基于RNA-seq 篩選不同飼養(yǎng)模式下肉雞肌肉發(fā)育代謝相關(guān)差異基因

王佳潔，沈中浩，周曉龍，楊松柏，趙阿勇，汪 涵

（浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，浙江臨安 311300）

目前，地面平養(yǎng)和籠養(yǎng)是世界范圍內(nèi)肉雞最主要的飼養(yǎng)方式。Castellini 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，平養(yǎng)模式更有利于雞肌肉發(fā)育，該模式飼養(yǎng)的雞肌肉能量和脂肪含量較低，水分含量高，腿肌肌肉氧化性強，飽和脂肪酸含量高，單不飽和脂肪酸水平低。雞肌肉中脂肪酸含量不僅在肌肉代謝中發(fā)揮著十分重要的生理作用，而且與雞肉風(fēng)味密切相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，平養(yǎng)模式下，雞增重速度快，具有較大的運動量，更有利于肌肉發(fā)育，但肌肉中營養(yǎng)成分（水分、蛋白質(zhì)、脂肪）、持水能力、剪切力、pH 等無顯著改變[3]。然而，關(guān)于不同飼養(yǎng)模式影響肉雞肌肉發(fā)育及代謝的分子機制仍有待進一步研究。

當(dāng)前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、臨床等各領(lǐng)域研究中最常用的技術(shù)手段[4]；RNAseq 技術(shù)也為篩選畜禽肌肉相關(guān)性狀差異關(guān)鍵基因及探究肌肉相關(guān)基因功能提供了至關(guān)重要的研究途徑[5-6]。因此，本實驗以不同飼養(yǎng)模式下的肉雞為研究對象，通過RNAseq 技術(shù)對2 種飼養(yǎng)模式下的肉雞腿肌進行測序分析，篩選出與肌肉發(fā)育代謝相關(guān)的差異基因，為今后通過科學(xué)的飼養(yǎng)管理提高肉雞肌肉品質(zhì)提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 RNA 提取TRIzon Reagent 購自北京康為世紀生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒5X All-In-One RT Master Mix、定量試劑盒EvaGreen 2X Qpcr Master Mix 均購自蘇州愛必夢生物科技有限公司；Pax7 抗體（ab187339）、Desmin 抗體（ab6322）均購自abcam公司；Myhc 抗體（sc-20641）購自Santa Cruz Biotechnology公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、馬血清、DMEM 培養(yǎng)基均購自于HyClone 公司；青鏈霉素混合液、膠原酶、抗熒光衰減封片劑均購自于Solarbio 公司；胰酶（0.25%Trypsin-EDTA 1X）、熒光二抗（Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG 和Alexa Fluor?488 goat anti-rabbit IgG）均購自于Thermo Fisher 公司；Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體購自于Invitrogen 公 司；OPTI-MEM 培養(yǎng)基購自于Gibco 公司；普通siRNA、陰性對照siRNA、EdU 檢測試劑盒（Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit）均購自于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實驗動物 選取210 只體重相近的1 日齡 Ross308肉雞，隨機分為2 組，籠養(yǎng)組10 個雞籠，每個雞籠6只肉雞（n=10）；地面欄養(yǎng)組10 個圍欄，每個圍欄15只雞，地面上鋪設(shè)10 cm 的新木屑（n=10）。2 組肉雞飼料相同，均根據(jù)不同階段（雛雞階段、中期階段和肉大雞階段）所需的營養(yǎng)進行科學(xué)配比，均自由采食和飲水。在籠養(yǎng)和地面平養(yǎng)雞中各隨機選取5 只42 日齡肉雞母雞進行稱重，計算2 組肉雞的平均日增重，隨后進行屠宰。

10 日齡雞胚由本實驗室取種蛋孵化10 d 后所得，種蛋購自浙江某種禽有限公司。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

1.2.1 樣本采集及處理 使用Trizol 法提取肉雞腿肌RNA，通過北京百邁客樣品檢測中心進行質(zhì)量檢測，保證樣品質(zhì)量滿足建庫要求。以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2 測序文庫構(gòu)建與序列測序 基于邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis，SBS）技術(shù)，通過Illumina高通量測序平臺對樣品進行測序并構(gòu)建文庫。本研究將平養(yǎng)模式和籠養(yǎng)模式下的腿肌組織分別編號為C1T-C5T和P1T-P5T，以便后續(xù)進行結(jié)果分析。

