不同光質(zhì)LED光源對(duì)魚腥草幼苗膜脂過氧化及抗氧化酶的影響

申圣圣 楊利艷 喬美玉 王昭清 王創(chuàng)云

摘 要： 以魚腥草為材料，以日光燈處理為對(duì)照，分析了不同光質(zhì)LED光源（白、紅、黃、綠、藍(lán)LED燈）對(duì)魚腥草葉片活性氧、類黃酮含量及抗氧化酶的影響。結(jié)果表明，藍(lán)光下葉片中TBARS（硫代巴比妥酸）含量最高，較對(duì)照高30.18%，與希夫試劑染色結(jié)果相一致;過氧化氫產(chǎn)生最多，較對(duì)照高190.21%，與DAB染色結(jié)果一致;超氧陰離子產(chǎn)生速率在藍(lán)光下最高，為對(duì)照組的1.54倍，白光下最低;藍(lán)、綠光下脯氨酸含量是對(duì)照的2倍;藍(lán)光和黃光處理下，黃酮含量較對(duì)照提高了21.4%。藍(lán)、綠光提高了SOD2同工酶的表達(dá)，且在藍(lán)光下最高;藍(lán)、綠、紅、黃光處理分別誘導(dǎo)了更多的POD基因位點(diǎn)的表達(dá);不同LED光質(zhì)均提高了CAT抗氧化酶活性，其中藍(lán)、綠光下CAT同工酶的表達(dá)量明顯高于對(duì)照。綜上所述，藍(lán)色光處理可以有效提高幼苗的抗氧化能力，可為魚腥草品質(zhì)的控制提供參考。

關(guān)鍵詞： 魚腥草; LED; 活性氧; 抗氧化; 黃酮

中圖分類號(hào)： S636.9? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ?文章編號(hào)：1673-2871（2020）04-017-06

Abstract： In this study， Houttuynia cordata Thunb. was used as plant material， and the group with fluorescent lamp treatment was the control group. The effects of LED light with different light quality （white， red， yellow， green and blue LED lights） on reactive oxygen species， flavonoids content and antioxidant enzymes of Houttuynia cordata Thunb. leaves were analyzed. The results showed that under blue light， the TBARS content was the highest， 30.18% higher than the control group， which was consistent with Schiff reagent staining results. And hydrogen peroxide produced the most， 190.21% higher than the control group， which agreed with DAB staining. The superoxide anion production rate was the highest under blue light which was 1.54-fold compared with the control group， and it was the lowest under white light treatment. Proline content was 2-fold to the control group. The content of flavonoids increased by 21.4% in blue and yellow light treatments compared with the control group. Blue and green light enhanced the expression of SOD2 isoenzyme， and it was the highest under blue LED. Blue， green， red and yellow LED induced more POD gene loci expression， respectively. The various LED monochromatic light improved the CAT activity， within them， CAT activity in blue and green light treatment was obviously improved. In conclusion， blue light treatment can effectively improve the antioxidant capacity of seedlings.

Key words： Houttuynia cordata Thunb.; LED; Reactive oxygen species; Antioxidant

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）又名折耳根，為多年生草本，全株有腥臭味，常呈紫紅色[1]。作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥植物，魚腥草不僅具有抗菌、抗病毒等藥用價(jià)值，同時(shí)富含大量的碳水化合物、膳食纖維、氨基酸和一些生命活動(dòng)必需的礦質(zhì)元素，是中國(guó)衛(wèi)生部評(píng)定的藥食兩用植物[2]。近年來，隨著人們物質(zhì)生活水平和保健意識(shí)的提高，可食用植物的保健價(jià)值受到越來越多的關(guān)注，天然抗氧化物質(zhì)成為大眾關(guān)注的熱點(diǎn)。

