石榴同源四倍體誘導及評價

潘宏兵，羅 玲，馮 娟，李貴利，杜 邦，黃 云

(1.攀枝花市農林科學研究院，四川 攀枝花 617061； 2.四川省農業(yè)科學研究院 園藝研究所，四川 成都 611130； 3.四川省農業(yè)廣播電視學校 攀枝花市中心分校，四川 攀枝花 617000)

石榴(PunicagranatumL.)原產(chǎn)中亞地區(qū)，在世界熱帶、亞熱帶區(qū)域廣泛栽培，引入國內栽培有2 000多年歷史，已保存石榴品種類型280余個[1]。目前，石榴新品種選育較多采用雜交、芽變、輻射誘變和實生選育，存在育種周期長、效率低和目標性狀不確定等問題。而倍性育種操作簡單，不受季節(jié)和環(huán)境等條件限制，且培育出的多倍體通常具果實大、品質好、抗逆性強及適應性廣等優(yōu)點，已成為果樹種質創(chuàng)新和新品種選育的一種重要育種方法[2]。多倍體自然發(fā)生主要通過自然芽變和實生種子篩選途徑獲得，例如鴨梨品種天海[3]、葡萄品種紅太陽[4]等四倍體由自然芽變選育而來，而枳品種灌云1號[5]、枇杷品種B431[6]四倍體由實生種子篩選獲得。多倍體人工誘導主要通過物理、生物和化學誘變途徑獲得，例如SMITH等[7]用γ射線照射小種矮型香蕉品種獲得了其突變型四倍體，通過原生質體融合、配子染色體加倍、胚乳培養(yǎng)、有性雜交等技術在獼猴桃[8]、柑橘[9]、蘋果[10]、枇杷[11]、香蕉[12]、棗[13]等植物上獲得了多倍體，通過秋水仙素或氨磺樂靈誘導種子、芽、愈傷組織在棗[14]、蓖麻[15]、草莓[16]、柑橘[17]、羅漢果[18]、歐李[19]、石榴[20]等植物上獲得了多倍體，其中石榴多倍體為四倍體月季石榴，是觀賞石榴品種，未見作為果樹栽培石榴品種的多倍體誘導研究報道。石榴優(yōu)良品種少制約了產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展。鑒于此，開展秋水仙素誘導石榴種子研究，對誘變材料進行倍性鑒定、植物學性狀評價和農藝性狀評價，旨在篩選出具有特異優(yōu)良性狀的育種材料，加快石榴優(yōu)良新品種選育。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紫美石榴曾用名以色列軟籽酸，該品種于1996年從以色列引入四川攀枝花市試種，2015年通過四川省農作物品種審定(川審果2015010)。2013年進行紫美自交授粉，同年10月取其自交種子作為四倍體誘導材料。

1.2 試驗設計

取催芽萌動紫美石榴種子，用0.3%秋水仙素溶液(含1%二甲基亞砜)浸漬處理。浸漬時間設CK(0 h)、A1(12 h)、A2(24 h)和A3(36 h)4個處理，每處理60粒種子，重復3次。30 d統(tǒng)計成活率，90 d統(tǒng)計誘導率。

1.3 倍性鑒定

植株流式細胞儀倍性檢測參考王艷等[21]的方法，檢測儀器用德國Partce公司的CyFlow?Ploidy Analyser。植株細胞染色體制片參考冷青云等[22]的方法，通過電子顯微鏡觀察拍照計數(shù)染色體數(shù)目。

1.4 植物學性狀、農藝性狀評價

2017年春季，在仁和區(qū)大田鎮(zhèn)石榴基地的會理青皮軟籽石榴樹上分別高接二倍體、四倍體紫美石榴各15株。2018—2019年，調查葉長、葉寬、葉形指數(shù)、葉厚、葉柄粗、葉面積、葉綠素含量、完全花長、完全花寬、花形指數(shù)、完全花雄蕊數(shù)、子房心室數(shù)、百粒質量、籽粒硬度、可溶性固形物含量、果皮厚、果皮顏色、籽粒顏色，觀察葉片氣孔特征和葉截面細胞組織結構，觀察植株生長勢、主干顏色和主干縱列深淺，觀察萌芽期、始花期、成熟期和落葉期物候期。葉面積測量選用YMJ-CH葉面積儀，葉綠素含量測定選用SPAD-502 Plus葉綠素測定儀，葉片氣孔特征觀察采用指甲油印跡法，葉肉組織結構觀測用徒手切片。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016和SAS 9.3進行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結果與分析

