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      PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞的表達(dá)及其與卵泡液孕激素含量的關(guān)系研究

      2020-05-23 09:20:08孟金柱趙成剛羅碧秀趙園園
      河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年5期
      關(guān)鍵詞:細(xì)胞層顆粒細(xì)胞蛋雞

      孟金柱,趙成剛,羅碧秀,趙園園

      (1.銅仁學(xué)院,貴州 銅仁 554300; 2.遙山溝生態(tài)種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社,貴州 銅仁 554300)

      禽類的卵泡發(fā)育是一個連續(xù)性過程,且具有優(yōu)先性。根據(jù)卵泡直徑的大小及其功能,可以分為等級卵泡和等級前卵泡[1]。等級卵泡,也稱為排卵前卵泡,按照大小排列依次為F1、F2、F3、F4、F5…,最大直徑能達(dá)到40 mm[2]。等級前卵泡則又被分為小白卵泡(SWF,直徑為1~2 mm)、大白卵泡(LWF,直徑為3~5 mm)、小黃卵泡(SYF,直徑為6~8 mm)和大黃卵泡(LYF,直徑為9~12 mm)[3]。在這些等級前卵泡中,只有少部分卵泡可以被成功選擇進(jìn)入等級卵泡序列,而直徑范圍在6~8 mm的SYF又是卵泡在選擇過程中能否優(yōu)先進(jìn)入等級的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[4]。

      與哺乳動物相比,禽類卵泡類固醇合成系統(tǒng)較為簡單,顆粒細(xì)胞的主要功能是分泌孕激素(P4),而膜細(xì)胞則負(fù)責(zé)分泌雌激素和雄激素[5-6]。這與哺乳動物卵泡顆粒細(xì)胞合成雌激素(E2),膜細(xì)胞為顆粒細(xì)胞合成雌激素提供前體物質(zhì)(雄激素)有所不同[7]。顆粒細(xì)胞內(nèi)存在多種受體,在卵泡的生長發(fā)育過程中具有重要的作用。若生長、分化出現(xiàn)異常,會導(dǎo)致多囊卵巢綜合征、卵巢早衰等疾病[8]。

      絲氨酸蛋白酶23(PRSS23)屬于絲氨酸蛋白酶(Serine protease)40個家族中的胰蛋白酶家族。通過MCF-7/BUS細(xì)胞轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn),PRSS23mRNA的表達(dá)是通過雌激素誘導(dǎo)的[9]。DIAO等[10]研究表明,PRSS23對小鼠卵巢發(fā)育有負(fù)調(diào)控作用,可引起小鼠卵泡閉鎖。CHAN等[11]研究發(fā)現(xiàn),PRSS23mRNA在小鼠卵泡的顆粒細(xì)胞和排卵前卵巢的間質(zhì)細(xì)胞、膜細(xì)胞以及閉鎖卵泡中表達(dá)量較高,進(jìn)一步肯定了PRSS23對小鼠卵泡的閉鎖起促進(jìn)作用。

      目前,關(guān)于PRSS23在大型哺乳動物及禽類卵泡中的功能及作用機(jī)制研究尚未見報道。筆者所在課題組前期擴(kuò)增了蛋雞卵泡PRSS23mRNA CDS全序列,分析了該序列的三級結(jié)構(gòu),并進(jìn)行信號肽預(yù)測[12]。為此,通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位,采用熒光定量PCR技術(shù)對PRSS23mRNA在其卵泡顆粒細(xì)胞中的相對表達(dá)情況進(jìn)行分析,同時通過ELISA技術(shù)對卵泡液中的P4進(jìn)行測定,旨在探明PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)位置及其mRNA在不同大小卵泡中的表達(dá)與卵泡液P4含量的關(guān)系,為進(jìn)一步研究其在蛋雞卵泡中的功能奠定基礎(chǔ)。

