Wistar 大鼠膽管結(jié)扎型肝硬化模型的建立及肝組織病理學(xué)分析

王子航，王慧君，田全發(fā)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特)

0 引言

我國(guó)是肝硬化大國(guó)，肝硬化是各種致病因素長(zhǎng)期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害。國(guó)內(nèi)研究者大多采用腹腔注射CCL4 或者二甲基硝胺以及硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝硬化的形成，但由于其存在藥物毒性、價(jià)格昂貴及形成周期長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，我們?yōu)榱藢で笠环N安全，價(jià)格低廉，形成周期短并更適用于實(shí)驗(yàn)操作的動(dòng)物模型。通過(guò)國(guó)外文獻(xiàn)的學(xué)習(xí)，建立了大鼠膽管結(jié)扎致使膽汁淤積而造成肝細(xì)胞損害來(lái)誘導(dǎo)肝硬化形成的模型[1]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)雌性Wistar 大鼠，體重180～240g，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)(6 只/籠)，于室溫及光照時(shí)間12 小時(shí)下自由攝食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，分組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前12 小時(shí)禁食，不禁水，各項(xiàng)操作嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理?xiàng)l例。

1.2 方法

雌性Wistar 大鼠隨機(jī)分為兩組，假手術(shù)組及模型組，每組30只。造模方法：術(shù)前禁食12 小時(shí)。模型組：大鼠5%水合氯醛按10mL/kg 腹腔麻醉后，仰臥手術(shù)臺(tái)，固定四肢，胸腹部去毛消毒，逐層沿腹正中線打開(kāi)腹腔，沿十二指腸起始端找到膽總管(圖3)，游離膽總管并于距十二指腸0.5cm 及1cm 處結(jié)扎兩根絲線(3-0)，并于結(jié)扎線中間剪斷膽管，關(guān)腹[1]。假手術(shù)組：麻醉后打開(kāi)腹腔，游離膽管，關(guān)腹。術(shù)后1 天糖水飼養(yǎng)，術(shù)后2 天，自由進(jìn)食。于4，6，8 周為時(shí)間點(diǎn)行肝葉病理檢查及下腔靜脈取血肝功檢測(cè)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

(1)大鼠一般情況：大鼠皮毛光澤，食欲，活動(dòng)、腹部變化及死亡情況；(2)3 時(shí)間點(diǎn)大鼠體重；(3)血清中的肝功能檢測(cè)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；總膽紅素(T-BIL)以及直接膽紅素(D-BIL)：大鼠下腔靜脈采血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；(4)肝臟大體形態(tài)觀察及病理學(xué)檢測(cè)，取肝左外葉，多聚甲醛(4%)固定，石蠟包埋，切片。行HE 及Massion 染色，由病理醫(yī)生在不知道標(biāo)本處于哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)的情況下使用病理顯微鏡觀察肝臟病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，多組比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 建模成功率的統(tǒng)計(jì)

30 只膽管結(jié)扎大鼠中，建模成功24 只，死亡6 只，其建模成功率80%，死亡6 只均進(jìn)行尸檢，2 只死于膽瘺，2 只死于急性肝損傷，2 只意外死亡。假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡，正常存活8 周。

2.2 大鼠一般情況

觀察建模大鼠1-2 周間無(wú)明顯變化，4 周后毛發(fā)不順，飲食飲水稍減少，體重較前有所減輕。6 周后毛發(fā)凌亂無(wú)光澤，食欲差，精神萎靡活動(dòng)少，外界刺激反應(yīng)慢，眼耳尾部可見(jiàn)明顯黃染，體重增長(zhǎng)緩慢(表1)。假手術(shù)組大鼠無(wú)明顯改變，體重逐漸增長(zhǎng)。

2.3 大鼠肝臟外觀改變

假手術(shù)組的肝臟表面呈紅色，質(zhì)地柔軟且富有彈性，無(wú)腹水。膽管結(jié)扎4 周后肝臟明顯腫大，質(zhì)地較硬，呈黃褐色，膽管結(jié)扎處以上膽管增寬(圖1)。6 周大鼠肝臟表面可見(jiàn)細(xì)小顆粒狀結(jié)節(jié)，形成典型肝硬化外觀，肝臟黃褐色進(jìn)一步加深，有腹水，膽管結(jié)扎處以上膽管增寬約10 倍，見(jiàn)圖2。8 周肝臟表面布滿顆粒狀結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，腹水較多( 圖4)。我們也制備12 周大鼠( 圖5)，大鼠膽管增寬明顯，淡黃色腹水大量，肝臟由黃變黑，質(zhì)硬易出血，但大鼠存活困難，死亡率較高。