光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要環(huán)境因子，它不僅是植物進(jìn)行光合作用的能量來源，而且還作為環(huán)境信號(hào)對(duì)植物的代謝起調(diào)控作用[3-4]。20世紀(jì)50年代，試驗(yàn)證實(shí)了光質(zhì)的存在并發(fā)現(xiàn)其調(diào)控植物的生長(zhǎng)。大量研究表明，光質(zhì)對(duì)植物的光形態(tài)建成、光合特性、內(nèi)源激素、生物產(chǎn)量以及抗氧化系統(tǒng)都有影響[5]。由于植物識(shí)別光質(zhì)的受體不同，因此不同光質(zhì)對(duì)植物發(fā)育及代謝的影響不盡相同[6]。光質(zhì)的變化會(huì)引起植物代謝的相應(yīng)改變，發(fā)光二極管（LED）作為新型半導(dǎo)體固態(tài)冷光源，具有發(fā)光效率高、發(fā)熱低、體積小、能耗低、壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，能提供植物生長(zhǎng)所需的特定光譜[7-8]。對(duì)LED單色光譜的光源進(jìn)行組合能提高光合作用效率，節(jié)約能源[9]。目前LED光源已應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)、設(shè)施園藝、蔬菜栽培、溫室補(bǔ)光、種苗生產(chǎn)和芽苗菜培養(yǎng)等領(lǐng)域。有研究表明，單色LED紅光、藍(lán)光處理能夠提高植物抗氧化酶POD、SOD和CAT的活性，而綠光則有抑制作用[10]。不同光質(zhì)處理如何影響魚腥草活性氧的產(chǎn)生，如何利用LED光源提高其抗氧化能力值得進(jìn)一步研究。

筆者以不同光質(zhì)LED光源培養(yǎng)魚腥草，通過組織化學(xué)染色對(duì)其在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧如TBARS（硫代巴比妥酸）、H2O2（過氧化氫）、O2-·（超氧陰離子）進(jìn)行了測(cè)定，并分析了不同光質(zhì)LED下黃酮的積累及抗氧化酶活性，以期為利用LED燈提高魚腥草抗氧化能力提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

采用優(yōu)質(zhì)魚腥草（購(gòu)自湖北宜昌）根莖進(jìn)行繁殖。

1.2 方法

試驗(yàn)于2017年4月12日至8月20日在山西臨汾，山西師范大學(xué)3號(hào)樓生物工程實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。將新鮮魚腥草根莖放在盛有適量自來水的塑料水培槽中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度25 ℃/20 ℃，光照周期晝/夜（8 h/16 h），每3 d換水1次，待魚腥草根莖上的幼芽完全展開后，將長(zhǎng)勢(shì)較好的魚腥草移栽到盛有25% Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培槽中按原條件培養(yǎng)。待第3片葉子完全展開后，移到溫室用不同光質(zhì)的LED光源處理（表1），3周以后取材測(cè)定。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 TBARS含量的測(cè)定及脂質(zhì)過氧化染色顯示? 以TBARS含量表示脂質(zhì)過氧化。用0.1%（w）三氯乙酸溶液冰浴研磨提取，取上清，加入0.5%TBA（溶解于20%三氯乙酸），依次在450、532、600 nm測(cè)定吸光值[11]，計(jì)算TBARS含量：TBARS含量（μmol·g-1）=6.45（OD532-OD600）-0.56×OD450。脂質(zhì)過氧化程度根據(jù)希夫試劑染色法測(cè)定，染色后拍照[12]。

1.3.2 過氧化氫含量的測(cè)定及組織化學(xué)染色 用硫酸鈦比色法測(cè)定過氧化氫含量，測(cè)定波長(zhǎng)412 nm的吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，過氧化氫物質(zhì)的量（nmol）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析結(jié)果。用DAB染色法顯示過氧化氫含量[13-14]。

