利用發(fā)根農(nóng)桿菌體系檢測西瓜CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶位點

張月喬 葛潔 田樹娟 袁黎

摘 要： 西瓜遺傳轉(zhuǎn)化技術周期長，過程復雜，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)又存在著一定的脫靶效應，為了保障所選擇的靶位點的可行性，本研究選擇西瓜ClSPO11-1基因（ID：Cla003301）為靶標，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構建雙靶點的基因敲除載體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子葉外植體，通過簡單的組培過程，使西瓜外植體長出不定根，在不定根中檢測到了在靶位點1處發(fā)生了不同程度的堿基缺失，經(jīng)過與野生型氨基酸序列比對分析后發(fā)現(xiàn)均造成了翻譯提前終止和氨基酸的突變，成功實現(xiàn)了對西瓜不定根的基因編輯，該方法周期短，操作簡便，實現(xiàn)了快速鑒定在西瓜中選擇的靶位點的靶向效率，為研究西瓜基因功能和遺傳改良提供了保障。

關鍵詞： 西瓜; CRISPR/Cas9系統(tǒng); 發(fā)根農(nóng)桿菌; 基因敲除

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）04-007-05

Abstract： Watermelon genetic transformation technology is time consuming and process complicated. The CRISPR/Cas9 gene editing system has a certain off-target effect. In order to ensure the feasibility of the selected target site， the watermelon ClSPO11-1 gene （ID：Cla003301） was selected in this study as target， using the CRISPR/Cas9 gene editing system to construct a double-target gene knockout vector， using Agrobacterium rhizogenes Ar. Qual strain to infect watermelon cotyledon explants， and to make watermelon explants growing through a simple tissue culture adventitious roots. In the adventitious roots， different degrees of base deletions at target site 1 were detected. After comparison and analysis with amino acid sequences of wild-type ， both premature translation termination and amino acid mutations was found. This method has a short cycle and simple operation. It achieves the rapid target identification efficiency of selected target sites in watermelon， and provides a guarantee for the study of watermelon gene function and genetic improvement.

Key words： Watermelon; CRISPR/Cas9 system; Agrobacterium rhizogenes; Gene knockout

西瓜（Citrullus lanatus）屬于葫蘆科西瓜屬，是原產(chǎn)于非洲的一種重要經(jīng)濟作物，因其具有清熱解暑，除煩止渴，通便利尿和降血壓等多種功效，深受人們喜愛，并廣泛栽培于世界各地。目前，我國西瓜的栽培面積、產(chǎn)量及人均消費量均居世界首位[1]，北起黑龍江，南到海南島，西從西北邊疆，東到東南沿海，均有栽培。隨著西瓜全基因組測序的完成，西瓜的遺傳研究已經(jīng)步入了后基因組的時代[2]，對于西瓜重要的一些農(nóng)藝性狀相關的基因雖有預測，但對于其功能的驗證仍然存在著一定的困難。

基因編輯技術作為合成生物學的核心技術，是近幾年發(fā)展起來的對基因組進行定向精確修飾的技術，在特定的基因位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，借助編輯受體DNA自身的修復系統(tǒng)可以對基因組中的靶位點進行敲除、插入、堿基替換、點突變等定點人工修飾。由于構建載體的過程簡單以及編輯效率高等優(yōu)點，CRISPR/Cas系統(tǒng)已然成為當前應用的主流基因編輯系統(tǒng)，其中應用最為廣泛的是CRISPR/Cas9系統(tǒng)。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)不僅可以在人類和小鼠的細胞內(nèi)進行基因編輯，也可以在擬南芥、水稻、煙草、番茄、玉米、西瓜、葡萄等模式植物和糧食作物以及園藝植物中實現(xiàn)定點基因編輯，但是要獲得穩(wěn)定的突變體植株仍還需要大量工作[3-5]。然而該系統(tǒng)在使用過程中由于靶位點在全基因組中可能存在了高度相似的序列從而引起Cas9在其他位置出現(xiàn)切割，導致了非預期的突變，即產(chǎn)生了所謂的脫靶效應[6-7]。

