百里香乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病的抑菌作用

張 祿，康利平，劉佃林

（1.內(nèi)蒙古廣播電視大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；2.呼和浩特職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051）

百里香（Thymus mongolicus Ronn），別名地椒，唇形科百里香屬多年生草本植物，其精油具有抗氧化、抗微生物、殺菌消炎、治療上呼吸道疾病等功效[1-2]。黃瓜枯萎病，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一種由土壤傳染，從根或根莖部侵入，在維管束內(nèi)寄生的系統(tǒng)性病害（導(dǎo)管型枯萎?。?，是黃瓜生產(chǎn)上較難防治的病害之一，常造成較大損失?？菸≡邳S瓜的整個(gè)生長(zhǎng)期均能發(fā)生，以開(kāi)花結(jié)瓜期發(fā)病最多。苗期發(fā)病時(shí)莖基部變褐縊縮、萎蔫猝倒。黃瓜枯萎病的病原菌為Fusarium oxysporum F.sp.cucumebrium Owen。目前，黃瓜枯萎病的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治，對(duì)土壤及黃瓜生產(chǎn)造成了農(nóng)藥殘留的危害。為避免化學(xué)藥品的危害，研究者們考慮用植物源抑菌劑代替化學(xué)藥品進(jìn)行蔬菜病蟲(chóng)害的防治。有研究表明，百里香精油具有抗微生物生長(zhǎng)的特點(diǎn)[3-4]，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用[5-7]。本試驗(yàn)利用百里香乙醇提取液對(duì)微生物生長(zhǎng)具有影響的特點(diǎn)，研究其對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響，從而為黃瓜乃至蔬菜無(wú)公害栽培中病害防治提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用百里香鮮樣采自呼和浩特職業(yè)學(xué)院生物化學(xué)工程學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地，干樣為鮮樣自然風(fēng)干后所得；所用的黃瓜枯萎病病菌為Fusariun oxysporum F. sp. cucumebrium Owen。

1.2 方法

1.2.1 采樣 待百里香植株生長(zhǎng)到花期時(shí)，隨機(jī)選擇30 株植株采集百里香新鮮莖葉、鮮花，并分別存放。新鮮莖葉采回后，部分用于鮮樣試驗(yàn)，部分去雜洗凈自然風(fēng)干后進(jìn)行干樣試驗(yàn)。為了方便試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，將莖葉鮮樣編號(hào)為1，將莖葉干樣編號(hào)為2，鮮花樣編號(hào)為3。

1.2.2 萃取液制備 將采回的新鮮莖葉和鮮花剪碎，分別稱(chēng)取5 g，用濾紙包好置于萃取燒瓶?jī)?nèi)，燒瓶?jī)?nèi)放入70 mL 無(wú)水乙醇，自來(lái)水冷凝，萃取2 h，回收萃取液，標(biāo)記為1、3，分別設(shè)3 次重復(fù)。百里香干樣的處理同鮮樣，獲得干樣萃取液，3 次重復(fù)，標(biāo)記為2。

1.2.3 接菌與培養(yǎng) 提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響參考賈俊英等[8]的方法，采用PDA 培養(yǎng)法進(jìn)行。對(duì)上述1、2、3（莖葉鮮樣、莖葉干樣、鮮花樣）3 種提取液分別稀釋2 倍、5 倍、10 倍（記為1-2、1-5、1-10，2-2、2-5、2-10，3-2、3-5、3-10，共9 個(gè)處理）添加到20 mL PDA 培養(yǎng)基中，對(duì)照用無(wú)水乙醇代替提取液，分別稀釋2 倍、5 倍、10 倍（記為CK-2、CK-5、CK-10）添加到20 mL PDA 培養(yǎng)基中，同時(shí)用PDA 培養(yǎng)基作為總對(duì)照，記為CK-0。

將上述9 個(gè)處理和3 個(gè)對(duì)照及1 個(gè)總對(duì)照各2 mL 分別添加到含有18 mL PDA 的9 cm×9 cm 培養(yǎng)皿中，做好標(biāo)記，放平，待培養(yǎng)基凝固后進(jìn)行接種，每個(gè)處理5 次重復(fù)。

