間斷性禁食對高脂飲食誘導的肥胖小鼠糖脂代謝的影響

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥)

鄧亞，楊琍琦

*

0 引言

肥胖的日益流行嚴重威脅世界公共健康[1]。肥胖是基因和環(huán)境相互作用的結果，是能量攝入和消耗不平衡的結果[2]。肥胖可以增加很多疾病如糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病及某些癌癥的發(fā)生風險。治療肥胖的方法包括飲食調節(jié)、運動鍛煉、藥物干預和手術治療。目前，持續(xù)的能量限制，在不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，是一種公認的可以控制體重的飲食治療策略[1]，然而人們很難堅持做到長期不變地限制每日攝食量，此外研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)的能量限制可能會出現(xiàn)循環(huán)中白細胞減少、免疫抑制以及骨密度降低等副作用，阻礙了其大范圍的臨床應用。

近年來，間斷性禁食受到科學界乃至普通大眾及媒體的廣泛關注，它僅要求將禁食時間限定在一天中的一部分，或者一周中的幾天，因而可以避免持續(xù)的能量限制的一些副作用，被認為是其一種安全有效的替代方式[3]。間斷性禁食有多種形式，包括隔日禁食、時間限制性進食、齋月禁食、5：2 飲食法等，但無論何種形式，其基本前提就是進食期間規(guī)律地斷食[4]。高脂飲食誘導的肥胖(high-fat diet-induced obesity，DIO)小鼠是模擬人類食源性肥胖的小鼠模型。本研究對DIO 小鼠進行為期30 天的隔日禁食干預，探討間斷性禁食在不改變飲食結構的情況下，對肥胖個體糖脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼料

45 只雄性3 周齡C57BL/6J 小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)在環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度(50-60)%，12h/12h 明暗交替的動物房內。小鼠飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司，低脂飼料(TP23302)：每1g 飼料提供3.6kcal 的熱量，其中蛋白質占19%，脂肪占10%，碳水化合物占71%；高脂飼料(TP2300)：每1g 飼料提供5.1kcal 的熱量，其中蛋白質占19%，脂肪占60%，碳水化合物占21%。

首先建立DIO 小鼠模型。將所有小鼠隨機分為兩組，一組喂養(yǎng)低脂飼料(n=15)，另一組喂養(yǎng)高脂飼料(n=30)，兩組小鼠自由飲食，在12 周末，當飼喂高脂飼料的小鼠體重超過飼喂低脂飼料小鼠體重的20% 時，再將飼喂高脂飼料組隨機分為HFD+AL 組和HFD+IF 組，每組15 只小鼠。其中HFD+AL 組小鼠繼續(xù)自由進食高脂飼料，HFD+IF 組隔日進食高脂飼料。LFD 組繼續(xù)自由進食低脂飼料。干預時間為30 天。整個實驗期間小鼠可無限量飲水。每日記錄體重和進食量。干預結束后，所有小鼠禁食不禁水12 小時，給予異氟烷麻醉，下腔靜脈采血，留取血標本和肝臟標本。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素染料( 珠海貝索生物技術有限公司，貨號BA-4041)、伊紅染料(珠海貝索生物技術有限公司，貨號BA4024)、Trizol 試劑( 美 國Life technologies 公 司，貨 號15596018)、RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific 公司，貨號K1622)、Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus( 中 國Novoprotein公司，貨號E096-01B)。

血糖測定儀( 羅氏血糖儀)、小鼠糖化血紅蛋白A1c(glycated hemoglobin A1c，HbA1c) ELISA 檢測試劑盒(武漢基因美科技有限公司)、小鼠胰島素ELISA 檢測試劑盒(武漢基因美科技有限公司)、自動脫水機(湖北亞光公司，型號ZT-12M)、石蠟切片機(德國Leica 公司，型號RM2135)、石蠟包埋機( 湖北亞光公司，型號YB-7B)、顯微鏡(日本Olympus 公司，型號BX53)、熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific 公司，型號PIKOREAL 96)。

1.3 經(jīng)腹腔葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test， IPGTT)

在實驗最后一周，小鼠禁食不禁水12h，尾尖采血，用微量血糖儀測定空腹血糖后，每只小鼠腹腔注射20%葡萄糖(2g/kg)，分別檢測腹腔注射葡萄糖后15、30、60、90 和120min 的血糖值，并應用梯形面積法計算血糖- 時間曲線下面積(area under curve，AUC)。

1.4 血指標檢測

圖1 間斷性禁食對小鼠體重和進食量的影響

采用商業(yè)化試劑盒檢測檢測血中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)的濃度以及肝臟組織中TG 的濃度。同時采用ELISA 試劑盒檢測血中HbA1c 和空腹胰島素水平，計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model index of insulin resistance，HOMA-IR)，計算公式為HOMA-IR= 空腹血糖(mmol/L)× 空腹胰島素(mIU/L)/22.5。

