低溫脅迫下優(yōu)質(zhì)稻種芽期耐冷性及不同時期抗氧化酶活性研究

鄧 鑫， 王 亮， 徐偉豪， 白學(xué)峰， 張基德*， 具紅光*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 龍井 133400)

延邊朝鮮族自治州位于吉林省的東部，地處中、朝、俄3國交界，其山區(qū)、半山區(qū)水稻面積占延邊水稻面積的40%[1]；因面臨日本海及鄂霍次克海，受西伯利亞冷空氣的影響，冷害時常發(fā)生，其危害的嚴重性和廣泛性給當(dāng)?shù)厮镜姆N植和生產(chǎn)帶來了巨大的影響，遇冷害年水稻減產(chǎn)30%，甚至更高，給當(dāng)?shù)厮井a(chǎn)業(yè)帶來嚴重損失。通過對水稻芽期的耐冷性研究，采取相應(yīng)的技術(shù)措施，可大幅度減少水稻芽期冷害造成的損失[2-3]。

芽期耐冷性是幼芽細胞維持生活的能力，從外觀上表現(xiàn)為幼芽誘發(fā)綠苗的能力[4]。低溫是影響水稻種子發(fā)芽成苗的主要因素之一[5]，容易在水稻播種開始，到第1片完全展開葉這個過程中，延長了水稻出芽時間，或者導(dǎo)致爛秧現(xiàn)象[6]，造成成苗率下降。芽期耐冷性的強弱直接決定了該品種是否適用于寒地種植[7]。

冷害是低溫對植物體的生理性損傷，造成活性氧的數(shù)量增加，損傷程度除了取決于低溫脅迫的強度外，還取決于低溫維持的時間長短[8]。通過SOD、CAT、POD等酶可清除植物體內(nèi)過量的活性氧，使植株免受或少受活性氧傷害，因此它們是植物重要的耐冷保護酶系統(tǒng)[9-10]，3種酶的協(xié)同作用，能使自由基維持一個較低的水平，提高水稻植株的抗寒能力[11]。

該試驗主要針對延邊黑土稻區(qū)水稻生產(chǎn)現(xiàn)狀，減少水稻各時期冷害造成的經(jīng)濟損失，引進省內(nèi)外優(yōu)質(zhì)新品種，通過鑒定耐冷性，測定各生理指標變化，分析品種間差異，篩選出適宜黑土稻區(qū)種植的耐冷優(yōu)質(zhì)品種，為促進水稻可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芽期耐冷性篩選

1.1.1 材料

試驗材料為吉林省內(nèi)外的豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種：上育397、龍稻17、龍稻18、吉農(nóng)大538、九稻68、吉粳302、通系935、通禾66、吉粳511、吉粳515、通育266、吉粳809、延粳22、吉玉粳、通35，共計15個。由選育單位提供后，經(jīng)32 ℃浸種催芽，以保證所有品種材料發(fā)芽率都在95%以上。

1.1.2 方法

1) 發(fā)芽期耐冷性評價 將供試水稻種子在50 ℃恒溫下處理48 h，使其充分干燥和打破休眠。每份材料挑選飽滿種子，均勻放置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少量水浸種24 h后，再用自來水洗滌2～3次，分別放入14 ℃恒溫箱中低溫培養(yǎng)，每個樣品50粒，3次重復(fù)。低溫培養(yǎng)設(shè)置2種時間方式，分別為培養(yǎng)7 d和培養(yǎng)14 d，各培養(yǎng)方式結(jié)束后，調(diào)查種子發(fā)芽率，評價耐冷性[12]，評價標準見表1[5-6]。

表1 發(fā)芽期耐冷評價標準

2) 芽期耐冷性評價 每份材料挑選飽滿種子，種子干燥和浸種方法同1.1.2.1，于32 ℃恒溫箱催芽。當(dāng)芽長約5 mm時取出分別置于3和5 ℃低溫培養(yǎng)箱處理10 d。處理結(jié)束后，將培養(yǎng)皿放在20 ℃以上并有光照的室內(nèi)，使水稻芽恢復(fù)正常生長。10 d后，調(diào)查死苗數(shù)，評價耐冷性[12]，評價標準見表2[5,13]。

