萊氏綠僵菌Nr0815分生孢子在化學(xué)農(nóng)藥中的相容性

杜廣祖,張小嬌,羅 艷,陳 斌,張立敏,2

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國際學(xué)院，云南 昆明 650201)

萊氏綠僵菌作為昆蟲病原真菌的一種，在田間發(fā)生流行普遍，寄主范圍廣泛，特別是對夜蛾類害蟲(甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等)具有很強(qiáng)的致病力，是極具開發(fā)利用潛力的蟲生真菌。但與其他蟲生真菌一樣，該菌在田間易受外界環(huán)境的影響，自然流行易受抑制。目前，化學(xué)農(nóng)藥仍是防治害蟲的重要制劑，因此，化學(xué)農(nóng)藥也成為影響昆蟲病原真菌在害蟲種群內(nèi)自然流行的重要因素之一[1]。真菌孢子對農(nóng)藥的敏感性與菌株種類、農(nóng)藥品種和使用濃度有關(guān)[2-3]，若兩者能相容，既能大幅度降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，達(dá)到增效作用[3-4],又能減緩或克服害蟲抗藥性的產(chǎn)生[5]。據(jù)報道，已有多種化學(xué)殺蟲劑與昆蟲病原微生物殺蟲劑進(jìn)行混配用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治，并取得了良好的防治效果[6-8]。昆蟲病原真菌從接觸寄主、孢子萌發(fā)到侵入昆蟲體壁后在昆蟲體內(nèi)繁殖消耗寄主體內(nèi)營養(yǎng)，至引起昆蟲的死亡，需要一定的時間，因此，與化學(xué)農(nóng)藥的作用時效相比，其侵染致病具有時滯效應(yīng)，這也是影響蟲生真菌制劑殺蟲效果及推廣應(yīng)用的重要因素之一。

對昆蟲病原真菌與化學(xué)農(nóng)藥的相容性及其增效作用的研究一直是昆蟲病原真菌開發(fā)研究的重要內(nèi)容。鑒于此，選擇在田間發(fā)生流行較強(qiáng)的萊氏綠僵菌菌株Nr0815，通過研究市場常用化學(xué)農(nóng)藥對該菌分生孢子萌發(fā)、菌絲生長、產(chǎn)孢量的影響等，明確萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子在常見化學(xué)農(nóng)藥中的相容性，并篩選出與萊氏綠僵菌菌株Nr0815具有相容性的化學(xué)農(nóng)藥，為縮短該菌對害蟲侵染致病的時滯效應(yīng)、利用該菌進(jìn)行害蟲防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 萊氏綠僵菌菌株Nr0815，分離自云南省昆明市晉寧縣花椰菜田中的罹病銀紋夜蛾蟲體，室內(nèi)純化后保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 供試農(nóng)藥 供試農(nóng)藥包括除草劑2種(68%草甘膦銨鹽可溶粒劑、200 g/L百草枯水劑)、殺菌劑3種(75%百菌清可濕性粉劑、80%多菌靈可濕性粉劑、65%代森鋅可濕性粉劑)、殺蟲劑2種(24%滅多威可溶液劑、20%甲氰菊酯乳油)，均為市售產(chǎn)品。參考李增智等[9]和花立民[10]的方法，每種供試化學(xué)農(nóng)藥測定3種質(zhì)量濃度，包括A：田間最大推薦使用質(zhì)量濃度(以下稱推薦質(zhì)量濃度)；B：田間最大推薦使用質(zhì)量濃度的5倍稀釋液；C：田間最大推薦使用質(zhì)量濃度的10倍稀釋液。以清水作為對照(CK)。各化學(xué)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度見表1。