1.2.3 差異基因篩選 在差異表達基因檢測過程中，將Fold Change≥2 且FDR＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)（Fold Change）表示兩樣品（組）間表達量的比值。錯誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）是通過對差異顯著性P值（p-value）進行校正得到的。并最終采用FDR 作為差異表達基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.3 熒光定量PCR 驗證 根據(jù)NCBI 中的基因序列，通過Primer Premier.5 軟件對不同飼養(yǎng)模式下的差異基因PHGDH、ASNS、JPH2以及隨機選取的2 個任意基因LDHA、BLOC1S4以及內(nèi)參基因GAPDH進行引物設(shè)計，引物由杭州有康生物技術(shù)有限公司合成，具體序列如表1。將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 模板，加入已驗證好的引物進行10 μL 體系的熒光定量PCR 反應(yīng)分析，反應(yīng)體系：Eva Green 2x qPCR Master Mix 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，cDNA 3.5 μL，ddH2O 0.9 μL；qPCR 程序：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，進行39 個循環(huán)，每個樣本3 個重復(fù)。采用 2-△△CT法計算相關(guān)基因的相對表達水平。

表1 用于熒光定量的引物序列

1.4 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

1.4.1 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng) 將10 日齡種蛋用酒精消毒后，置于蛋托上，用鑷子輕輕敲破蛋殼，將氣室上部蛋殼剔除，用另一把鑷子撕開氣室薄膜，注意不要污染蛋清。使用一把新鑷子將雞胚夾出，置于細胞培養(yǎng)皿上，剔除雞胚腿部肌肉皮膚后將雞胚腿部肌肉剪下，置于一個新的培養(yǎng)皿中，用含雙抗的PBS 洗滌3 次，剔除皮、血管、脂肪、結(jié)締組織。將雞胚腿部肌肉剪至肉糜狀，將肉糜吸入移至15 mL 離心管中，加入0.25%的胰酶37℃消化10 min。加入含10% FBS 的DMEM 全培養(yǎng)基終止消化，用70 μm 的濾網(wǎng)過濾到另一新的細胞培養(yǎng)皿中。將細胞濾液移至新的15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心8 min，棄上清，用含15%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h 后，吸取細胞懸液至新的培養(yǎng)瓶，進行連續(xù)平板培養(yǎng)以富集肌衛(wèi)星細胞并消除成纖維細胞，用2% 馬血清替換15% 胎牛血清誘導(dǎo)細胞分化。

1.4.2 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的鑒定 取分離的雞骨骼肌衛(wèi)星進行培養(yǎng)，待細胞長至70%～80%融合度時，參考Luo 等[7]采用的免疫熒光檢測方法，將培養(yǎng)的細胞用爬片處理后，對骨骼肌衛(wèi)星細胞標(biāo)志基因Pax7及Desmin進行免疫熒光染色。取另一批分離的雞骨骼肌衛(wèi)星細胞，待細胞長至70%～80%融合度時，更換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，分化4 d 后對骨骼肌細胞分化標(biāo)志基因Myhc進行免疫熒光染色。隨后，用熒光倒置顯微鏡拍照。

1.5 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)不同時期的RNA 提取 取分離的雞骨骼肌衛(wèi)星進行培養(yǎng)，待細胞分裂、增殖至70%～80% 細胞融合度時，更換成分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2、4、6 d，70%～80%細胞融合度的時間記為0 d。收集提取處于增殖期30% 細胞融合度、50% 細胞融合度、70%～80% 細胞融合度（0 d）以及處于分化期2、4、6 d 的骨骼肌細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后置于-20℃凍存。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對關(guān)鍵差異基因PHGDH進行熒光定量PCR 檢測分析。

1.6 細胞的轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)的雞骨骼肌衛(wèi)星細胞鋪于6 孔板中，待細胞分裂、增殖至70%～80%細胞融合度時，更換無血清無雙抗培養(yǎng)基。將合成的PHGDH特異性的siRNA 試劑及陰性對照（NC）按照Lipofectamine?3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染至雞骨骼肌細胞中。將細胞放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 后換液。