轉(zhuǎn)基因技術是當今生物技術研究的熱點，是研究基因功能及作物改良的重要技術。目前應用較廣泛的轉(zhuǎn)基因方法主要有以下幾種類型，農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、聚乙二醇（PEG）法、電激法、花粉管通道法等，在西瓜中主要運用的是農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌是一種普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生發(fā)狀根[8]。其原理是發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中含有Ri質(zhì)粒[9]，其上具有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口后進入細胞，可以將T-DNA插入到植物的基因組中[10]。已有研究表明利用發(fā)根農(nóng)桿菌可以在多種植物中成功誘導出不定根，例如茄科、十字花科、豆科以及葡萄等植物[11-12]。

由于西瓜遺傳轉(zhuǎn)化周期長，遺傳轉(zhuǎn)化的過程復雜以及轉(zhuǎn)化效率低，CRISPR/Cas系統(tǒng)自身存在脫靶效應這一現(xiàn)象，因此評估所選擇的靶位點的可行性對西瓜實現(xiàn)成功的基因組編輯是至關重要的[13]。筆者通過建立一種新的發(fā)根農(nóng)桿菌介導的西瓜子葉外植體產(chǎn)生不定根方法可以快速誘導西瓜產(chǎn)生不定根，為實現(xiàn)基因組編輯、西瓜的基因功能驗證奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料及載體菌株

野生種質(zhì)‘YL，生長于北緯36°～39°，東經(jīng)107°～111°，抗旱性強并且具備一定的抗枯萎病能力。由于‘YL可以實現(xiàn)高效且穩(wěn)定的再生體系，因此本試驗的供試材料為野生西瓜種質(zhì)‘YL，試驗材料于2019年3—6月在西北農(nóng)林科技大學園藝學院楊凌西甜瓜試驗示范基地的塑料大棚內(nèi)種植，收種，該試驗基地位于關中平原，屬暖溫帶半濕潤氣候帶。CRISPR/Cas9基因編輯載體PBSE402，pCBC-DT1T2載體由西北農(nóng)林科技大學西甜瓜課題組提供;大腸桿菌（E. coli）DH5ɑ菌株和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株Ar. Qual購于上海唯地生物技術有限公司。試驗于2019年8—12月在西北農(nóng)林科技大學西甜瓜課題組進行。

1.2 靶位點的選擇

本試驗所選取的敲除基因為西瓜減數(shù)分裂關鍵基因ClSPO11-1（Gene ID：Cla003301），使用在線靶位點設計軟件（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）CRISPR-P2.0設計靶位點[14-16]。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)去識別目標序列中含有PAM序列的特點，通常選擇的靶位點的GC含量不應低于40%，并且需要對靶位點進行特異性分析，避免實驗中造成脫靶現(xiàn)象。為了提高編輯效率，選擇2個靶位點進行編輯。

1.3 CRISPR/Cas9敲除載體的構建

（1）使用限制性內(nèi)切酶BsaI酶切PBSE402載體。反應體系為：PBSE402質(zhì)粒30 ?L，10×CutSmart Buffer 5 ?L，BsaI-HF 1.5 ?L，ddH2O 13.5 ?L，37 ℃下酶切2 h。使用天根DNA純化回收試劑盒回收線性化載體。

（2）根據(jù)已選擇的靶位點序列合成接頭引物，上游引物SPO11-1F：TCGAAGTAGTGATTGGCAT TCTGAGAAAAATCACGTTTTAGAGCTAGAAAT AGC和下游引物SPO11-1R：TTCTAGCTCTAAAA CTTTGAAGCGTTAGAGTCTCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC，將引物稀釋到10 ?mol·L-1，以稀釋100倍的中間載體pCBC-DT1T2為模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶進行PCR擴增，反應體系：10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 ?L，2 mmol·L-1 dNTPs 5 ?L，25 mmol·L-1 MgSO4 3 ?L，DT1SPO11-1F 1.5 ?L，DT1SPO11-1R 1.5 ?L，pCBC-DT1T2 1 ?L，KOD-Plus-Neo 1 ?L，ddH2O 32 ?L。反應程序為：94 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，切取膠塊進行膠回收。