表1 供試化學(xué)農(nóng)藥相關(guān)信息Tab.1 Chemical pesticides tested in this study

1.2 試驗方法

1.2.1 供試農(nóng)藥對孢子萌發(fā)的影響 先將配制好的化學(xué)農(nóng)藥滴入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的小孔穴中，在各質(zhì)量濃度藥液中加入等量的含5%蔗糖的菌懸液(2.1×107個/mL)，并調(diào)到所需質(zhì)量濃度。然后在培養(yǎng)皿底墊1層打濕的濾紙，并在其上放1張載玻片，在載玻片中央交叉放置另1張潔凈載玻片，上鋪1張用打孔器均勻打有 4個小孔的濾紙條。最后將配制好的農(nóng)藥和菌懸液的混合液分別滴入4個孔中，蓋好皿蓋，25 ℃下保濕培養(yǎng)，每處理重復(fù) 3 次。分別于24、48、72 h后取出培養(yǎng)皿，依次鏡檢各處理的孢子萌發(fā)情況，以不加農(nóng)藥的菌懸液為對照。每處理觀察300個孢子。孢子的萌發(fā)率=萌發(fā)數(shù)/觀察總數(shù)×100%。

1.2.2 供試農(nóng)藥對菌絲生長的影響 參考徐艷聆等[11]的方法，分別吸取1 mL供試農(nóng)藥稀釋液于培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入9 mL融化后冷卻至45 ℃左右的SDAY培養(yǎng)基，迅速旋轉(zhuǎn)，充分混勻，冷卻凝固制成含藥平板。將直徑為5 mm的菌餅接入含藥平板中心，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，以加入無菌水的培養(yǎng)基為對照。每處理重復(fù)3次。

抑制率=(對照培養(yǎng)皿菌落直徑-加藥培養(yǎng)皿菌落直徑)/對照培養(yǎng)皿菌落直徑×100%。

1.2.3 供試農(nóng)藥對產(chǎn)孢量的影響 將供試菌株分別接種至含有不同農(nóng)藥的培養(yǎng)平板上，(25±1)℃條件下培養(yǎng)14 d后用直徑5 mm的打孔器距平皿邊緣等距處隨機(jī)打取3 塊菌塊，加入200 mL含0.05%吐溫-80的無菌水中，制成孢子懸浮液。用快速混勻器振蕩5 min,使孢子充分分散。用紗布過濾，逐步稀釋100倍。在蓋好蓋玻片的血球計數(shù)板上，用微量移液槍吸取孢子懸浮液，在光學(xué)顯微鏡下檢查并計數(shù)。每個處理重復(fù)3次，取其平均值，按下述公式計算產(chǎn)孢量(孢子粉含孢量)：

產(chǎn)孢量=平均每小格孢子數(shù)×400×10 000×稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

孢子萌發(fā)率、菌絲生長抑制率、產(chǎn)孢量的差異利用SPSS 20.0軟件分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，與對照相比，各供試農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子的萌發(fā)具有不同程度的抑制作用，加入各農(nóng)藥后其分生孢子的萌發(fā)率均在50%以下；同一農(nóng)藥隨著處理質(zhì)量濃度的降低其抑制作用均呈現(xiàn)減弱的趨勢，且在處理后24～72 h隨著時間的推移孢子萌發(fā)率均呈現(xiàn)不同程度的增長；同一時間、同種質(zhì)量濃度下不同化學(xué)農(nóng)藥間孢子萌發(fā)率均存在顯著性差異(24 h時，A：F=1 228.83,P=0.00；B：F=1 270.90,P=0.00；C：F=964.13,P=0.00。48 h時，A：F=1 408.71,P=0.00；B：F=743.43,P=0.00；C：F=263.39,P=0.00。72 h時，A：F=382.60,P=0.00；B：F=640.97,P=0.00；C：F=317.03,P=0.00)。

表2 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)的影響Tab.2 Effect on conidia germination of M.rileyi stain Nr0815 by chemical pesticides

續(xù)表2 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)的影響Tab.2(Continued) Effect on conidia germination of M.rileyi stain Nr0815 by chemical pesticides

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示不同農(nóng)藥同一質(zhì)量濃度下差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度下差異顯著(P<0.05)。

Note：Different capital letters in the same column indicate significant difference among different pesticides treatments at the same concentration(P<0.05),different small letters in the same column indicate significant difference among different concentration treatments of the same pesticide(P<0.05).