      1 材料和方法

      1.1 試驗(yàn)動物及樣品采集

      在遙山溝生態(tài)種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社(貴州銅仁),選取5只健康土母雞宰殺后,分別獲取卵巢并剪下直徑為3~5 mm的LWF和直徑為6~8 mm的SYF,用于免疫組織化學(xué)分析;分別剪下直徑為1~2、3~5、6~8、9~12 mm的卵泡,抽取卵泡液用于P4含量測定,剩余部分刮取顆粒細(xì)胞用于總RNA提取。

      1.2 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對PRSS23進(jìn)行組織定位

      剪下LWF和SYF,分別放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h后,用70%的乙醇溶液清洗。分別經(jīng)梯度乙醇(含量遞增)脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片(厚度為5 μm)、攤片、烤片后制成切片。將制成的切片放入60 ℃的恒溫箱中烘烤3 h,經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇(含量遞減)脫蠟后,滴加3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶,并滴加復(fù)合消化酶修復(fù)抗原;滴加5% 的牛血清白蛋白(BSA)常溫下靜置30 min后,試驗(yàn)組滴加兔抗PRSS23一抗(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司,1∶1 000稀釋),對照組滴加正常兔血清(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司),4 ℃過夜。經(jīng)37 ℃恒溫箱復(fù)溫30 min,PBS沖洗,滴加鼠抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司),常溫孵育30 min,PBS沖洗,DAB(武漢博士德生物工程有限公司)顯色5 min,蒸餾水沖洗,蘇木精復(fù)染60 s,梯度乙醇(含量遞增)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,通過顯微鏡(Leica公司,德國)采集照片。

      1.3 總RNA提取及實(shí)時熒光定量PCR分析

      將1.1中剪下的SWF、LWF、SYF、LYF,用1 mL注射器抽取卵泡液后,分別在生理鹽水中沖洗直至卵黃被清洗干凈,使用細(xì)胞刮刀刮取位于卵泡內(nèi)膜上的顆粒細(xì)胞用于總RNA提取。

      用Trizol試劑(Invitrogen公司,美國)分別提取5只雞不同大小卵泡顆粒細(xì)胞的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,具體反應(yīng)條件為:42 ℃孵育15 min,85 ℃加熱5 s。使用GAPDH作為內(nèi)參基因,在線NCBI設(shè)計引物(表1),由上海生工生物有限公司合成。

      表1 供試引物序列

      根據(jù)北京全式金產(chǎn)品使用說明書構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系: 2×TransStart?Tip Green qPCR Super-Mix 10 μL, 上游引物0.4 μL ,下游引物0.4 μL,cDNA 4 μL(100 ng),RNase-free H2O 5.2 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,45個循環(huán)。使用2-△△CT法計算PRSS23基因的相對表達(dá)量。

      1.4 卵泡液中孕激素含量的測定

      使用P4含量ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)分別對雞SWF、LWF、SYF、LYF卵泡液中P4含量進(jìn)行測定,酶標(biāo)儀讀取波長450 nm處的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的含量所對應(yīng)的OD450建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品中的含量。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 PRSS23在蛋雞卵泡內(nèi)的免疫組織化學(xué)分析

      通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位,結(jié)果表明,PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá),且在SYF顆粒細(xì)胞層表達(dá)量最高(圖1)。

      A:SYF陰性對照;B:SYF試驗(yàn)組;C:LWF陰性對照; D:LWF試驗(yàn)組;GC:顆粒細(xì)胞層;TC:膜細(xì)胞層;CC:卵丘細(xì)胞A:Negative control of SYF;B:Experiment group of SYF;C:Negative control of LWF;D:Experiment group of LWF;GC:Granulosa cells layer;TC:Theca cells layer;CC:Cumulus cells圖1 PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)(200×)

      2.2 PRSS23基因mRNA在蛋雞不同大小卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)差異分析

      通過實(shí)時熒光定量PCR對PRSS23基因在蛋雞不同大小卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖2)表明,PRSS23基因mRNA在SYF中的含量顯著高于其他卵泡(P<0.05),而在SWF、LWF、LYF顆粒細(xì)胞中的含量差異不顯著(P>0.05)。

