玉米Zmglp基因的克隆及生物信息學(xué)分析

苗馨心， 單立杰， 吳委林， 鄭大浩， 樸世領(lǐng)

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

玉米不僅是世界上產(chǎn)量最高的谷類糧食作物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物和飼料作物。在我國，玉米的播種面積和總產(chǎn)量已經(jīng)超過水稻和小麥，成為我國第1大糧食作物[1]。然而玉米病害一直是玉米生產(chǎn)中的重要限制因素，其中，彎孢菌葉斑病發(fā)生嚴(yán)重時，病斑密布整片葉片，形成大面積壞死，致使葉片枯死[2]，嚴(yán)重影響了我國玉米生產(chǎn)的安全。

植物在生長發(fā)育過程中進(jìn)化出了應(yīng)對生物與非生物脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)。作為病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)家族的一員, 類萌發(fā)素蛋白(germin-like proteins,GLPs)是一類普遍存在的功能性糖蛋白[3], 具有產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)的SOD和草酸氧化酶(OXO)的酶活性[4-5]，與植物抵御外源物質(zhì)傷害及多種逆境脅迫密切相關(guān)[6],在植物的生長發(fā)育和防衛(wèi)反應(yīng)中有重要作用[3]。據(jù)報道,在受到真菌感染后,植物細(xì)胞內(nèi)GLPs的表達(dá)上調(diào),并且通過H2O2信號途徑來調(diào)節(jié)植物對真菌的防御，進(jìn)一步分析，GLPs通常與細(xì)胞壁非共價結(jié)合[7-8]，通過NO和H2O2的積累，來調(diào)控POD、CAT、SOD、PAL、Glu等諸多防御酶的活性，進(jìn)而增強抵御彎孢菌的擴(kuò)展[9]。

雖然前期研究已經(jīng)證實Zmglp基因在玉米抗彎孢菌葉斑病中起到重要作用，但尚未在不同抗性材料之間進(jìn)行該基因的克隆及生物信息學(xué)分析。該研究克隆了抗病自交系Mo17與感病自交系黃早4的Zmglp基因，通過生物信息學(xué)方法分析該基因的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)構(gòu)象及生理功能，為進(jìn)一步深入研究Zmglp在抵御彎孢菌侵染的作用機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取抗病品種Mo17和感病品種黃早4，種子經(jīng)催芽處理12 h后，播種于農(nóng)學(xué)院教學(xué)實驗基地大棚中，待至長出3片葉時，取第3片葉片為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 玉米葉片DNA的提取

剪取100 mg玉米新鮮葉片，加入液氮后充分研磨，使用改良尿素法[10]提取玉米DNA，通過凝膠電泳檢測DNA純度，保存于-20 ℃冰箱，待用。

1.2.2Zmglp基因克隆與測序

首先，以玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org)上下載的玉米Zmglp DNA序列Zm00009a028485_T001為基礎(chǔ)，引用文獻(xiàn)中[11]所設(shè)計的Zmglp正向引物ZmglpF1: 5’-GTTGCCATGGCCAAAATGGTG-3’,反向引物為ZmglpR1: 5’-CAGATTAACAGCATGCGGCAC-3’。在玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組中引物區(qū)間內(nèi)目標(biāo)DNA序列長度為1 026 bp。

以玉米自交系Mo17和黃早4基因組DNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。采用梯度PCR的方法摸索擴(kuò)增所需最佳溫度，PCR 反應(yīng)體系(25 μL)為：DNA模板2.5 μL，2×Go Taq Green Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，10 μM上下游引物各1.25 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56.9 ℃，退火30 s，72 ℃延伸180 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后連接pMD19-T，再轉(zhuǎn)化到DH5α中，挑取陽性單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，后稀釋劃線。準(zhǔn)確無誤后從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，再進(jìn)行PCR驗證，驗證目的條帶正確后，將相應(yīng)的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，保存菌種后，送到上海生工公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

測序后得到的DNA序列，通過DNAStar軟件和DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析。

目標(biāo)DNA序列編碼的蛋白質(zhì)序列分析，利用NCBI在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對與保守域分析；利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/) 在線工具和軟件DNAMAN完成了對核酸及氨基酸序列組成分析、編碼蛋白的理化性質(zhì)分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線工具完成蛋白質(zhì)親疏水性分析；利用在線工具TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析和Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dTu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測；利用 YinOYang l.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)進(jìn)行O-β-葡萄糖糖基化位點預(yù)測；利用DNAMAN 、MEGA6.06軟件完成核酸和氨基酸序列的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

為摸索該引物從玉米自交系Mo17和黃早4中分離目標(biāo)片段的PCR溫度條件，在正向引物和反向引物的適宜范圍內(nèi)設(shè)置溫度梯度，PCR儀自動設(shè)置的8個溫度梯度為：52.0、52.5、53.5、55.1、56.9、58.4、59.4和60.0 ℃。經(jīng)梯度PCR擴(kuò)增，Mo17與黃早4均得到特異性條帶(圖1)。其中，Mo17與黃早4均在56.9 ℃時條帶最清晰，該片段長度1 026 bp。