加入農(nóng)藥后24 h時，對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)率的測定結(jié)果表明，各農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)均具有明顯的影響，分生孢子萌發(fā)率顯著低于對照(表2)。其中，68%草甘膦銨鹽可溶粒劑對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)的影響最小，孢子萌發(fā)率均高于在其余大部分農(nóng)藥中的萌發(fā)率，在68%草甘膦銨鹽可溶粒劑推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中分生孢子萌發(fā)率分別為(6.45±0.40)%、(8.44±0.68)%、(8.89±0.73)%。其次是200 g/L百草枯水劑處理，在推薦質(zhì)量濃度、5倍和10倍稀釋液中分生孢子萌發(fā)率分別為(5.89±0.59)%、(6.56±0.48)%、(7.67±0.19)%。而在75%百菌清可濕性粉劑中，萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)率最低，在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中分生孢子萌發(fā)率分別為(1.22±0.11)%、(1.44±0.11)%、(1.67±0.19)%。從供試農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度下萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)率差異來看，萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)率在75%百菌清可濕性粉劑(F=2.40,P=0.17)和24%滅多威可溶液劑(F=0.15,P=0.86)2種農(nóng)藥中無顯著性差異，其余5種化學(xué)農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度間均存在顯著性差異[200 g/L百草枯水劑(F=6.48,P=0.03)、68%草甘膦銨鹽可溶粒劑(F=5.49,P=0.04)、65%代森鋅可濕性粉劑(F=65.58,P=0.00)、80%多菌靈可濕性粉劑(F=30.45,P=0.00)、20%甲氰菊酯乳油(F=29.22,P=0.00)]。

加入農(nóng)藥后48 h時，對萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)率的測定結(jié)果表明，相同濃度下，68%草甘膦銨鹽可溶粒劑和200 g/L百草枯水劑處理中萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子萌發(fā)率整體上高于其他農(nóng)藥處理，對萊氏綠僵菌分生孢子萌發(fā)的影響較小。其中，在68%草甘膦銨鹽可溶粒劑推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中萊氏綠僵菌分生孢子萌發(fā)率分別為(15.56±1.11)%、(23.89±2.00)%、(33.33±3.85)%；在200 g/L百草枯水劑推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中萊氏綠僵菌分生孢子萌發(fā)率分別為(10.45±1.13)%、(13.00±0.84)%、(15.89±1.93)%。從萊氏綠僵菌分生孢子在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中的萌發(fā)率來看，200 g/L百草枯水劑(F=6.84,P=0.03)、75%百菌清可濕性粉劑(F=8.89,P=0.02)、24%滅多威可溶液劑(F=6.45,P=0.03)3種農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度間均存在顯著性差異；65%代森鋅可濕性粉劑(F=18.65,P=0.00)、68%草甘膦銨鹽可溶粒劑(F=11.83,P=0.00)、80%多菌靈可濕性粉劑(F=30.90,P=0.00)、20%甲氰菊酯乳油(F=49.95,P=0.00)4種農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度間均存在極顯著性差異。

加入農(nóng)藥后72 h時，不同質(zhì)量濃度間分生孢子的萌發(fā)率除了75%百菌清可濕性粉劑(F=1.57,P=0.28)無顯著性差異外，其他6種農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度間均存在極顯著性差異(68%草甘膦銨鹽可溶粒劑：F=34.67,P=0.00；200 g/L百草枯：F=21.95,P=0.00；80%多菌靈可濕性粉劑：F=11.98,P=0.00；65%代森鋅可濕性粉劑：F=33.60,P=0.00；24%滅多威可溶液劑：F=100.14,P=0.00；20%甲氰菊酯乳油：F=17.89,P=0.00)。

就除草劑而言，68%草甘膦銨鹽可溶粒劑對分生孢子萌發(fā)率的抑制作用相對較小，加入農(nóng)藥后72 h時在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中的萌發(fā)率分別為(22.00±3.40)%、(37.33±1.20)%、(47.11±0.91)%。就殺菌劑而言，80%多菌靈可濕性粉劑的抑制作用較小，加入農(nóng)藥后72 h時在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中的萌發(fā)率分別為(17.33±0.51)%、(19.44±0.80)%、(22.55±0.91)%。就殺蟲劑而言，20%甲氰菊酯乳油的抑制作用較小，加入農(nóng)藥后72 h時在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液中的萌發(fā)率分別為(15.33±1.84)%、(29.33±1.84)%、(31.11±2.41)%。而24%滅多威可溶液劑72 h時孢子萌發(fā)率最高的僅為(21.33±0.33)%。

