33, 35]。上述研究表明，HMGN2可作為一類抑癌因子，應(yīng)用于抗惡性腫瘤轉(zhuǎn)移。

重組慢病毒載體是一種常用且有效的將外源蛋白基因?qū)爰?xì)胞的手段[36]，但是慢病毒載體的轉(zhuǎn)錄“通讀”現(xiàn)象可導(dǎo)致其整合位點(diǎn)附近原沉默基因被激活，這可能有潛在的危險(xiǎn)性。因此需要尋找更為有效和安全的方式來(lái)增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的HMGN2的含量。HMGN2能被某些細(xì)胞以外分泌的方式釋放到胞外。白細(xì)胞介素2(IL-2)可刺激人外周血單核細(xì)胞釋放HMGN2[19-20]；一些腫瘤細(xì)胞的表面抗原也能刺激CD8+T淋巴細(xì)胞釋放HMGN2[18]。這些研究提示，有可能通過(guò)外界刺激促使腫瘤旁正常組織或腫瘤附近的免疫細(xì)胞釋放足量的HMGN2，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。而這類外分泌的HMGN2轉(zhuǎn)運(yùn)入腫瘤細(xì)胞是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。本研究用純化HMGN2-flag融合蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示該外源性HMGN2能轉(zhuǎn)運(yùn)入骨肉瘤細(xì)胞并定位于細(xì)胞核。此外，內(nèi)源性HMGN2蛋白在細(xì)胞核的定位已被多項(xiàng)研究[37-38]證實(shí)，而外源性HMGN2蛋白入胞是其入核的先決條件，對(duì)其機(jī)制的深入研究能為未來(lái)相關(guān)藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

綜上所述，過(guò)表達(dá)的HMGN2在人骨肉瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抗腫瘤活性，而本研究成功制備了HMGN2蛋白，并經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性HMGN2能轉(zhuǎn)運(yùn)入骨肉瘤細(xì)胞，從而為進(jìn)一步研究其抗腫瘤轉(zhuǎn)移功能及新藥研發(fā)提供了基礎(chǔ)。下一步研究將對(duì)外源性HMGN2入胞后的抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力和機(jī)制進(jìn)行探索。