2.1 石榴四倍體植株的鑒定

葉片單細胞DNA含量經(jīng)流式細胞儀檢測結果見圖1，對照二倍體植株在熒光強度16 384處出現(xiàn)峰值(圖1A)，誘變植株在熒光強度32 768處出現(xiàn)峰值(圖1B)，誘變植株峰值出現(xiàn)的熒光強度是二倍體植株的2倍。染色體計數(shù)觀察結果表明，對照二倍體植株根尖細胞染色體數(shù)為2n=2x=16(圖2A)，誘變植株為2n=4x=32(圖2B)。通過流式細胞儀檢測和染色體數(shù)目觀察，確定誘變植株為紫美石榴同源四倍體。

A:二倍體;B:四倍體 A:Diploid;B:Tetraploid

2.2 秋水仙素誘導處理石榴種子結果

秋水仙素誘導石榴種子結果見表1。秋水仙素處理種子時間延長，其對種子的毒害性增大，種子成活率降低。CK成活率最高，為87.78%，其次是A1和A2處理，A3處理成活率最低，為67.22%。A2處理誘導四倍體效果最好，四倍體誘導率為1.11%，其次為A1處理，CK和A3處理未誘導出四倍體苗。試驗獲得純合四倍體3株，同時獲得部分嵌合體植株。

表1 秋水仙素誘導石榴種子結果

2.3 石榴二倍體、四倍體葉片氣孔比較

多倍體典型特征是葉片氣孔變大。從表2可以看出，四倍體紫美石榴葉片氣孔長25.79 μm、寬16.79 μm，均極顯著大于二倍體，而氣孔密度為78.40個/mm2，極顯著低于二倍體。從圖3可以看出，紫美石榴的四倍體葉片氣孔明顯比其二倍體大。

表2 石榴二倍體、四倍體葉片氣孔特征

注：數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，**表示t檢測在P<0.01水平上的差異顯著性，下同。

Note：Data are average value ± standard deviation,** indicates the significance of difference byt-test at the level ofP<0.01,the same below.

A:二倍體;B:四倍體 A:Diploid;B:Tetraploid

2.4 石榴二倍體、四倍體枝葉性狀比較

從圖4可以看出，四倍體與二倍體相比較，葉片變大、網(wǎng)狀葉脈更明顯、葉色更深，四倍體葉片的柵欄組織和海綿組織比二倍體大。從圖5可以看出，二倍體、四倍體植株生長勢差異不明顯，四倍體主干顏色明顯淺于二倍體，四倍體主干縱裂深淺比二倍體更明顯。

從表3可知，四倍體葉片的葉長、葉寬、葉厚、葉柄粗、葉面積以及葉綠素含量均極顯著高于二倍體，僅葉形指數(shù)極顯著低于二倍體。其中，四倍體葉面積為1 123.13 mm2，比二倍體大12.8%；四倍體葉綠素含量(SPAD) 為68.80，比二倍體高出15.8%。葉面積大和葉綠素含量高有利于四倍體提高光合效率，積累更多碳水化合物。

圖4 石榴二倍體、四倍體葉片

圖5 石榴二倍體、四倍體枝條

表3 石榴二倍體、四倍體葉片性狀比較

2.5 石榴二倍體、四倍體花和果實性狀比較

圖6為二倍體、四倍體花和果實形態(tài)，兩者的花和果實形態(tài)差異明顯。四倍體花比二倍體大，主要是花托、萼筒和萼片增大，四倍體完全花的胚珠、雌蕊和雄蕊比二倍體大。二倍體、四倍體果實均為近圓球形，果皮顏色均為深紅色。四倍體果皮比二倍體厚，籽粒顏色比二倍體淺，籽粒略比二倍體大。

由表4可知，四倍體的完全花寬極顯著高于二倍體，而完全花長、花形指數(shù)、完全花雄蕊數(shù)、子房心室數(shù)均極顯著低于二倍體，其中，完全花雄蕊數(shù)為165.7個，比二倍體少35.0%；子房心室數(shù)為7.4個，比二倍體少26.7%。