綜合以上結(jié)果，萊氏綠僵菌菌株Nr0815分生孢子對化學(xué)農(nóng)藥較為敏感，分生孢子在供試的68%草甘膦銨鹽可溶粒劑、200 g/L百草枯水劑、75%百菌清可濕性粉劑、80%多菌靈可濕性粉劑、65%代森鋅可濕性粉劑、24%滅多威可溶液劑、20%甲氰菊酯乳油中的相容存貯性差，不宜用于降低萊氏綠僵菌菌株Nr0815殺蟲時滯效應(yīng)。

2.2 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815菌絲生長的影響

從表3可以看出，同一質(zhì)量濃度不同化學(xué)農(nóng)藥或不同質(zhì)量濃度同一化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815菌絲生長均有不同程度的抑制作用，且抑制率均在65%以上。在推薦質(zhì)量濃度下不同化學(xué)農(nóng)藥對菌絲生長抑制率存在顯著性差異(F=2.77，P=0.03)，抑制率從大到小依次為75%百菌清可濕性粉劑>24%滅多威可溶液劑>65%代森鋅可濕性粉劑>80%多菌靈可濕性粉劑>200 g/L百草枯水劑>20%甲氰菊酯乳油>68%草甘膦銨鹽可溶粒劑，其中68%草甘膦銨鹽可溶粒劑菌絲生長抑制率為(72.79±2.49)%；其他質(zhì)量濃度下不同化學(xué)農(nóng)藥對菌絲生長抑制率均無顯著性差異(B：F=0.98，P=0.45；C：F=0.77，P=0.60)。同種化學(xué)農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度對菌絲生長的抑制率均無顯著性差異(68%草甘膦銨鹽可溶粒劑：F=0.57,P=0.58；200 g/L百草枯水劑：F=0.72,P=0.50；75%百菌清可濕性粉劑：F=1.96,P=0.18；80%多菌靈可濕性粉劑：F=0.85,P=0.45；65%代森鋅可濕性粉劑：F=2.02,P=0.17；24%滅多威可溶液劑：F=0.87,P=0.44；20%甲氰菊酯乳油：F=0.67,P=0.53)。

表3 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815菌絲生長的抑制作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示不同農(nóng)藥同一質(zhì)量濃度下差異顯著(P<0.05),同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度下差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different capital letters in the same column indicate significant difference among different pesticides treatments at the same concentration(P<0.05),different small letters in the same row indicate significant difference among different concentration treatments of the same pesticide(P<0.05),the same below.

2.3 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815產(chǎn)孢量的影響

從表4可以看出，與對照[(1.33±0.42)×109個/mL]相比，化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815的產(chǎn)孢量均有不同程度的抑制作用,且抑制作用均隨著化學(xué)農(nóng)藥質(zhì)量濃度的降低而減弱。當(dāng)質(zhì)量濃度不變時，不同化學(xué)農(nóng)藥處理萊氏綠僵菌菌株Nr0815的產(chǎn)孢量均存在顯著性差異(A:F=14.65,P=0.00;B:F=5.22,P=0.005;C:F=4.49,P=0.01)。同一化學(xué)農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度處理產(chǎn)孢量均存在顯著性差異(68%草甘膦銨鹽可溶粒劑：F=10.26,P=0.02；200 g/L百草枯水劑：F=11.06,P=0.01；75%百菌清可濕性粉劑：F=9.15,P=0.02；80%多菌靈可濕性粉劑：F=28.23,P=0.00；65%代森鋅可濕性粉劑：F=5.93,P=0.04；24%滅多威可溶液劑：F=46.36,P=0.00；20%甲氰菊酯乳油：F=6.34,P=0.03)。