      2.3 蛋雞不同大小卵泡卵泡液中P4含量

      通過標(biāo)準(zhǔn)品的含量對應(yīng)的OD450來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.7x2+10.0x+6.8,R2為0.989 3(圖3)。從圖4可以看出,P4在SYF卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液(P<0.05),而在SWF、LWF、LYF卵泡液中的含量差異則不顯著(P>0.05)。

      不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同

      圖3 P4含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

      3 結(jié)論與討論

      蛋雞為了維持其產(chǎn)蛋序列等級卵泡中每天有1個卵泡可以排卵,超過99% 的卵泡在發(fā)育過程中的不同時期走向閉鎖,等級前卵泡被成功選擇進(jìn)入等級卵泡序列,是維持等級卵泡排卵規(guī)律的重要標(biāo)志[13]。在這個過程中,多種激素和細(xì)胞因子共同調(diào)控旁分泌和自分泌,從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和分化及子宮內(nèi)膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的成熟,最終排卵[14]。直徑在6~8 mm的SYF是卵泡在選擇過程中優(yōu)先進(jìn)入等級還是走向閉鎖的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[4]。本研究選用LWF和SYF 2種卵泡,發(fā)現(xiàn)PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá),在SYF顆粒細(xì)胞層表達(dá)量最高,同時在SYF中的表達(dá)量也要高于LWF,這表明PRSS23可能在蛋雞卵泡發(fā)育過程中起了重要的作用。

      在動物體內(nèi),PRSS是一種通過對蛋白酶原的激活或抑制來參與蛋白質(zhì)的降解和合成的重要蛋白水解酶類[15]。它主要的生物學(xué)功能是通過絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitor)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、組織重建、血管形成、胚胎發(fā)育和病原侵入等過程[16],因此,可以看出PRSS是生物體維持正常生命活動過程中重要的蛋白質(zhì)。WAHLBERG等[17]通過基因芯片技術(shù)對處于排卵期的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),PRSS23基因表達(dá)量相對較高,且通過促性腺激素下調(diào)基因表達(dá)。進(jìn)一步研究PRSS23基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),PRSS23基因在閉鎖卵泡中表達(dá)水平最高,而在排卵卵泡中則定位到卵泡膜細(xì)胞層和卵巢基質(zhì)[18]。WAHLBERG等[17]認(rèn)為,PRSS23可能會抑制卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,從而導(dǎo)致卵泡閉鎖。關(guān)于PRSS23在家禽中的研究尚未見報道。本研究表明,PRSS23基因在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞中有表達(dá),且在SYF中表達(dá)量顯著高于其他等級前卵泡。提示PRSS23在卵泡進(jìn)入等級還是走向閉鎖這個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中發(fā)揮著重要作用。

      在蛋雞卵泡液中的激素含量會隨著卵泡的發(fā)育處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)。在8 mm以下的卵泡中顆粒細(xì)胞還處于未分化狀態(tài),P4的含量較少,到卵泡發(fā)育到8 mm左右,已經(jīng)分化的顆粒細(xì)胞開始迅速合成P4,直至排卵[19]。卵泡選擇會引起顆粒細(xì)胞的分化以及卵泡發(fā)育,而在調(diào)控卵泡發(fā)育的過程中,顆粒細(xì)胞中的信號通路又會占主導(dǎo)作用[20]。本研究通過ELISA法對不同大小等級前卵泡卵泡液中的P4進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)P4在SYF卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液,推測PRSS23在SYF中可能會促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成P4,從而影響卵泡的選擇。

      綜上,PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá),在SYF顆粒細(xì)胞層表達(dá)量最高;PRSS23mRNA在SYF中的含量顯著高于其他卵泡;P4在SYF卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液。

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