2.4 血清生化指標(biāo)的變化

ALT 及AST 水平自4 周后開(kāi)始檢測(cè)后呈逐漸升高趨勢(shì)，TBil及DBil 于BDL 術(shù)后4 周、6 周、8 周均呈現(xiàn)較高水平且隨時(shí)時(shí)間延長(zhǎng)其指標(biāo)無(wú)明顯變化(表2)。

表1 大鼠體重變化情況

表2 膽管結(jié)扎大鼠生化學(xué)指標(biāo)變化

表2 膽管結(jié)扎大鼠生化學(xué)指標(biāo)變化

組別 n ALT AST TBIL DBIL 4 周 8 80.38±4.27 350.63±22 88.25±6.53 94.63±3.16 6 周 8 74.5±3.74 301.75±11.85 87±9.79 95.63±3.28 8 周 8 72.8±2.69 300.75±9.98 87.86±7.66 95.25±6.65

圖1 示：箭頭指示4 周膽管結(jié)扎處明顯增大。

圖2 示：6 周大鼠肝臟外觀及膽管結(jié)扎處增寬約10 倍。

圖3 示：箭頭指示行膽管結(jié)扎術(shù)及正常大鼠膽管。

圖4 示：箭頭指示8 周膽管結(jié)扎以上膽管增寬；肝臟大致觀布滿呈顆粒狀結(jié)節(jié)，肝臟質(zhì)硬，易出血，腸系膜及網(wǎng)膜靜脈曲張淤血。

2.5 大鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

肝硬化組及假手術(shù)組的大鼠進(jìn)行HE 染色，病理結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，呈正常肝組織結(jié)構(gòu)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，第4 周HE 染色的切片(圖6)中可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)輕微破壞，肝組織結(jié)構(gòu)受損，肝細(xì)胞腫脹明顯，存在大量的脂肪變性并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，假小葉形成。第6 周HE 染色的切片( 圖7) 中可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，肝細(xì)胞出現(xiàn)大片狀變形，壞死，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并已形成典型假小葉。第8 周HE 染色(圖8)可見(jiàn)肝小葉被完全破壞，膠原增粗，大量的膠原纖維沉積于增生的膽管周?chē)?，隨著膠原沉積加劇，肝硬化越來(lái)越嚴(yán)重，纖維面積增加，并出現(xiàn)彌漫性膽管增生，膽小管增生嚴(yán)重。

3 討論

圖5 示：箭頭指示為12 周膽管結(jié)扎術(shù)增寬的膽管；肝臟進(jìn)一步由黃變黑，淡黃色腹水大量。

圖6 示：膽管結(jié)扎4 周后大鼠左外葉病理學(xué)切片

圖7 示：膽管結(jié)扎6 周后大鼠左外葉病理學(xué)切片

圖8 示：膽管結(jié)扎8 周后大鼠左外葉病理學(xué)切片

肝硬化是多種肝病反復(fù)作用的病理生理改變，我國(guó)是肝硬化大國(guó)，目前診斷肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)是肝穿刺病理學(xué)活檢，但穿刺活檢屬有創(chuàng)檢查[2-3]。血清學(xué)檢查由于不敏感或特異性低，仍被認(rèn)為具有較大局限性[4-5]。這就體現(xiàn)對(duì)于肝硬化的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究是具有重要的科研價(jià)值。而建立有效的，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的肝硬化模型是研究肝硬化的發(fā)生機(jī)制及進(jìn)展過(guò)程的前提。綜合文獻(xiàn)中所提及多種的肝硬化造模方法，每種誘導(dǎo)肝硬化的機(jī)制不同，所造成的病理生化改變也不盡相同[6]。隨著肝損傷研究的不斷深入，選擇合適的動(dòng)物模型顯得越來(lái)越重要。目前肝損傷的動(dòng)物模型以大鼠，小鼠和大白兔為主，也有犬類(lèi)和獼猴。根據(jù)病源可分為病毒性肝損傷，化學(xué)毒性肝損傷和膽道梗阻性肝損傷等，在本實(shí)驗(yàn)之前的研究中，已建立較完善的四氯化碳制備豬肝硬化模型[7]，期間一直使用了最經(jīng)典的動(dòng)物模型之一，四氯化碳(CCL4)模型。隨著研究的不斷深入，前人已發(fā)現(xiàn)選藥物在不同的肝損傷模型中可能會(huì)出現(xiàn)不同的效果和作用機(jī)理[8]。因此，在本文中，為了研究膽道梗阻情況下的肝臟病理變化，我們選用了另外一種經(jīng)典的動(dòng)物模型，大鼠膽管結(jié)扎(BDL)模型。