就除草劑而言，68%草甘膦銨鹽可溶粒劑對萊氏綠僵菌產(chǎn)孢量的抑制作用較小，在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液處理后產(chǎn)孢量分別為(4.93±0.44)×108、(8.73±1.43)×108、(10.59±0.44)×108個/mL；就殺菌劑而言，65%代森鋅可濕性粉劑對萊氏綠僵菌菌株Nr0815產(chǎn)孢量的抑制作用較小，在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液處理后產(chǎn)孢量分別為(2.20±0.61)×108、(3.37±1.04)×108、(7.23±1.45)×108個/mL；就殺蟲劑而言，20%甲氰菊酯乳油對萊氏綠僵菌菌株Nr0815產(chǎn)孢量的抑制作用較小，在推薦質(zhì)量濃度及其5倍、10倍稀釋液處理后產(chǎn)孢量分別為(4.70±0.23)×108、(6.60±1.52)×108、(9.40±0.56)×108個/mL。

表4 化學(xué)農(nóng)藥對萊氏綠僵菌菌株Nr0815產(chǎn)孢量的影響Tab.4 Effect on sporulation quantity of M.rileyi stain Nr0815 by chemical pesticides 108個/mL

3 結(jié)論與討論

本研究中，殺菌劑與萊氏綠僵菌菌株Nr0815的相容性明顯低于殺蟲劑和除草劑，且質(zhì)量濃度越高抑制作用越強(qiáng)，這與之前的研究結(jié)果一致[3,12-14]。因此，如何改良和篩選耐殺菌劑的蟲生真菌菌株，擴(kuò)大殺菌劑與殺蟲真菌農(nóng)藥混用面積，還需要進(jìn)一步研究。

24%滅多威可溶液劑的3種質(zhì)量濃度對菌絲生長的抑制率均在65%以上，高于邱思鑫等[1]的研究結(jié)果。且72 h時孢子萌發(fā)率最高僅為(21.33±0.33)%，低于郭亞力等[14]的研究結(jié)果，這可能由菌株本身的差異、農(nóng)藥生產(chǎn)廠家或農(nóng)藥有效成分不同所致。

從農(nóng)藥的防治對象來看，除草劑對菌株Nr0815的孢子萌發(fā)率、菌絲生長抑制率和產(chǎn)孢量影響相對較小，其次為殺蟲劑，而殺菌劑的影響最強(qiáng)。原因可能如下：與除草劑和殺蟲劑相比，殺菌劑的作用機(jī)制不同，殺菌劑主要通過影響真菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞能量生成、細(xì)胞代謝物質(zhì)合成及其功能等方面來殺死或抑制真菌[15-16]。萊氏綠僵菌屬于真菌的一種，結(jié)構(gòu)和代謝功能與植物病害真菌相似。

在含有不同化學(xué)農(nóng)藥的SDAY培養(yǎng)基上萊氏綠僵菌菌株Nr0815菌絲生長不同，后期均有綠色的分生孢子粉產(chǎn)生，且產(chǎn)孢量存在一定的差異，說明化學(xué)農(nóng)藥對該菌會產(chǎn)生一定的抑制作用，但并未將分生孢子全部殺死。JOHNSON等[17]研究發(fā)現(xiàn)，萊氏綠僵菌分生孢子采用殺菌劑或除草劑處理后對甘藍(lán)銀紋夜蛾的感染死亡數(shù)量明顯減少，這也可能是該菌在田間得以存活并在條件適宜情況下發(fā)生流行的原因之一。

此外，有研究報道銅綠麗金龜幼蟲、棉鈴蟲幼蟲、小菜蛾幼蟲經(jīng)過Bt預(yù)處理后分別對氰戊菊酯和有機(jī)磷及氨基甲酸酯殺蟲劑的敏感性提高。分析結(jié)果表明，Bt預(yù)處理后的銅綠麗金龜幼蟲、棉鈴蟲幼蟲和小菜蛾幼蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(AChE)活性被抑制[18-20]。萬成松等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)與化學(xué)殺蟲劑混用時能抑制多功能氧化酶(MFO)、AChE等相關(guān)酶活性。因此，感染萊氏綠僵菌初期的夜蛾類幼蟲對殺蟲劑的敏感性是否會提高，以及其作用機(jī)制是否與Bt或病毒一樣抑制相關(guān)酶類的活性，均有待進(jìn)一步研究。