（3）通過TAKARA公司的In-Fusion無縫連接酶將酶切的PBSE402載體以及PCR回收產(chǎn)物進行連接。

（4）將連接產(chǎn)物導入大腸桿菌感受態(tài)DH5ɑ中，涂于含有50 mg·L-1卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落用特異性引物U6-26-IDF：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC和U6-29-IDR：AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCA AC進行PCR檢測，送公司進行測序驗證。

（5）將測序正確的重組質(zhì)粒導入發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)Ar.Qual，每100 ?L感受態(tài)加入已驗證正確的重組質(zhì)粒1 μg，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5 min、液氮激凍5 min，37 ℃水浴5 min，冰浴5 min;再加入700 ?L無抗生素的TY液體培養(yǎng)基，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h。取200 ?L Ar.Qual涂布于含Cmr抗性的TY平板上，倒置放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱2～3 d。挑取單菌落進行PCR鑒定陽性克隆。

1.4 發(fā)根農(nóng)桿菌Ar.Qual介導的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化

（1）取成熟的西瓜‘YL種子50～55 ℃蒸餾水浸泡種子約30 min，取出浸泡后的種子去除種殼。在超凈工作臺中將已剝?nèi)〉姆N仁用75%的酒精清洗種仁約30 s，用無菌水清洗兩遍之后再用3%次氯酸鈉浸泡消毒15 min，再無菌水清洗5～7次之后晾干播種于MS固體培養(yǎng)基中，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。

（2）待種子發(fā)芽后將其取出，切去子葉的兩端，將剩余子葉部分均分成8塊便于侵染。

（3）將鑒定正確的發(fā)根農(nóng)桿菌Ar.Qual單菌落挑至含Cmr抗生素34 mg·L-1的TY液體培養(yǎng)基中，待菌液濃度搖至OD600=0.8時，用MS液體重懸菌液使其最終的OD600值為0.2。將切好的子葉浸泡在菌液重懸液中15 min，取出晾干放在墊有濾紙的MS固體培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)，25 ℃黑暗培養(yǎng)2 d。

（4）2 d天后將共培養(yǎng)的子葉取出，用無菌水洗去子葉表面多余的農(nóng)桿菌菌液，取出晾干放置于含有200 mg·L-1特美汀和1.4 mg·L-1 Basta的MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃光周期16 h/8 h培養(yǎng)，約2周之后觀察根的生長情況。

1.5 西瓜不定根基因編輯檢測

使用CTAB法分別提取發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化外植體誘導產(chǎn)生的不定根DNA，用SPO-1-F/R和SPO- 2-F/R對2個靶位點附近的序列分別進行PCR擴增，將能夠擴增出條帶的目的片段進行膠回收送測序，檢測分析靶位點是否出現(xiàn)編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙靶位載體的構建

根據(jù)CRISPR-P2.0在線工具設計了雙靶位點（圖1），分別位于第1個和第3個外顯子上，gRNA1的GC含量為36.8%，gRNA2的GC含量為42.1%。

根據(jù)雙靶位點的序列合成靶點接頭引物DT1SPO11-1F和DT1SPO11-1R，以中間載體pCBC- DT1T2為模板進行PCR反應擴增敲除載體所需要的元件（圖2-A），酶切CRISPR/Cas9敲除載體PBSE402后的PCR檢測結(jié)果（圖2-B）。將克隆的中間產(chǎn)物利用無縫克隆酶連接到酶切后的敲除載體PBSE402上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用載體特異性引物U6-26-IDF和U6-29-IDR進行菌落PCR驗證陽性克隆，PCR檢測條帶大小為626 bp（圖2-C），表明CRISPR/Cas9敲除載體構建成功。提取陽性克隆質(zhì)粒送公司使用測序引物EDIT-3進行測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)Ar.Qual中，挑取單克隆進行菌落PCR驗證（圖2-D），證明該質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌介導的西瓜轉(zhuǎn)化技術檢測靶位點的可行性