接種時(shí)，采用0.6 cm 的打孔器進(jìn)行。用打孔器從母板中將培養(yǎng)好的黃瓜枯萎病病菌打1 個(gè)菌落，置于培養(yǎng)皿中央，蓋好皿蓋，放到25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 測(cè)量與數(shù)據(jù)分析 從培養(yǎng)48 h 開(kāi)始，每隔24 h 采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，直到枯萎病病菌長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿為止。百里香乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響可以通過(guò)抑菌率計(jì)算：

抑菌率/%=［（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑］×100

全部數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香莖葉鮮樣乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響

由表1 可知，1-2、1-5、1-10 3 個(gè)處理中黃瓜枯萎病病菌隨測(cè)量時(shí)間增加，菌落直徑持續(xù)增加。到培養(yǎng)144 h 時(shí)，1-2 處理的菌落直徑為4.506 cm，為CK-0 同時(shí)期的54.493%，是CK-2 的68.668%，說(shuō)明1-2 處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。1-5 和1-10 處理病菌的生長(zhǎng)速度非常相似，到培養(yǎng)144 h 時(shí)，其菌落直徑均比CK-0 有少許降低，而與CK-5、CK-10 處理非常接近，說(shuō)明這2 個(gè)濃度處理百里香莖葉鮮樣乙醇提取液只具有微弱的抑制作用，且抑制作用主要來(lái)自萃取劑乙醇。1-2、1-5、1-10 3 個(gè)處理與總對(duì)照CK-0 的菌落直徑均呈差異極顯著（P<0.01），且與各自相同稀釋倍數(shù)的對(duì)照CK-2、CK-5、CK-10 在各培養(yǎng)期內(nèi)表現(xiàn)為差異極顯著（P<0.01）。各處理的抑菌率與對(duì)照相比呈差異極顯著（P<0.01）。由表2 可知，到培養(yǎng)144 h 時(shí)，1-2 處理的抑菌率達(dá)到45.507%，而CK-2 處理的抑菌率只有20.643%。

表1 百里香莖葉鮮樣乙醇提取液不同稀釋倍數(shù)處理黃瓜枯萎病病菌的菌落直徑 單位：cm

表2 百里香莖葉鮮樣乙醇提取液不同稀釋倍數(shù)處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率 單位：%

2.2 百里香莖葉干樣乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響

由表3 可知，2-2、2-5、2-10 處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為隨著測(cè)量時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落直徑持續(xù)增加趨勢(shì)。從稀釋倍數(shù)來(lái)看，稀釋2 倍時(shí)，2-2 處理百里香干樣乙醇提取液的菌落生長(zhǎng)速度最慢，菌落直徑最小，到培養(yǎng)144 h 時(shí)僅為5.930 cm，稀釋10 倍的次之，稀釋5 倍時(shí)，菌落直徑增長(zhǎng)速率最快，與CK-0相比，2-2、2-5、2-10 處理的菌落直徑均較小，分別為CK-0 的71.714%、85.198%、79.901%，表現(xiàn)為差異極顯著（P<0.01）。說(shuō)明百里香莖葉干樣乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌具有明顯的抑制作用，且以2-2 處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。由表4 可知，到培養(yǎng)144 h 時(shí)，2-2、2-5、2-10 處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率分別為28.286%、14.802%、20.099%，且與CK-2、CK-5、CK-10 相比均差異極顯著（P<0.01）。

表3 百里香莖葉干樣乙醇提取液不同稀釋倍數(shù)處理黃瓜枯萎病病菌的菌落直徑 單位：cm

表4 百里香莖葉干樣乙醇提取液不同稀釋倍數(shù)處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率 單位：%

2.3 百里香鮮花乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響

由表5 可知，3-2、3-5、3-10 處理下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜枯萎病病菌菌落直徑呈現(xiàn)先減小后增大的變化趨勢(shì)。在48 h 時(shí)的菌落直徑較大，而在72 h 時(shí)菌落直徑減小，說(shuō)明此期間百里香鮮花乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌的繼續(xù)生長(zhǎng)起到了抑制作用。伴隨枯萎病病菌的繼續(xù)生長(zhǎng)，其菌落直徑開(kāi)始呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)，到培養(yǎng)144 h 時(shí)，均達(dá)到了各處理的最大值。在各培養(yǎng)期內(nèi)，除120 h 的3-5 與CK-5的差異不顯著（P＞0.05）外，其他各處理與對(duì)照相比均差異極顯著（P<0.01）。由表6 可知，與總對(duì)照CK-0相比，到培養(yǎng)144 h 時(shí)，3-2、3-5、3-10 處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率分別為33.898%、15.093%、10.037%，且與CK-2、CK-5、CK-10 相比均差異極顯著（P<0.01）。