1.3.3 超氧陰離子的產(chǎn)生速率測(cè)定 用羥胺法測(cè)定超氧陰離子產(chǎn)生速率[15]，530 nm處測(cè)定吸光度。超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol·min-1·g-1）=（n×V×1 000）/（Vs×t×m）。式中：n是由標(biāo)準(zhǔn)曲線所查的溶液中的超氧陰離子的物質(zhì)的量（μmol）;V是樣品提取液總體積（mL）;Vs是測(cè)定時(shí)取樣液體積（mL）;t是樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)間（min）;m是樣品鮮質(zhì)量（g）。

采用NBT方法測(cè)定超氧陰離子含量：將魚腥草浸泡于0.1%的NBT染色，在乙醇中脫色后拍照[16]。

1.3.4 脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定 用磺基水楊酸比色法測(cè)定[17]。脯氨酸含量（mg·g-1）=（C×V）/（W×Vs×103）。式中：C是根據(jù)回歸方程計(jì)算的脯氨酸含量（μg·mL）;V是提取液總體積（mL）;Vs是測(cè)定時(shí)取用樣液的體積（mL）;W是樣品干質(zhì)量（g）。

1.3.5 黃酮類化合物的測(cè)定 黃酮類化合物的提取以乙醇為溶劑，采用索氏回流法提取[18]，以蘆丁為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定黃酮類物質(zhì)的含量。黃酮含量（μg·mL-1）=C×V×10-6式中：C是從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的黃酮濃度（μg·mL-1）;V是提取的濃縮液體積（mL）;10-6是將μg·mL-1換算的系數(shù)。

1.3.6 同工酶電泳分析 稱取各處理組0.2 g魚腥草葉片，棄葉脈，制備粗酶液，離心、取上清與等體積上樣緩沖液，進(jìn)行PAGE同工酶凝膠電泳，然后將凝膠置于盛有顯色液的培養(yǎng)皿中，于搖床上顯色觀察。

超氧化物歧化酶同工酶（SOD）染色采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法;過氧化物酶（POD）同工酶采用聯(lián)苯胺染色法;過氧化氫酶（CAT）同工酶采用 FeCl3染色法[19-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)的LED光源對(duì)TBARS含量的影響

不同光質(zhì)的LED光源培養(yǎng)條件下，魚腥草葉片TBARS含量變化如圖所示（圖1-a）。與對(duì)照組相比，在LED藍(lán)光、綠光、白光下，TBARS含量均有提高，分別提高了26.2%、13.0%、9.8%;在黃光、紅光下，TBARS含量分別降低了20.2%、8.2%;藍(lán)光下TBARS含量最高，表明LED藍(lán)光下葉片膜脂受到傷害最大。

在不同光質(zhì)的LED下，魚腥草葉片希夫試劑的染色結(jié)果如圖所示（圖1-b），顏色深淺反應(yīng)了膜脂的過氧化程度。其顏色變化由深到淺如下：藍(lán)光、綠光、白光、對(duì)照組、紅光、黃光，與TBARS測(cè)定結(jié)果一致。

2.2 不同光質(zhì)的LED光源對(duì)過氧化氫含量的影響

在不同光質(zhì)的LED培養(yǎng)下，魚腥草葉片過氧化氫含量變化如圖所示（圖2-a），與對(duì)照組相比，除紅光組外，其他光質(zhì)處理極顯著地提高了過氧化氫的含量。紅光組、黃光組、綠光組、白光組和藍(lán)光組分別提高了6.6%、40.6%、75.8%、86.9%、170.0%，結(jié)果表明，不同光質(zhì)的LED光源普遍使過氧化氫含量增加，用藍(lán)光處理時(shí)含量的變化最顯著。

DBA能和過氧化氫反應(yīng)生成深褐色的聚合物，葉片顏色的深淺反應(yīng)了過氧化氫的積累量。本試驗(yàn)中，對(duì)照組中生成的聚合物顏色最淺，藍(lán)光照射下葉片的染色最深，與測(cè)定結(jié)果一致（圖2-b）。