通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導的西瓜轉(zhuǎn)化體系對CRISPR/Cas9表達載體靶位點的可行性進行驗證，首先對切好的西瓜子葉外植體進行侵染，在25 ℃下共培養(yǎng)3 d，用無菌水進行脫菌后，放置于MS篩選培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)（圖3）。

提取長出的不定根系DNA用SPO-1-F/R和SPO-2-F/R對2個靶位點附近的序列分別進行PCR擴增之后瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測（圖4-A），將能夠擴增出條帶的目的片段進行膠回收送測序。測序結(jié)果表明（圖4-B），僅在靶位點1的位置出現(xiàn)了2種類型的缺失，分別是：1類型發(fā)生了10個堿基的缺失;2類型發(fā)生了2個堿基的缺失。但是在靶位點2的位置沒有出現(xiàn)編輯的情況（圖中未顯示），證明所選擇的靶位點1有效。結(jié)果表明該方法成功實現(xiàn)了在西瓜不定根中的基因編輯，發(fā)生了堿基的缺失。

在獲得的2個發(fā)生編輯的不定根中，進一步使用DNAMAN軟件對其氨基酸序列進行分析（圖5）。1植株由于在靶位點1處發(fā)生了10 bp堿基的缺失導致出現(xiàn)了7個氨基酸的突變以及在第13位氨基酸處翻譯提前終止;2植株由于在靶位點1處發(fā)生了2 bp堿基的缺失導致在第17位氨基酸處出現(xiàn)突變。結(jié)果表明ClSPO11-1編碼的氨基酸出現(xiàn)了不同程度的變異，成功敲除了ClSPO11-1基因。

3 討 論

隨著越來越多的生物基因組測序的完成以及模式生物基因功能的挖掘，利用反向遺傳學來研究基因功能至關重要。傳統(tǒng)的化學和物理等方法來獲得突變體植株存在隨機性[17]，需要大規(guī)模的突變體庫以及大規(guī)模的篩選[18]，因此耗時耗力。CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)實現(xiàn)了在植物在特定的位置引入突變，為基因功能的研究和遺傳改良的應用提供了新的思路。目前北京市農(nóng)林科學院許勇團隊已成功研究出西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化技術，并且在西瓜中利用CRISPR/Cas9對番茄紅素合成相關基因ClPDS進行編輯，與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法結(jié)合得到轉(zhuǎn)基因植株，并在其突變體中觀察到明顯的白化病表型[19]，結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在西瓜中進行基因組的編輯。

由于西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系過程復雜、周期長以及效率低等問題，本研究建立了一種新的發(fā)根農(nóng)桿菌介導的西瓜子葉外植體產(chǎn)生不定根的方法，該方法的優(yōu)點是試驗周期短、操作相對簡單，可以快速測定基因敲除靶位點選擇的可行性，避免在試驗過程中出現(xiàn)脫靶的情況。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建了雙靶位載體敲除西瓜ClSPO11-1基因，通過組培的方法誘導西瓜子葉外植體產(chǎn)生了不定根，最終獲得了2株在靶位點1處發(fā)生編輯的西瓜不定根突變體，表明了該方法檢測靶位點是可行的。有研究表明在煙草和蒲公英等植物中，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導產(chǎn)生的不定根進行脫分化和再分化可以培育成完整的轉(zhuǎn)基因植株[20-21]，在南瓜中也通過不定根成功誘導產(chǎn)生了南瓜愈傷組織[22]，為誘導西瓜不定根分化形成完整的轉(zhuǎn)基因植株提供了新的依據(jù)。

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