注：M：Marker 2000;Lane 1～8:ZmglpMo17 PCR;Lane 9～16:ZmglpHuangzao4 PCR引物擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段長度為1 026 bp。

圖1 玉米自交系Mo17和黃早4的基因組DNA為模板的PCR條件

Fig.1 PCR reaction conditions using DNA from maize inbred Mo17 and Huangzao 4 as template

2.2 目標(biāo)序列分析

2.2.1 目標(biāo)DNA序列及其目的基因編碼的蛋白質(zhì)序列分析

從玉米自交系Mo17和黃早4中均成功分離到含有完整目的基因的DNA片段，在NCBI網(wǎng)站上通過Blast比較，確認(rèn)從自交系Mo17所克隆得到的Zmglp基因序列與已公布的Zmglp序列(登錄號為AY394010.1)的基因序列相似性達(dá)100%，證實所得到的序列是玉米Zmglp。從自交系Mo17中克隆的基因片段長度為1 026 bp，從自交系黃早4中克隆的基因片段長度為1 019 bp(圖2),2個自交系都具有完整的開放閱讀框(ORF)，且開放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)完全一致(圖3)，均由212個氨基酸組成。

圖2 玉米自交系Mo17和黃早4基因序列的比較

經(jīng)進(jìn)一步序列比較發(fā)現(xiàn)，二者在ORF區(qū)的410 bp處與440 bp處存在堿基同義突變，且3’端有大量堿基突變(圖2)。根據(jù)此推測可能該基因在不同品種中調(diào)控機制不同，表達(dá)量可能會有差別。

圖3 玉米自交系Mo17和黃早4編碼蛋白質(zhì)的比較

2.2.2 目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析

2.2.2.1Zmglp編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

在線預(yù)測玉米Zmglp的理論等電點蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量得出：Zmglp理論PI=6.01，Mw=21 887.34，分子式為C997H1562N248O288S8,Leu的含量最大，占12.3%，含有 19個芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)，占8.9% ，Zmglp負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)的數(shù)目共有12個，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)的數(shù)目共有10個，不穩(wěn)定指數(shù)為23.72(<40)，因此，該蛋白是穩(wěn)定的。

對蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性/親水性分析時，采用Kyte&Doolittle標(biāo)度計算，結(jié)果顯示Arg親水性最強；Tle疏水性最強(圖4)?？偲骄H水性值(GRAVY)為0.526，因此，該蛋白為親水性蛋白，能溶解在水溶液中。

注：峰值<0，表示親水性，峰值>0，表示疏水性。

圖4Zmglp蛋白的親疏水性及其區(qū)域

Fig.4 Hydrophilicity and region ofZmglpprotrin

2.2.2.2 玉米Zmglp蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

利用SOPMA預(yù)測玉米Zmglp蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖5)，結(jié)果表明：α螺旋(Hh):62，29.25%，β折疊(Tt):26,12.26%,延伸鏈(Ee):58，27.36%，無規(guī)則卷曲(Cc):66，31.13%。

注：A為α-螺旋；B為延伸鏈；C為無規(guī)則卷曲；D為β轉(zhuǎn)角

圖5 Zmglp蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Fig.5 Zmglp protein secondary structure prediction

2.2.2.3 玉米Zmglp蛋白質(zhì)信號肽分析

根據(jù)信號肽序列特征，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法或隱馬氏模型方法，根據(jù)物種的不同，對信號肽位置及切割位點進(jìn)行預(yù)測。用SignalP對Zmglp進(jìn)行信號肽的分析(圖6)，可更直觀分析氨基酸的Score，可知信號肽存在幾率是0.997 8，切割位點在22和23位氨基酸之間。

圖6 Zmglp的信號肽分析

2.2.2.4 玉米Zmglp蛋白質(zhì)的保守功能域分析

利用CD-Search軟件分析蛋白質(zhì)的保守域，結(jié)果表明：Zmglp蛋白具有1個cupin_OxOx保守功能域(圖7)，該功能域位于第20～208位氨基酸之間，屬于Cupin類超級家族，具有草酸鹽氧化酶活性。

圖7 Zmglp的保守域及其功能

2.2.2.5 玉米Zmglp蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點分析

用NetPhos3.1進(jìn)行磷酸化位點分析結(jié)果顯示：Zmglp蛋白磷酸化位點有10個(圖8)，其中，Ser 3個、Thr 5個、Tyr 2個，說明磷酸化位點修飾對Zmglp蛋白的結(jié)構(gòu)或功能可能非常重要，這些磷酸化位點也可能參與該蛋白活性的調(diào)控。Ser磷酸化位點為Ser46、Ser128、Ser206；Thr磷酸化位點為Thr24、Thr33、Thr118、Thr130、Thr157；Tyr磷酸化位點為Tyr53、Tyr132。