1.5 H&E 染色

取固定的肝臟組織，石蠟包埋切片，依次進行蘇木精、伊紅染色，鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學變化。

1.6 實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)

稱取肝臟組織50-100mg，應用TRIzol 法提取組織中的RNA，在基因擴增儀上進行反轉錄獲得cDNA，以cDNA 為模板，配制熒光定量PCR 反應體系，反應條件設置為：95℃反應1min，后進行40 個循環(huán)的95℃反應20s、60℃反應1min。表1 展示了該實驗中所使用的特異性引物序列。本實驗采用2-△△Ct法計算結果。

表1 該實驗中應用的特異性引物

1.7 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學分析應用SPSS 16.0 軟件來實現(xiàn)。正態(tài)分布數(shù)據(jù)結果以均值±標準差的形式表示。組間差異統(tǒng)計學分析應用的是單因素方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用的是最小顯著性差異法(Least significant difference，LSD)。P＜0.05 認為是差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 間斷性禁食對小鼠體重和進食量的影響

經(jīng)過12 周的高脂飼料造模，飼喂高脂飼料的小鼠體重增至(34.68±4.13)g，飼喂低脂飼料的小鼠體重增至(28.68±2.49)g， 二者體重差異超過20%，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，提示DIO 小鼠模型成功建立。自間斷性禁食干預第17 天開始，HFD+IF 組 小 鼠 體 重 顯 著 低 于HFD+AL 組(P＜0.05，圖1A)，自干預的第25 天開始，HFD+IF 組與LFD 組小鼠體重無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。然而，有趣的是，HFD+AL 組和HFD+IF 組30 天的間斷性禁食期間的累積能量攝入量無明顯差異(P＞0.05，圖1B)。

2.2 間斷性禁食對小鼠糖代謝的影響

IPGTT 結果提示HFD+AL 組小鼠在各時間點血糖值均顯著高于LFD 組(P＜0.01)，間斷性禁食顯著降低了15min 和60min 時間點的血糖值(P＜0.05，圖2A)。HFD+IF 組血糖AUC 同樣顯著低 于HFD+AL 組(P＜0.001，圖2B)。HFD+AL 組HOMA-IR 相比LFD 組顯著升高(P＜0.001，圖2C)，間斷性禁食逆轉了這個趨勢(P＜0.05)。HbA1c 反映一段時間內的血糖控制情況，經(jīng)過間斷性禁食后，小鼠HbA1c 水平顯著降低(P＜0.01，圖2D)，且與LFD組無明顯差異(P＞0.05)。

2.3 間斷性禁食對小鼠脂代謝的影響

HFD+AL 組小鼠血清TG，TC 和LDL 水平較LFD 組顯著升高，HDL 水平顯著降低(P＜0.01，圖3A)，間斷性禁食顯著恢復了這些趨勢(P＜0.01)，且TG、LDL 和HDL 的水平已與LFD 組無顯著差異(P＞0.05)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)間斷性禁食也同樣降低小鼠肝臟TG 濃度(P＜0.001，圖3B)。肝臟H&E 染色切片鏡檢結果顯示HFD+AL 組小鼠肝臟發(fā)生顯著的脂肪空泡變性，間斷性禁食明顯改善DIO 小鼠肝臟脂肪變性嚴重程度( 圖3C)。同時，本研究檢測了小鼠肝臟中涉及脂代謝相關基因的表達。脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)as)和膽固醇調節(jié)元件結合蛋白-1(sterolregulatory element binding protein 1，Srebp-1) 是涉及脂質合成的基因，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptor，Ppar)γ 和Cd36 是涉及脂肪酸轉運的基因，肉堿棕櫚?；D移酶(carnitine palmitoyl transferase，Cpt)1α 和Pparα是涉及脂質分解相關的基因。本研究中，HFD+AL 組較LFD 組顯著上調涉及脂質合成的Fas 和Srebp-1 mRNA 的表達(P＜0.001，圖3D)，以及上調涉及脂肪酸轉運的Pparγ 和Cd36 mRNA 的表達(P＜0.001，圖3E)，間斷性禁食逆轉了這個趨勢(P＜0.01)，對于脂解相關的基因，HFD+IF 組較HFD+AL 組顯著降低Cpt1α 和Pparα 相關基因的表達(P＜0.01，圖3F)。

3 討論

間斷性禁食近年來受到人們的廣泛關注，被稱為“下一個減肥熱潮”。它不同于其他治療肥胖的方法，在于它在人群中，特別是某些宗教群體中已經(jīng)實踐了幾個世紀[5]。最近Stekovic 等人[6]對健康的、非肥胖的成年人進行了嚴格的隔日禁食干預，結果發(fā)現(xiàn)干預后健康指標改善，同時發(fā)現(xiàn)干預甚至超過6 個月都沒有副作用的出現(xiàn)，也進一步證實了間斷性禁食干預的安全性。