2.3 不同光質(zhì)的LED光源對(duì)魚腥草超氧陰離子生成速率及含量的影響

不同光質(zhì)LED對(duì)魚腥草葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率不同（圖3-a）。與對(duì)照組相比，藍(lán)光和黃光顯著提高了超氧陰離子的產(chǎn)生速率，分別提高了49.00%、38.18%;白光和綠光處理下超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著降低。即超氧陰離子在LED藍(lán)光下產(chǎn)生速率最高，白光下最小。魚腥草葉片中NBT染色如圖（圖3-b）。LED藍(lán)光下葉片的染色最深，白光下葉片染色最淺，組織化學(xué)染色與試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

2.4 不同光質(zhì)的LED光源對(duì)魚腥草葉片脯氨酸含量的影響

在不同光質(zhì)的LED培養(yǎng)下，魚腥草葉片脯氨酸含量變化如圖所示（圖4），與對(duì)照組相比，不同光質(zhì)的LED光源均顯著提高了魚腥草葉片中脯氨酸的含量，其中藍(lán)光與綠光組的脯氨酸含量最高，兩組間差異不顯著;紅光與白光組的脯氨酸含量差異不顯著，低于藍(lán)光、綠光組;黃光組與其他各組之間存在明顯的差異。藍(lán)光、綠光下脯氨酸的含量較其他光質(zhì)處理高。

2.5 不同光質(zhì)的LED光源對(duì)魚腥草葉片黃酮含量的影響

在不同光質(zhì)的LED燈下 ，魚腥草葉片中的黃酮類化合物含量變化如圖5，不同波長(zhǎng)的LED光均顯著提高了黃酮類物質(zhì)的含量，紅、黃、綠、藍(lán)光組分別較對(duì)照提高了15%、22%、20%、22%，但這4組的黃酮類含量差異不顯著;LED白光組的黃酮類化合物含量較對(duì)照組變化也顯著。可以看出，藍(lán)光、黃光最大程度地提高了葉片中黃酮含量，綠光次之，說明LED光源能夠促進(jìn)魚腥草黃酮類化合物的合成，且單色光源有顯著的促進(jìn)作用。

2.6 對(duì)魚腥草葉片SOD同工酶的影響

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物質(zhì)，與體內(nèi)的CAT和POD一起組成一條完整的防氧化鏈條，完成對(duì)超氧自由基的清除。在不同光質(zhì)的LED燈下 ，魚腥草葉片中的SOD同工酶表達(dá)量變化如圖6、表2，結(jié)果顯示，藍(lán)色、綠色波長(zhǎng)的LED光顯著提高了SOD1、SOD2同工酶的表達(dá)量，且在藍(lán)光下的表達(dá)量為最高，黃光抑制了SOD1、SOD2的表達(dá)量，但最大程度激發(fā)了SOD3的表達(dá)。說明藍(lán)色LED光對(duì)清除魚腥草超氧自由基起到積極作用。

2.7 對(duì)魚腥草葉片POD同工酶的影響

在不同光質(zhì)的LED燈下，魚腥草葉片中的POD同工酶表達(dá)量變化如圖7、表3，POD是對(duì)環(huán)境變化非常敏感的氧化酶。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅、黃、綠、藍(lán)光處理分別誘導(dǎo)了更多的POD基因位點(diǎn)表達(dá)，其中，綠光誘導(dǎo)了POD3、POD4和POD7 3條譜帶;紅光、藍(lán)光則誘導(dǎo)了POD3、POD7;白光處理與對(duì)照組POD基因的表達(dá)一致。比較各譜帶的IOD可知：POD1、POD2、POD5和POD6的表達(dá)量在大多LED單色光處理下均高于對(duì)照組。說明LED光源能夠促進(jìn)魚腥草對(duì)POD同工酶的表達(dá)，且多數(shù)情況下單色光源有顯著的促進(jìn)作用。