1.7 EdU 細胞增殖檢測 轉(zhuǎn)染4～6 h 后，將雞骨骼肌衛(wèi)星細胞在含有10 mmol/L EdU 的新鮮生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，每5 min 用PBS 清洗細胞2 次，隨后在每孔中加入4% 多聚甲醛進行固定，室溫靜置30 min 后吸去細胞固定液。隨后加入2 mg/mL 的甘氨酸，置于脫色搖床孵育5 min，吸去溶液。在脫色搖床上用PBS 清洗細胞5 min，加入配制好的滲透劑，置于脫色搖床孵育10 min，再用PBS 清洗5 min。避光加入Apollo 染色反應(yīng)液，室溫下置于脫色搖床上30 min 后吸去染色反應(yīng)液。再次加入滲透劑清洗2～3 次，每次均置于脫色搖床上10 min，后棄去滲透液。每5 min 加入甲醇清洗1～2 次，再用PBS 清洗5 min。避光加入1×Hoechst 33342 反應(yīng)液，在室溫下置于脫色搖床30 min，后棄去染色反應(yīng)液。PBS 清洗3 次后封片拍照，也可避光置于4℃濕潤保存待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 日增重數(shù)據(jù)分析 由圖1 可知，地面平養(yǎng)肉雞的日增重極顯著高于籠養(yǎng)肉雞。

2.2 測序質(zhì)量評估 對10 個樣本進行質(zhì)量檢測，從表2 中可以看出其中Q20 和Q30 均在90% 以上，GC 含量在49%～53%，說明測序堿基識別時出錯的概率較低，堿基含量接近，樣本組成情況良好。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

將測序獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組進行Map（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)比對到參考基因組上的 Reads 數(shù)目均大于75%，比對到參考基因組唯一位置的Reads 數(shù)目在74%～92%，從比對結(jié)果統(tǒng)計來看，各樣品的Reads 與參考基因組的比對效率在78.29%～91.18%，這表明樣本的可利用率較高。綜上分析，測序數(shù)據(jù)良好，可以進行下一步數(shù)據(jù)分析。

與此同時，對測序數(shù)據(jù)進行了基因表達相關(guān)性散點圖分析，偏離對角線的點越少，則說明樣本間相關(guān)性越高，樣品的重復(fù)性越好（圖2）。

2.3 差異表達基因篩選 根據(jù)差異表達的基因構(gòu)建火山圖，以-lg（FDR）為縱坐標(biāo)，log2（FC）為橫坐標(biāo)（圖3），橫坐標(biāo)表示某一個基因在兩樣品中表達量差異倍數(shù)的對數(shù)值，結(jié)果表明差異基因在兩組樣品間的差異表達倍數(shù)較大?？v坐標(biāo)表示差異表達顯著性，結(jié)果表明差異基因顯著性較高，篩選得到的差異表達基因較為可靠。將FDR＜0.05 作為差異表達基因篩選條件，篩選2 組樣品中的差異表達基因，最終篩選出3 個上調(diào)基因，分別為親聯(lián)蛋白2 基因（JPH2）、3-磷酸甘油酸脫氫酶基因（PHGDH）、天冬酰胺合成酶基因（ASNS）（表4）。

表3 與參考基因組比對統(tǒng)計結(jié)果

2.4 熒光定量PCR 驗證 圖4 顯示，3 個差異表達基因在不同飼養(yǎng)模式下的表達水平均存在顯著或極顯著的差異，而隨機選取的2 個任意基因差異不顯著。表明熒光定量PCR 驗證的結(jié)果與RNA-Seq 中基因表達檢測的結(jié)果一致。

表4 差異表達基因統(tǒng)計表

2.5 肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)與鑒定 結(jié)果顯示，Pax7在細胞核中呈陽性表達（圖5-A），Desmin和Myhc在細胞質(zhì)中呈陽性表達（圖5-D 和圖5-G）。表明本實驗所分離的細胞是肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞。

2.6PHGDH在肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)不同時期的表達譜檢測 如圖6 所示，PHGDH基因的表達水平在細胞增殖期逐漸升高。在細胞分化第2～6 天逐漸降低，但在分化第2 天PHGDH基因的表達量顯著高于第0 天。表明PHGDH可能在不同飼養(yǎng)模式肉雞的骨骼肌形成過程中發(fā)揮重要作用。

2.7 抑制PHGDH對肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響如圖7 所示，siRNA-PHGDH組細胞與NC 對照組相比，EdU 陽性細胞的比例極顯著減少，表明處于增殖狀態(tài)下的細胞比例減少。

3 討 論

飼養(yǎng)模式是影響肉雞肌肉發(fā)育代謝的一個重要因素，已有研究表明飼養(yǎng)方式能夠很大程度上影響肉雞肌肉發(fā)育，同時也與雞肉肉質(zhì)品質(zhì)變化密切相關(guān)[8]。分析不同飼養(yǎng)模式下肉雞肌肉中差異表達的基因，對進一步科學(xué)地利用適宜的飼養(yǎng)方式改良肉雞生長與肉質(zhì)性狀具有重要的推動作用。