由表5可知，四倍體的果皮厚和百粒質量均極顯著高于二倍體，四倍體果皮厚為0.80 cm，比二倍體果皮厚近2倍；四倍體可溶性固形物含量顯著低于二倍體，比二倍體降低1.03個百分點；四倍體籽粒為硬籽，籽粒硬度高于二倍體(半軟籽)。

2.6 石榴二倍體、四倍體物候期比較

在四川攀西石榴產(chǎn)區(qū)，四倍體紫美石榴的物候期晚于二倍體(表6)，四倍體的萌芽期較二倍體晚1周多，始花期較二倍體晚近半個月，成熟期較二倍體晚近半個月，落葉期較二倍體晚近半個月。四倍體紫美石榴花期延后，對避開南方花期倒春寒有利，其成熟期在10月上中旬，能延長石榴產(chǎn)期。

圖6 石榴二倍體、四倍體的花和果實

表4 石榴二倍體、四倍體花的性狀比較

表5 石榴二倍體、四倍體果實的性狀比較

表6 石榴二倍體、四倍體物候期比較

3 結論與討論

秋水仙素多被用于誘導處理種子、芽、原球莖、愈傷、子房等以獲得多倍體材料，是誘導植物染色體加倍的最有效藥劑之一[23]。SHAO等[20]分別用含0.001%秋水仙素固體培養(yǎng)基和0.5%秋水仙素液體培養(yǎng)基誘導月季石榴外植體，均獲得四倍體植株。本研究發(fā)現(xiàn)，用0.3%的秋水仙素浸漬處理萌動紫美石榴種子24 h效果最好，四倍體誘導率為1.11%，表明用秋水仙素處理石榴種子誘導多倍體方法可行，秋水仙素使用濃度與誘導處理材料類型緊密相關。而劉麗[24]研究表明，利用秋水仙素誘導處理發(fā)芽率達30%的大籽石榴種子，以0.2%秋水仙素處理48 h促進種子胚軸橫徑、幼苗冠幅和株高等生長效果明顯，但未能獲得多倍體植株，這可能與秋水仙素浸泡處理時石榴種子的萌發(fā)狀態(tài)有關，種子催芽萌發(fā)進程存在個體差異，需要進一步篩選適宜的誘導時期。

多倍體植物葉綠素含量較高[25]，氣孔增大和氣孔密度下降[26]，在四倍體紫美石榴上表現(xiàn)相同。多倍體植物通常具有細胞大、器官大、適應性強等特性[27]，本研究獲得的四倍體紫美石榴的大部分葉、花、果實性狀極顯著優(yōu)于二倍體，僅葉形指數(shù)、完全花長、花形指數(shù)、完全花雄蕊數(shù)及子房心室數(shù)極顯著低于二倍體，可溶性固形物含量、籽粒顏色以及籽粒硬度表現(xiàn)差于二倍體?？赡苁羌颖逗笳{控子房心室數(shù)、籽粒顏色和籽粒硬度等性狀的基因沉默或下調，李曉榮等[28]研究不同倍性甘藍型油菜基因轉錄表達時發(fā)現(xiàn)，80%的基因表現(xiàn)為非加性表達，某些基因在多倍體中表達沉默，也可能是基因表達與植物種類相關同時還受到環(huán)境互作的影響。有研究認為，小孢子母細胞減數(shù)分裂行為異常引起多倍體植物花粉育性降低[6]，已經(jīng)在四倍體萱草[29]、黃花菜[30]等多倍體植物研究中得到證實。四倍體月季石榴花粉萌發(fā)率顯著低于二倍體[20]，同樣田間觀察發(fā)現(xiàn)四倍體紫美石榴結實率低于二倍體，可能是花粉育性降低引起的。四倍體紫美石榴物候期晚于二倍體，相關多倍體植物物候期研究報道較少，其抗逆性增強是否與物候期改變有關有待研究。四倍體紫美石榴花期延后，對避開南方花期倒春寒有利。

綜上所述，秋水仙素誘導石榴種子能獲得同源四倍體，其植物學性狀和農藝性狀與二倍體相比較差異明顯，可作為育種新材料開展相關評價利用研究。