用Yin0Yang1.2軟件進(jìn)行O-β-葡萄糖糖基化位點分析結(jié)果表明：Zmglp的O-β-葡萄糖糖基化位點有8個(圖9)，其中，Ser 3個，分別為Ser35、Ser45、Ser167;Thr 5個，分別為Thr72、Thr115、Thr118、Thr133、Thr157。

圖8 Zmglp的蛋白磷酸化位點

圖9 Zmglp的O-β-葡萄糖糖基化位點

2.2.2.6 玉米Zmglp蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域與亞細(xì)胞定位預(yù)測

用TMHMM在線預(yù)測Zmglp蛋白質(zhì)跨膜螺旋的結(jié)果表明：該基因編碼蛋白在5～24個氨基酸位置之間有1個明顯的跨膜區(qū)域，因此，預(yù)測Zmglp蛋白屬于跨膜蛋白(圖10)，經(jīng)Plant-mPLoc預(yù)測定位在細(xì)胞壁上。

注：A表示伸入到細(xì)胞內(nèi)的部分，B表示伸入到細(xì)胞膜外的部分

2.2.2.7 玉米Zmglp蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

為了解玉米GLP蛋白的高級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL同源建模軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。此蛋白的空間結(jié)構(gòu)主要是由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致(圖11)。

2.2.2.8 玉米Zmglp氨基酸的多序列對比和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從UniProtKB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選取10種禾本科的GLP蛋白和玉米Zmglp蛋白進(jìn)行氨基酸的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。運用DNAMAN軟件對它們的氨基酸序列進(jìn)行多重比對結(jié)果顯示，氨基酸序列一致性為71.68%，由此可見，GLP蛋白在進(jìn)化上比較保守。運用MEGA6.06軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖12),結(jié)果表明：玉米(Zmglp Huangzao4)和雙色高粱(C5Z116)、Dichanthelium oligosanthes(A0A1E5VJG5)、黍稷(A0A3L6RHB0)、Panicum hallii var. Hallii(A0A2T7D8A4)、小米(K3YJN4)為一支； 展穎野生稻(A0A0E0AWB2)、二穗短柄草(A0A2K2D1T6)、串珠節(jié)節(jié)麥(A0A453R4Z7)、小麥(A0A3B6SAY4)、大麥(F2E7Z5)為一支。

圖11 Zmglp的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖12 玉米中Zmglp與其他物種GLP的進(jìn)化樹分析

3 討論與結(jié)論

GLPs廣泛分布在陸生植物中，且組成了一個龐大而功能各異的基因家族。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，萌發(fā)素和類萌發(fā)素蛋白在鹽脅迫、干旱脅迫、抵御病原體以及重金屬離子脅迫中起重要作用[12-15]。

在前期差異蛋白分析中發(fā)現(xiàn)，高抗玉米自交系魯原92的GLP蛋白受彎孢菌侵染而特異性誘導(dǎo)[16]。該研究選用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2個親本，即來自美國Lancaster群的抗彎孢菌自交系Mo17與中國培育的塘四平頭群的感彎孢菌自交系黃早4為材料，克隆的Zmglp基因片段在ORF區(qū)段內(nèi)只有2個堿基的同義突變，而在3’端存在大量堿基突變，表達(dá)的蛋白質(zhì)含有8個糖基化與10個磷酸化位點，與禾本科植物的同源基因的比對結(jié)果顯示，氨基酸序列一致性達(dá)到了71.68%，說明Zmglp蛋白在玉米甚至是禾本科中功能非常保守，也暗示了該基因可能在禾本科植物的生長發(fā)育中主要受抗病性相關(guān)miRNA調(diào)控表達(dá)量的變化以及蛋白質(zhì)的糖基化與磷酸化的作用而起到抵抗生物與非生物脅迫的重要功能。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，生物或非生物因素的水楊酸、乙烯以及ABA信號等途徑都可以誘導(dǎo)GLPs基因的表達(dá)[17-21]，在擬南芥、水稻、小麥等植物的GLPs基因的研究上，證明類萌發(fā)素蛋白在植物體內(nèi)主要通過酶(OXO、SOD、ADPPase)、受體(ABP19/20)和結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)揮生理功能[22]。在該研究中，Zmglp蛋白的N端含有信號肽和跨膜域，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞壁上，且含有Cupin超級家族的具有草酸鹽氧化酶功能cupin_OxOx保守域，據(jù)此推測，Zmglp蛋白可穿過膜結(jié)構(gòu)通過酶(OXO、SOD、ADPPase)、受體(ABP19/20)和結(jié)構(gòu)蛋白共價結(jié)合在細(xì)胞壁上，并接受生物或非生物脅迫的信號，由cupin_OxOx功能域催化產(chǎn)生的H2O2與草酸鈣降解釋放的Ca2+一起達(dá)到較高濃度后介導(dǎo)細(xì)胞壁交聯(lián)，并傳遞信號調(diào)控相關(guān)防御基因的表達(dá)，起到抵抗生物或非生物脅迫的作用。