本實驗通過對平養(yǎng)和籠養(yǎng)2 種飼養(yǎng)模式下的肉雞肌肉組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，共篩選出3 個與肌肉發(fā)育代謝相關(guān)的重要差異表達基因，分別為ASNS、JPH2和PHGDH基因，且差異基因均在平養(yǎng)模式雞腿肌中高表達，在籠養(yǎng)模式中低表達。ASNS 與天冬酰胺的合成密切相關(guān)，是氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一[9]。研究發(fā)現(xiàn)在仔豬日糧中添加天冬酰胺能夠有效促進肌肉中蛋白質(zhì)的合成[10]，而在之前的一項研究中發(fā)現(xiàn)平養(yǎng)雞肌肉中總蛋白含量要顯著高于籠養(yǎng)雞[11]。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的ASNS基因在平養(yǎng)雞肌肉中高表達的結(jié)果，可能正是闡明飼養(yǎng)模式影響雞肌肉總蛋白含量變化的關(guān)鍵所在。JPH2 是肌肉橫管和肌質(zhì)網(wǎng)縫隙連接中的重要功能蛋白，它在維持橫管結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肌肉中，JPH2的表達可以加快鈣離子釋放，促進肌肉興奮-收縮耦聯(lián)機制，更有利于肌肉的運動[12]。有研究發(fā)現(xiàn)JPH2的表達對小鼠肌肉發(fā)育至關(guān)重要[13]。平養(yǎng)模式下的肉雞運動量往往高于籠養(yǎng)雞，運動強度的增加勢必需要進一步加快骨骼肌興奮收縮機制，因此JPH2基因的表達就顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)JPH2基因在平養(yǎng)雞肌肉中高表達，這進一步說明JPH2基因可能是影響平養(yǎng)肉雞肌肉發(fā)育代謝的關(guān)鍵基因之一。PHGDH 是絲氨酸合成途徑中的限速酶，在該合成途徑中會產(chǎn)生許多代謝中間產(chǎn)物，如絲氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和磷脂等，這些產(chǎn)物對于蛋白質(zhì)合成和細胞生長是不可或缺的[14]。盡管目前PHGDH在肌肉細胞中發(fā)揮作用的具體機制還未可知，但已有研究表明PHGDH是調(diào)控細胞生長的一個基本調(diào)節(jié)因子，過表達PHGDH能夠顯著促進細胞的增殖[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PHGDH基因在平養(yǎng)雞肌肉中高表達，這表明在該飼養(yǎng)方式下肌肉中絲氨酸的合成速率可能較快。

對目的基因進行表達譜檢測，通常是初步探究其生理功能的重要手段之一。鑒于PHGDH在肌肉生長發(fā)育中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用，本研究成功分離、鑒定并構(gòu)建了雞骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化模型，發(fā)現(xiàn)PHGDH基因在雞骨骼肌細胞增殖期間的表達量逐漸上調(diào)，表明PHGDH基因可能在雞骨骼肌細胞增殖過程中起到正調(diào)控作用。而已有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PHGDH表達可顯著抑制癌細胞的增殖[16]。此外，本研究通過EdU 細胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)，抑制PHGDH表達可顯著減少處在增殖期的肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞比例。由此推測，PHGDH基因可能對雞肌肉細胞的增殖起正調(diào)控作用，可能是不同飼養(yǎng)模式影響肌肉生長發(fā)育的一個關(guān)鍵基因。

本研究還發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細胞分化期間，PHGDH的表達量逐漸降低，這表明PHGDH可能在雞骨骼肌細胞分化過程中起到負調(diào)控作用。而PHGDH在分化第2 天出現(xiàn)的高表達現(xiàn)象可能是由于在本分化模型前期大部分雞骨骼肌細胞仍短時處于增殖狀態(tài)。綜上，本研究下一步將主要側(cè)重于對PHGDH在雞骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化過程中的調(diào)控機制進行探究。

4 結(jié) 論

本研究基于RNA-seq 技術(shù)，對不同飼養(yǎng)模式下的肉雞腿肌進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)了3 個與肌肉發(fā)育代謝相關(guān)的關(guān)鍵差異基因（ASNS、JPH2、PHGDH），且均在平養(yǎng)模式雞腿肌肌肉中高表達；對PHGDH基因在肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)的不同時期進行表達譜檢測分析，以及結(jié)合抑制PHGDH表達的EdU 細胞增殖檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PHGDH基因可能在肉雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用，PHGDH基因可能是飼養(yǎng)模式影響肉雞肌肉發(fā)育的一個關(guān)鍵基因。