表2 芽期耐冷性評價標準

1.2 不同時期抗氧化酶的測定

1.2.1 材料

在芽期耐冷性篩選的基礎(chǔ)上，從上述15份芽期耐冷性篩選品種中挑選5個品種(龍稻18、九稻68、通系935、吉粳511和通育266)，分別進行低溫脅迫后不同生育時期超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等耐冷性生理指標的測定。并以相應(yīng)供試品種的未低溫脅迫處理為對照(CK)，共10個處理,各處理分別為A.自然生長龍稻18(對照)；A1.低溫脅迫龍稻18；B.自然生長九稻68(對照)；B1.低溫脅迫九稻68；C.自然生長通系935(對照)；C1.低溫脅迫通系935；D.自然生長吉粳511(對照)；D1.低溫脅迫吉粳511；E.自然生長通系266(對照)；E1.低溫脅迫通系266。生理指標測定法采用《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》[14]。

1.2.2 苗期抗氧化酶的測定

將催芽的種子播種于裝有苗床土的育苗盤中，每份材料播15粒，以2 cm距離點播，行距3 cm，3次重復(fù)。在20～30 ℃的溫室育苗。在3.5葉齡期，移至人工氣候箱進行5 ℃的低溫脅迫處理，每天光照12 h、黑暗12 h，處理7 d，光照模仿自然低溫陰雨天。7 d后取樣，液氮冷凍后放入超低溫冰箱-80 ℃保存，用于測定超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)。

1.2.3 分蘗期、減數(shù)分裂期、灌漿結(jié)實期抗氧化酶的測定

供試品種按常規(guī)法育苗，苗后移栽至直徑38 cm，高40 cm的盆內(nèi)，每盆栽種4穴，每穴3株基本苗，重復(fù)3次。氮、磷、鉀施用量按純量計分別為120、80和80 kg/hm2。各品種不同生育時期低溫脅迫方法為：1) 分蘗期：將緩苗7 d后的盆栽苗放置于12 ℃的條件下低溫培養(yǎng)，處理時間為6 d，培養(yǎng)結(jié)束時取樣測定相關(guān)酶活性；2) 減數(shù)分裂期：將到達減數(shù)分裂期的植株在16 ℃低溫培養(yǎng)，處理5 d后取樣測定；3) 灌漿結(jié)實期：將到達灌漿結(jié)實期的植株在14 ℃低溫培養(yǎng)，處理10 d后取樣測定。光照、取樣及測定方法同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2003軟件進行表格制作及相關(guān)系數(shù)計算，品種間各抗性生理指標的差異顯著性分析采用DPS V9.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同品種發(fā)芽期耐冷性的影響

由表3可知，低溫發(fā)芽7 d后，各品種發(fā)芽率存在極顯著差異(F=33.96**)，九稻68發(fā)芽率最高(25.33%)，顯著高于其他各品種，但此期所有品種的耐冷性級別均為極弱。

低溫發(fā)芽14 d后，各品種間發(fā)芽率差異極顯著(F=163.01**)，龍稻18、九稻68、通禾66和吉粳511發(fā)芽率達到84%以上，顯著高于其他品種；龍稻18和通禾66耐冷性極強，九稻68和吉粳511耐冷性強，而其余品種耐冷性屬于弱或極弱范疇。

表3 低溫脅迫下各品種的發(fā)芽率和耐冷級別

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母、大寫字母分別表示處理間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 低溫脅迫對不同品種芽期耐冷性的影響

在3 ℃低溫脅迫下，不同品種死苗率差異極顯著(F=24.01**)(表4)，上育397死苗率最低，與其他品種死苗率存在顯著或極顯著差異。在此溫度處理下上育397和吉粳809耐冷性為強，龍稻18、吉粳302、通禾66、吉粳511、延粳22、吉玉粳耐冷性為中，其余品種耐冷性為弱。在5 ℃低溫脅迫下，不同試驗品種死苗率差異顯著(F=2.19*)，延粳22死苗率最低，較吉粳511、通35差異極顯著，較吉玉粳差異不顯著，較其余品種差異顯著；所有品種芽期耐冷性為強。