2.8 對(duì)魚腥草CAT同工酶的影響

在不同光質(zhì)的LED燈下，魚腥草葉片中的CAT同工酶表達(dá)量變化如圖8、表4，經(jīng)多次不同的凝膠染色方法對(duì)CAT同工酶染色確定，魚腥草的CAT同工酶僅有一條酶帶。不同光質(zhì)影響了CAT的表達(dá)量，但并沒有誘導(dǎo)更多的CAT基因位點(diǎn)表達(dá)。對(duì)IOD分析表明CAT的表達(dá)量依次為綠光>白光>藍(lán)光>紅光>黃光>對(duì)照，即以上光質(zhì)均提高了CAT的表達(dá)。表明單色LED光源對(duì)CAT同工酶含量的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

植物生長(zhǎng)受諸多環(huán)境因子的影響，逆境會(huì)造成植物的膜脂產(chǎn)生過氧化損傷。TBARS是膜脂過氧化的產(chǎn)物，可以作為膜脂過氧化程度的指標(biāo)，本試驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)光對(duì)膜脂的傷害最大，綠光次之，與短波能量高相一致，也與胡陽(yáng)的研究結(jié)果相一致（REF）[22]。當(dāng)植物所受脅迫超過其自身調(diào)節(jié)能力時(shí)，植物體內(nèi)活性氧（ROS）的代謝平衡遭到破壞，過量的活性氧會(huì)引發(fā)膜脂的過氧化從而使生物膜系統(tǒng)遭到破壞，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損甚至導(dǎo)致植物體死亡。測(cè)定組織中自由基的活躍狀態(tài)，可間接了解組織受損狀況以及抗性強(qiáng)弱。本試驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)光下魚腥草葉片O2-·產(chǎn)生速率最快，含量最多，與盧素萍[23]的研究結(jié)果一致，且各LED處理下植物組織中的過氧化氫含量都高于對(duì)照組。

抗氧化系統(tǒng)是植物重要的防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶和一些分子如脯氨酸。在生物體內(nèi)，脯氨酸不僅僅是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且還可作為膜和酶的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑[24]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，綠光和藍(lán)光處理組中脯氨酸含量最高，由于短波能量高對(duì)膜的氧化損傷加劇，所以植物通過積累更多的脯氨酸來降低對(duì)膜的損傷，這是植物的自我防御響應(yīng)[25]。但王莉榮等[26]研究表明，紅光處理提高了葡萄試管苗中游離脯氨酸含量，可能與不同物種或處理強(qiáng)度不同有關(guān)。

張寒等[27]研究表明，單色LED紅光、藍(lán)光處理能夠提高魚腥草抗氧化酶POD、SOD和CAT的活性，而綠光則有抑制作用，本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同氧化酶對(duì)不同光質(zhì)的響應(yīng)不同，其中POD的響應(yīng)更為敏感，綠光、藍(lán)光和紅光誘導(dǎo)了新的基因位點(diǎn)的表達(dá)并提高了酶活，不同光質(zhì)不能誘導(dǎo)SOD和CAT新的基因位點(diǎn)的表達(dá)，但可以提高其活性，均為綠光下活性最高，與郝俊江等[28]的研究結(jié)果一致。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界某些植物和漿果中，是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)氧自由基，其阻止氧化的能力是維生素E的10倍以上，這種抗氧化作用可以延緩細(xì)胞衰老和退化，并抑制癌癥的發(fā)生[29]。同時(shí)，黃酮類物質(zhì)可以改善血液循環(huán)，降低膽固醇含量，促進(jìn)傷口愈合，對(duì)膠原蛋白起穩(wěn)定作用。筆者發(fā)現(xiàn)，通過藍(lán)、黃LED光照處理可以增加葉片中黃酮的積累，說明適宜的高能量光可以促進(jìn)魚腥草抗氧化物質(zhì)的積累，與徐琳煜[30]的研究結(jié)果一致。因此，設(shè)施栽培中可以根據(jù)不同需求設(shè)置不同光照條件，以提高天然生物活性物質(zhì)的含量，從而利于中藥材品質(zhì)控制及可持續(xù)利用。

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