在當前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)間斷性禁食減輕DIO 小鼠體重，但不減少累積能量攝入量。這與之前Li 等人的研究結果一致[7]。但Liu 等人[8]對DIO 小鼠進行每周不連續(xù)3 日的禁食后發(fā)現(xiàn)，即使小鼠在飲食日可以隨意攝食，但進食高脂飼料的小鼠在飲食日不能攝入足夠的能量以彌補禁食日的虧損，以至于最終的累積能量攝入量減少。此外，一些人群研究也提示大多數(shù)的間斷性禁食策略能夠導致能量攝入總量的減少[4]。為此，Kim 等人[9]設計了一種等熱量的間斷性禁食策略，結果證明間斷性禁食能夠促進代謝平衡，對抗飲食誘導的肥胖和代謝功能障礙，而這些有利影響并不是依賴于能量攝入的減少。

肥胖個體常合并糖耐量受損和胰島素抵抗。在本研究中，間斷性禁食改善DIO 小鼠的糖代謝，主要表現(xiàn)在葡萄糖耐量的改善和胰島素敏感性的增加，以及反映長期血糖控制情況的指標，即HbA1c 的降低，這與之前的很多研究結果一致[10]。最近，Sutton等人[11]開展了首個監(jiān)督控制攝食實驗，對糖尿病前期的男性進行時間限制性進食干預，進食區(qū)間限定在6 小時以內，晚餐設定在下午3 時前，并且在整個實驗期間嚴密監(jiān)督被試者的飲食，雖然該種禁食策略有降低夜間食欲，有助體重減輕的趨勢，但該實驗要求被試者每日攝入足夠的食物以維持體重恒定，結果發(fā)現(xiàn)時間斷性禁食能夠增加胰島素敏感性，改善胰島β 細胞功能，降低氧化應激，并首次提出在人類，這些對糖代謝的有利影響是由間斷性禁食本身所致，而非單獨由體重減輕引起。

圖2 間斷性禁食對小鼠糖代謝的影響

圖3 間斷性禁食對小鼠脂代謝的影響

肥胖的一個主要病理生理改變是脂代謝紊亂，脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓和膽石癥等的發(fā)生密切相關。在該研究中，間斷性禁食顯著改善DIO 小鼠的脂代謝紊亂，這主要體現(xiàn)在血脂水平紊亂的改善以及肝臟脂肪變性的減輕。此外本研究檢測了小鼠肝臟中涉及脂質合成、轉運和分解相關的基因。Fas是脂肪酸合成的關鍵的限速酶， Srebp1 幾乎參與所有肝臟甘油三酯和脂肪酸合成的轉錄。Pparγ 可促進肝臟脂質攝取和脂滴形成，Cd36 是Pparγ 下游靶基因，是一種游離脂肪酸轉運體，負責從循環(huán)中攝取脂肪酸。DIO 小鼠表現(xiàn)出一個傾向脂肪變性的肝臟代謝，即肝臟中涉及脂質合成、轉運相關的以上基因表達增加，間斷性禁食干預逆轉了這個趨勢。這與之前Chung 等人[12]的研究結果有類似之處，他們是對絕經(jīng)后的肥胖小鼠模型進行了時間限制性進食干預，結果發(fā)現(xiàn)時間限制性進食的小鼠盡管與自由飲食的小鼠攝入同等量的高脂飼料，其肝臟脂質沉積卻明顯減輕，他們對此結果提出了一個可能的解釋，即延長的禁食期促使小鼠將脂質的氧化代謝作為一個主要的能量來源，致使肝臟停止脂質的合成，增加脂質的氧化，進而有效地清除和預防肝臟的脂肪變性。但不同的是，在我們的研究中，間斷性禁食未顯著增加肝臟中與脂解相關基因的表達，其中Cpt1α 是肝臟長鏈脂肪酸β 氧化的關鍵調節(jié)酶，PPARα 可調節(jié)脂肪酸分解和線粒體β 氧化。這可能因為檢測的基因種類過少，在后續(xù)的實驗中應增加與肝臟脂解相關的其他通路的基因檢測。

然而，間斷性禁食減輕肥胖和相關代謝性疾病發(fā)生的機制仍不是很清楚，目前的研究推測可能與晝夜節(jié)律、腸道菌群和米色脂肪等有關[4，7，9]。本研究的局限性在于，本研究僅涉及動物實驗，結論不能直接外推至人群。此外本研究僅涉及間斷性禁食的一種形式，即隔日禁食，不能直接外推至其他形式如時間限制性進食、5：2飲食法、齋月禁食等。

4 結論

本研究證實了在沒有任何能量攝入差異的情況下，間斷性禁食能夠對飲食引起的肥胖和代謝功能障礙產(chǎn)生有益的作用，為進一步的臨床研究提供依據(jù)。