文獻(xiàn)介紹最多的2 種方法即腹腔CCL4 注射和BDL 法建立肝硬化模型，這兩種大鼠肝硬化模型被認(rèn)為是較理想的動(dòng)物模型[9]。作者采用的BDL 法，大鼠膽管結(jié)扎肝硬化模型主要通過(guò)結(jié)扎大鼠肝部腹下方的總膽管(大鼠無(wú)膽囊)，引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力增高，并可引發(fā)肝內(nèi)膽小管擴(kuò)張破裂，由于肝內(nèi)血管受到擴(kuò)張膽管的壓迫及膽汁外滲，肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生缺血和壞死，膠原組織大量沉積，纖維組織大量增生并向膽管伸展，包圍肝小葉并散布于肝細(xì)胞周?chē)?，隨著肝纖維化的加深，最終形成肝硬化[10-11]。我們對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行病理切片分析，BDL 后4 周大鼠肝組織鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹明顯并出現(xiàn)壞死，匯管區(qū)增大，膠原纖維沉積，此時(shí)肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，但存在大量的脂肪變性，此時(shí)假小葉形成。第6 周的切片中可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞明顯，出現(xiàn)明顯的膠原纖維增生，形成典型假小葉。第8 周鏡下可見(jiàn)彌漫性的肝小葉破壞，大量的膠原沉積在增生的膽管細(xì)胞周?chē)懶」茉錾鷩?yán)重，肝硬化加重明顯。通過(guò)對(duì)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肝組織病例分析，我們認(rèn)為BDL 術(shù)后6 周即可形成肝硬化模型。通過(guò)病理HE 染色，6 周后的大鼠肝臟就已經(jīng)形成典型的假小葉結(jié)構(gòu)。BDL 法肝硬化模型組大鼠在術(shù)后早期即可見(jiàn)小膽管的明顯增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，晚期出現(xiàn)肝細(xì)胞變性壞死，且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維間隔同時(shí)存在。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了文章[6]的描述，本實(shí)驗(yàn)BDL 法的肝硬化模型組大鼠血清TBil 和DBil 水平明顯升高，前已述及，BDL 肝纖維化模型是通過(guò)結(jié)扎膽總管而誘導(dǎo)的肝硬化模型，而同時(shí)TBil 及DBil是反映膽道梗阻情況的指標(biāo)，故在術(shù)后4 周即達(dá)到高值并且后期無(wú)明顯變化。ALT 和AST 反映肝細(xì)胞損傷情況，與肝組織的炎癥程度有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中BDL 法肝纖維化模型組早期ALT 和AST 即上升到高值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT 及AST 逐漸升高，并呈高水平。

綜上，我們認(rèn)為BDL 法制備大鼠肝硬化模型造模成功率較高，用時(shí)較短，其主要模擬的是急性肝損傷的過(guò)程，造模所用時(shí)間較短，肝細(xì)胞脂肪變性少，類(lèi)型人的膽汁淤積性肝硬化[3]。但需要指出的是，結(jié)扎膽總管的方法死亡率較高，因其模擬肝臟急性損傷的過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)術(shù)后死亡2 例，考慮死亡原因?yàn)榧毙愿螕p傷致肝臟衰竭。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)急性肝損傷主要發(fā)生在膽管結(jié)扎后的第1 周內(nèi)，在此過(guò)程中或之后及幾天中，動(dòng)物會(huì)因此出現(xiàn)死亡。

通過(guò)病理學(xué)的分析，證實(shí)了BDL 法是可靠的建模方法，并且較系統(tǒng)的描述了4-8 周的肝組織病理學(xué)變化，著重描述了在病理切片中大鼠肝組織的發(fā)展進(jìn)程。文獻(xiàn)中指出了在動(dòng)物經(jīng)歷過(guò)急性肝損傷后，在膽管結(jié)扎1 周后，肝臟出現(xiàn)肝纖維化，并且在第2周時(shí)纖維化到達(dá)一個(gè)平臺(tái)期，一直持續(xù)到第6 周[12]。我們可以從病理學(xué)的表現(xiàn)看出，BDL 法制備的肝硬化模型，4 周即有假小葉形成，6 周可出現(xiàn)典型的假小葉結(jié)構(gòu)，此時(shí)我們認(rèn)為肝硬化建模成功，當(dāng)8 周后的肝硬化表現(xiàn)愈發(fā)明顯。但需要指出的是，BDL 法制備肝硬化模型病因其為模擬急性肝損傷，此時(shí)如再進(jìn)行肝切除試驗(yàn)或者其他手術(shù)試驗(yàn)，可能會(huì)增加大鼠肝臟發(fā)生衰竭的幾率，我們今后可以通過(guò)建立成功的膽管結(jié)扎型肝硬化大鼠模型，研究肝硬化大鼠肝切除量與肝衰竭的關(guān)系，探討肝硬化大鼠肝臟切除量與肝衰竭的量化關(guān)系。