表4 低溫脅迫對芽期耐冷性比較

2.3 不同品種不同時期低溫脅迫抗氧化酶活性的變化

2.3.1 不同品種不同生育時期低溫脅迫后SOD的變化

由表5可知，各品種經(jīng)低溫脅迫的處理與自然生長處理間的SOD活性存在顯著差異(P<0.05)。處理品種中，除了苗期處理的九稻68、灌漿結(jié)實期處理的龍稻18外，其他低溫脅迫后的各處理SOD酶活性均高于對照組；與對照組相比，各處理SOD酶活性增強幅度差異極顯著(P<0.01)，龍稻18、九稻68、通系935隨著生育進程呈先上升后下降的趨勢，吉粳511、通系266隨著生育的進程呈先下降后上升的趨勢，低溫處理后大體呈分蘗期酶活性增幅最大；苗期通育266 SOD酶活性增幅最大，九稻68 SOD酶活性增幅最小，分蘗期通系935 SOD酶活性增幅最大，吉粳511 SOD酶活性增幅最小，減數(shù)分裂期龍稻18 SOD酶活性增幅最大，吉粳511 SOD酶活性增幅最小，灌漿結(jié)實期吉粳511 SOD酶活性增幅最大，龍稻18 SOD酶活性增幅最小。

2.3.2 不同品種不同生育時期低溫脅迫后CAT的變化

由表6可知，在低溫脅迫下，低溫脅迫處理與自然生長處理間的CAT活性存在顯著差異(P<0.05)，各低溫脅迫處理中除B1在苗期CAT酶活性最高外，其余均在減數(shù)分裂期酶活性達到最高。在除減數(shù)分裂期、灌漿結(jié)實期中的九稻68處理外，其他品種經(jīng)低溫脅迫處理的CAT酶活性均高于對照組；與對照組相比，各處理CAT酶活性增強幅度差異極顯著(P<0.01)，龍稻18、吉粳511、通育266隨著生育時期的進程呈先上升后下降再上升的趨勢，九稻68、通系935隨著時期的進程呈先下降后上升的趨勢，低溫處理后大體呈分蘗期酶活性增幅最大；苗期九稻68 CAT酶活性增幅最大，龍稻18 CAT酶活性增幅最小，分蘗期通系935 CAT酶活性增幅最大，通育266 CAT酶活性增幅最小，減數(shù)分裂期龍稻18 CAT酶活性增幅最大，九稻68 CAT酶活性增幅最小，灌漿結(jié)實期吉粳511 CAT酶活性增幅最大，九稻68 CAT酶活性增幅最小。

表5 不同品種低溫脅迫后各生育時期SOD活性Table 5 SOD activity of fertility period of different varieties after low temperature stress (U· g-1)

表6 不同品種低溫脅迫后不同時期CAT活性

Table 6 CAT activity of fertility period of different varieties after low temperature stress (U·g-1·min-1)

處理低溫脅迫時期苗期分蘗期減數(shù)分裂期灌漿結(jié)實期 處理27.40 c27.67 d32.73 d25.46 bcdA30.76 b32.96 a34.48 a26.90 aA112.24 D19.12 D5.35 A5.63 B增幅/%20.86 f26.63 e34.07 ab26.82 aB32.79 a32.62 ab31.46 e26.31 abB157.19 A22.50 C-7.66 C-1.90 C增幅/%23.81 e25.19 f32.62 d24.57 deC32.34 a27.85 d32.98 cd26.30 abC135.78 B10.55 E1.11 B7.07 AB增幅/%25.88 d23.98 g33.45 abcd22.96 fD32.75 a31.64 b33.45 abcd25.15 cdeD126.55 C31.94 B0.01 B9.55 A增幅25.84 d22.14 h33.19 bcd24.28 eE32.07 a30.44 c33.88 abc25.60 bcE124.11 C37.45 A2.08 B5.42 B

2.3.3 5個品種不同時期低溫脅迫后POD變化規(guī)律

由表7可知，在低溫脅迫下，低溫脅迫處理與自然生長處理間的POD活性存在顯著差異(P<0.05)。處理品種中，除了苗期處理的九稻68、通系935外，其他品種經(jīng)低溫脅迫處理的POD酶活性均高于對照組；與對照組相比，各處理POD酶活性增強幅度差異極顯著(P<0.01)，龍稻18隨著時期的進程呈先下降后上升再下降的趨勢，九稻68隨著時期的進程呈先上升后下降再上升的趨勢，通系935、吉粳511、通系266隨著時期的進程一直呈上升的趨勢，低溫處理后大體呈灌漿結(jié)實期酶活性增幅最大；苗期龍稻18 POD酶活性增幅最大，九稻68 POD酶活性增幅最小，分蘗期九稻68 POD酶活性增幅最大，吉粳511 POD酶活性增幅最小，減數(shù)分裂期通系935 POD酶活性增幅最大，九稻68、通育266 POD酶活性增幅最小，灌漿結(jié)實期通系935 POD酶活性增幅最大，龍稻18 POD酶活性增幅最小。

