正交試驗優(yōu)選復(fù)方痛風(fēng)顆粒的提取工藝

唐勇琛，李擁軍，張亞洲

(1. 柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽)

0 引言

復(fù)方痛風(fēng)顆粒是在廣西柳州市中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕病科用于治療痛風(fēng)的臨床經(jīng)驗方“健脾化濁湯”的基礎(chǔ)上擬研制開發(fā)的純中藥制劑，該方由白術(shù)、紫蘇梗、薏苡仁、車前子、枇杷葉5 味中藥組成。通過近年來的臨床觀察證明了其臨床療效和促進(jìn)尿酸排泄作用而廣泛用于痛風(fēng)的輔助治療。方中白術(shù)健脾燥濕，健運中焦，散精于肺為君；紫蘇梗寬胸利膈，解魚蟹毒，增強中焦運化為臣；薏苡仁、車前子利濕化濁，助尿酸從膀胱排除為佐；枇杷葉肅降肺氣，讓精氣得于正常運行為使；諸藥合用共奏健脾肅肺、利濕化濁之功。方中藥材紫蘇梗、枇杷葉含有大量酚酸類化合物，且具有抗氧化、抗血小板活性、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗炎、保肝和促進(jìn)尿酸排泄作用等[1-2]。為了確保后期質(zhì)量的穩(wěn)定可控，本研究采用L9(34) 正交試驗及綜合評分法，以總酚的含量和收膏率為考察指標(biāo)，對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出復(fù)方痛風(fēng)顆粒的最佳水提工藝，從而保證其結(jié)果的科學(xué)合理性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2550 型紫外- 可見分光光度儀( 日本島津)；AB135-S 型電子分析天平( 瑞士梅特勒- 托利多儀器有限公司)；DL-800 型超聲波清洗器( 上海之信儀器有限公司，功率：800W，頻率：40-60 kHz)；DRT-TW 型調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DH64型電熱恒溫干燥箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)；LK-1000A 型搖擺式高速中藥粉碎機(浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠)。

1.2 藥品和試劑

沒食子酸對照品(純度91.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201403)；白術(shù)、紫蘇梗、薏苡仁(廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司，批號：20140708)；車前子、枇杷葉( 國藥控股柳州有限公司，批號：20140511)。

無水碳酸鈉(分析純，20160324，上海試劑總廠)，鎢酸鈉(分析純，20140910，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，鉬酸鈉( 分析純，20150218，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，硫酸鋰( 分析純，20130825，重慶東方試劑廠)；磷酸(分析純，20160913，北京化工廠)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提工藝的正交試驗設(shè)計

結(jié)合文獻(xiàn)報道[3-7]，采用正交試驗法對復(fù)方痛風(fēng)顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。選取加水量(A)、提取次數(shù)(B)和提取時間(C)作為考察因素，每個因素3 個水平，以總酚的含量和收膏率作為評價指標(biāo)，采取綜合加權(quán)評分的方法進(jìn)行優(yōu)選：總酚的權(quán)重系數(shù)為0.6，收膏率的權(quán)重系數(shù)為0.4，總酚和收膏率的最高測量值分別為滿分60 和40，每項綜合得分=單個測量值/單個最高值×權(quán)重系數(shù)。按L9(34)安排試驗。因素水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交因素水平表

2.2 水提供試品溶液的制備

將處方中的藥材粉碎成粗粉，按比例稱取適量，分別按表1 因素水平進(jìn)行L9(34) 正交試驗。煎煮液用紗布濾過，合并，濃縮至1000mL，采用0.45μm 微孔濾膜過濾，冷卻置于冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 總酚含量測定

2.3.1 磷鉬鎢酸溶液的制備

鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g，加水700mL 溶解，加鹽酸100mL 和磷酸50mL，加熱回流10h，冷卻，然后再添加硫酸鋰150g，50mL水和0.2mL 溴，煮沸以除去殘留的溴(約15min)，冷卻，用水稀釋至1000mL，過濾即得(溶液應(yīng)為黃色，如果變?yōu)榫G色，則加0.2mL溴并煮沸以除去多余的溴)。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取50.2mg 沒食子酸對照品，將其置于50mL 棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，然后精密量取5mL，置于100mL 棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，充分振搖即得(每mL中含0.0504mg沒食子酸)。