表5 百里香鮮花乙醇提取液不同稀釋倍數(shù)處理黃瓜枯萎病病菌的菌落直徑 單位：cm

表6 百里香鮮花乙醇提取液不同稀釋倍數(shù)處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率 單位：%

2.4 百里香乙醇提取液稀釋倍數(shù)對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響

由圖1 可知，對(duì)百里香莖葉鮮樣、莖葉干樣、鮮花等部位的乙醇提取液分別稀釋2 倍、5 倍、10 倍后，其抑菌率大小并不一樣。其中抑菌率最大的是莖葉鮮樣乙醇提取液，而這其中尤以稀釋2 倍處理對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率最大，可見(jiàn)百里香莖葉鮮樣乙醇提取液濃度較大時(shí)對(duì)黃瓜枯萎病病菌的生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

植物精油具有一定的抑菌效果。吳慧清等[9]采用紙片法和試管法評(píng)估了42 種植物精油的抑菌效果，結(jié)果顯示，植物精油對(duì)真菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑殺效果好，有11 種精油對(duì)5 種指示菌的抑殺效果較好，其中百里香排在第2 位。百里香精油具有多種生物活性，其中以抗菌活性最突出。SHIN 等[10]研究表明，百里香精油對(duì)致病菌肺炎鏈球菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌等均具有抑制作用。樊明濤等[5]、裴海閏等[6]研究表明，百里香精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用。百里香精油對(duì)真菌的活性也有抑制作用。UYTTENDAELE 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，百里香提取物對(duì)蔬菜中的氣單胞菌屬細(xì)菌有調(diào)節(jié)控制作用。以上試驗(yàn)對(duì)于百里香提取物的研究主要集中在百里香精油，即以水作為溶劑蒸餾所得的精油成分，且其研究方向主要集中于動(dòng)物或人類(lèi)致病微生物的生長(zhǎng)抑制作用上。而對(duì)于其他溶劑提取物以及在植物生產(chǎn)上的應(yīng)用研究較少報(bào)道。本研究對(duì)百里香的莖葉、鮮花通過(guò)乙醇抽提方法得到提取液，并對(duì)其在黃瓜栽培中常出現(xiàn)的枯萎病病菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，百里香莖葉鮮樣、莖葉干樣、鮮花對(duì)黃瓜枯萎病病菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且隨著提取液濃度的增加，抑菌效果明顯加強(qiáng)。在試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)研究了乙醇溶劑等倍稀釋后對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，乙醇溶劑對(duì)病菌生長(zhǎng)也具有抑制作用，乙醇濃度高的抑制效果強(qiáng)，這與提取液對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響規(guī)律一致。提取液中百里香提取物與溶劑對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響關(guān)系通過(guò)抑菌率的計(jì)算可以看到：在高濃度情況下，提取物對(duì)病菌生長(zhǎng)具有抑制作用，而在低濃度下抑制作用減弱，甚至出現(xiàn)促進(jìn)生長(zhǎng)的表現(xiàn)。為更好地研究提取物對(duì)植物病菌生長(zhǎng)的影響，選用對(duì)病菌生長(zhǎng)影響較小的溶劑是很好的辦法，有待今后進(jìn)一步研究。同時(shí)，百里香乙醇提取液對(duì)黃瓜植株的生長(zhǎng)是否具有影響也有待深入研究，這將對(duì)黃瓜無(wú)公害栽培及百里香提取液的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

本試驗(yàn)表明，百里香乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)具有抑制作用；百里香不同部位乙醇提取液對(duì)黃瓜枯萎病病菌生長(zhǎng)的影響不同，以百里香莖葉鮮樣乙醇提取液影響最大，百里香乙醇提取液濃度越大抑菌效果越強(qiáng)。