表7 不同品種低溫脅迫后不同時期POD活性

Table 7 POD activity of fertility period of different varieties after low temperature stress (U·g-1·min-1)

處理低溫脅迫時期苗期分蘗期減數(shù)分裂期灌漿結(jié)實期 處理1.11 d2.96 de0.37 d1.85 dA2.59 bcd5.00 d2.59 c2.59 cdA1133.33 A68.75 D600.00 B40.00 E增幅/%2.22 bcd1.85 e0.74 d3.70 cB1.48 cd14.44 c1.48 cd8.52 bB1-33.33 E680.00 A100.00 D130.00 C增幅/%4.44 a5.19 d0.74 d0.37 eC3.70 ab22.59 b10.37 a12.59 aC1-16.67 D335.71 C1 300.00 A3 300.00 A增幅/%2.22 bcd2.59 e0.74 d1.85 dD2.96 bc3.70 de1.48 cd3.70 cD133.33 B42.86 E100.00 D100.00 D增幅2.22 bcd5.19 d0.74 d1.48 dE2.59 bcd31.48 a4.81 b12.59 aE116.67 C507.14 B550.00 C750.00 B

3 討論與結(jié)論

九稻68在14 ℃處理7 d的發(fā)芽率最高，但發(fā)芽率不足30%，造成發(fā)芽率低的原因，主要源于積溫的不足[15-16]；龍稻18、九稻68、通禾66、吉粳511在14 ℃處理14 d后發(fā)芽率較高，發(fā)芽期表現(xiàn)出較強的耐冷性，說明這幾個品種在遇到低溫時，如果保持積溫足夠，仍然具有較好萌發(fā)的能力，生產(chǎn)穩(wěn)定性較好。

上育397、吉粳809在芽期3 ℃處理后的死苗率較低，芽期的耐冷性為強，而龍稻18、吉粳302、通禾66、吉粳511、延粳22和吉玉粳的死苗率較高，芽期的耐冷性中等，在實際生產(chǎn)中，一般很少會遇到持續(xù)低溫(3 ℃)10 d的情況，因此，這幾個品種試驗下耐冷性中等的品種，在生產(chǎn)中仍能保持較好的生產(chǎn)穩(wěn)定性。

該試驗結(jié)果表明，在SOD、CAT、POD活性方面，5個品種隨著生育時期的進程，大體呈先上升后下降的趨勢，對照組酶活性均有著不同程度的改變，處理酶活性有著不同程度的提升，整體在苗期、分蘗期酶活性變化幅度最大，其中在苗期吉粳511酶活性較強，分蘗期中通育266酶活性較強，減數(shù)分裂期中龍稻18酶活性較強，灌漿結(jié)實期中吉粳511、通育266酶活性較強；通育266在芽期有著較強耐冷性，在后期保護酶的測定上仍具有較強的抗氧化能力，是一個較為耐冷的品種。

通過該試驗研究，部分品種的SOD或CAT酶活性較強，POD酶活性較弱，部分品種的SOD和CAT酶活性較強，POD酶活性較弱，部分品種的POD酶活性較強，SOD或CAT較弱。與陳海燕、王琴[17-18]的試驗中部分品種靠1種或2種酶的提升來抵御逆境生長的結(jié)論相一致。另外，SOD和CAT 2種酶對低溫脅迫比較敏感，在低溫條件下，兩者趨勢變化比較相似，POD的酶活性并未出現(xiàn)太大變化，這很可能是植物適應(yīng)低溫脅迫對代謝的代償調(diào)節(jié)功能的體現(xiàn)[19]。因此，耐冷性較強的品種SOD、CAT、POD 3種酶活大小與植株耐冷性有著顯著的相關(guān)性[20]，在代謝過程中，引起其他代謝途徑或過程受抑制或降低，是植物適應(yīng)逆境的一種積極的策略[21-22]。

水稻耐冷性為復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，是一個復(fù)雜的生理過程，該試驗僅對所試驗品種的芽期耐冷性及不同生育時期抗氧化酶等指標進行了分析，未來有必要針對更多生育階段或更多生育指標進一步深入研究。