2.3.3 供試品溶液的制備

分別精密移取以上提取試驗后合并溶液稀釋至1000mL 后的煎煮液，采用0.45μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精 密 量 取“2.3.2”項 下 對 照 品 溶 液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，并將其分別置于25mL 的棕色量瓶中，各加入1mL 的磷鉬鎢酸溶液，然后再分別加入水11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min(以相應(yīng)的試劑為空白)，照紫外—可見分光光度法(《中國藥典》2015 版四部通則0401)，在760 nm 波長下測量吸光度(A)，以溶液濃度(C)(μg)對吸光度(A)進(jìn)行線形回歸，得線形回歸方程：C =270.872 A-8.286(r =0.9996)，線形范圍：25.1～200.8 μg 時線性關(guān)系良好。

2.3.5 樣品的測定

精密量取1mL 的供試品溶液，置于25mL 的棕色量瓶中，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法測定，用外標(biāo)法計算總多酚含量(以沒食子酸計)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

表4 驗證試驗結(jié)果

2.4 收膏率的測定

分別精密移取以上稀釋至1000mL 提取試驗后合并溶液的二十分之一，將其置于干燥恒重的蒸發(fā)皿中，沸水浴上蒸干后，照《中國藥典》2015 版四部通則2201 浸出物測定法，在105℃下干燥3h，取出至干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定，計算收膏率。

2.5 提取工藝優(yōu)選

由表2 極差分析可知，正交試驗中考察因素的影響為：B 提取次數(shù)的影響＞A 加水量的影響＞C 提取時間的影響，但是三種因素均無顯著影響。由表3 方差分析結(jié)果并結(jié)合直觀分析結(jié)果，最終確定提取工藝為A3B3C2，即加水量為12、10、10 倍量，提取3 次，提取時間分別為45、45、45min。

2.6 驗證試驗

取1 倍量的處方藥材投料，按照正交試驗結(jié)果確定的最佳工藝提取，合并提取液。按“2.3.3”項下制備供試品溶液，測定提取液中總酚的含量和收膏率，結(jié)果見表4。從驗證實驗結(jié)果可以看出，3 次平行試驗的總多酚提取率可以達(dá)到最高提取工藝的97.75%，而收膏率可以達(dá)到最高提取工藝的98.07%，說明提取時相關(guān)指標(biāo)提取較穩(wěn)定。結(jié)果表明，該提取方法具有良好的重現(xiàn)性，工藝條件穩(wěn)定、合理、可行。

3 討論

復(fù)方痛風(fēng)顆粒是我院通過臨床實踐擬開發(fā)的純中藥制劑，通過近年來的臨床觀察證明了其臨床療效和促進(jìn)尿酸排泄作用而廣泛用于痛風(fēng)的輔助治療。前期試驗表明白術(shù)內(nèi)脂類成分在復(fù)方中未能檢出，嘗試了總黃酮、總?cè)圃碥找参茨軝z出，后面通過多酚檢測發(fā)現(xiàn)總多酚含量較高，可作為復(fù)方檢測指標(biāo)，且方中紫蘇梗、枇杷葉中均含有一定量的多酚類化合物，具有抗氧化、抗血小板活性、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗炎、保肝和促進(jìn)尿酸排泄作用等[1-2]。

綜合評分法優(yōu)選中藥復(fù)方制劑提取工藝是提高中藥制劑質(zhì)量的重要手段之一。它可以避免單一指標(biāo)對試驗結(jié)果的片面影響，同時還可以更全面、更系統(tǒng)的評價工藝過程，符合中藥復(fù)方制劑多組分、多靶點協(xié)同作用的特點。鑒于總酚為該制劑有效成分之一，在水提取工藝中采用紫外—可見分光光度法測定提取物中總酚的含量，以此評價工藝的優(yōu)劣，其為重要指標(biāo)之一，故權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.6；另將收膏率作為大類成分的間接控制指標(biāo)，考察水提液的得膏量，權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4。目前對復(fù)方痛風(fēng)顆粒劑中總酚酸的提取無相關(guān)報道。本研究采用L9(34)正交試驗及綜合評分法建立的水提取工藝操作簡單、重復(fù)性好、提取效率高，具有較好的代表性和較高的應(yīng)用價值，可為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。