殺致倦庫蚊幼蟲芽孢桿菌的分離與功效研究*

高 元，丁 露，郭青云，譚小敏，謝青華，王子卓，戴小華

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)屬于尖音庫蚊復(fù)合組，是我國南方常見優(yōu)勢蚊種，也是城鎮(zhèn)入室吸血騷擾的主要 “家蚊”[1]，它是絲蟲病、流行性乙型腦炎、登革熱、西尼羅病毒和寨卡病毒等的重要傳播媒介[2]，嚴(yán)重危害人類健康.殺滅蚊蟲，切斷蚊媒疾病的傳播途徑是防治這些蚊媒疾病的有效途徑之一.

目前國內(nèi)外用于控制蚊蟲的主要措施之一是使用化學(xué)殺蟲劑[3]，但化學(xué)殺蟲劑的長期使用導(dǎo)致蚊蟲抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染和生態(tài)平衡破壞等問題.因此，人們一直致力于尋找和發(fā)展對環(huán)境友好、高效安全的生物殺蚊制劑進(jìn)行媒介蚊蟲的綜合控制.其中以生物防治為主的綜合治理方法逐漸成為蚊蟲防治研究工作中的一個活躍領(lǐng)域[4-6].

目前蚊蟲生物防治已受到世界各國的重視，已研究的生物防治候選物眾多，但是實際可用的卻很少，而已生產(chǎn)應(yīng)用的更少[7].殺蚊微生物資源豐富，在土壤，水體，昆蟲中分布廣泛，目前主要來源于芽孢桿菌科、假單胞菌科、腸桿菌科、乳桿菌科和微球菌科等細(xì)菌類群[8-13].其中芽胞桿菌在自然界的植物、土壤和蟲體中廣泛分布，在形成芽孢的過程中細(xì)菌形成對蚊幼蟲具有特異性毒殺作用的各種毒素蛋白，而對其他生物無毒害作用，因而被廣泛的應(yīng)用到蚊蟲的生物防治中[10,12].其中研究比較深入的蘇云金桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensissubsp.israelensis)對伊蚊和庫蚊的毒力較高，按蚊次之，具有較寬的殺蚊譜且不易產(chǎn)生抗性而被廣泛用于蚊蟲的防治，也是目前國內(nèi)外主要的蚊幼蟲控制生物制劑[9].目前發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌的多種亞種或血清型具有殺蚊幼蟲活性，如Canadensi亞種、Morrisoni亞種、Darmstadiensis亞種、Thomsonis亞種和Jegathesan亞種等[14-15].同時也發(fā)現(xiàn)多種殺蚊幼蟲晶體蛋白如Cry2、Cry4A、Cry4B、Cry10A、 Cry11A、Cry11Bb、Cry19A、 Cry19B、Cry20Aa、Cry27A和Cyt等[16]，隨著研究的深入，新的殺蚊晶體蛋白不斷涌現(xiàn).

當(dāng)前，微生物資源收集受到世界各國的重視.本研究通過對土壤中殺蚊微生物資源收集、分離和鑒定，進(jìn)行系統(tǒng)篩選，獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)和有開發(fā)應(yīng)用前景的優(yōu)良菌株，豐富殺蚊微生物菌種資源庫.該研究對控制蚊媒傳染病爆發(fā)具有重要的理論和應(yīng)用價值，在蚊蟲的生物防治方面具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基和ICPM培養(yǎng)基的配置參照文獻(xiàn)[11].

1.1.2 供試蚊蟲

敏感致倦庫蚊品系引自中國科學(xué)院武漢病毒研究所袁志明教授課題組，未接觸過任何生物殺蟲劑，在實驗室已穩(wěn)定飼養(yǎng)10年以上；該蚊蟲品系飼養(yǎng)在26-28 ℃和12∶12 h黑暗和光照(light-dark)交替條件下.

1.2 土樣采集

選擇植被豐富、腐殖質(zhì)豐富的土壤，清理土壤表層，采集深度3 cm以下的土樣約10 g，裝入塑封袋，采集點之間間隔20 m左右，對土樣分別進(jìn)行編號.

1.3 菌株分離

采用醋酸鈉-抗生素法.取錐形瓶，裝10 mL LB液體培養(yǎng)基，加入100 mg/mL的氨芐青霉素10 μL和2 mol/L醋酸鈉(NaAc)712.5 μL，放入0.5 g土樣；30 ℃，220 rpm/min的搖床培養(yǎng)4 h，取1 mL懸浮液于EP管，80 ℃下水浴8 min，水浴之后立即冰浴10 min，解凍渦旋1 min，10,000 rpm/min離心5 min，棄上清，用1 mL無菌水重懸，10,000 rpm/min離心5 min，棄上清，取200 μL無菌水重懸沉淀，并將懸液涂布于ICPM固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3-4 d.

1.4 生物測定

挑取疑似芽胞桿菌的菌落接入5 mL ICPM液體培養(yǎng)基中，編號后置于30 ℃，220 rpm/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)72 h.用一次性塑料杯裝入100 mL去氯水，轉(zhuǎn)入上述菌株發(fā)酵液1 mL，加入20只3～4齡健康的致倦庫蚊幼蟲，滴加適量飼料，用清水作對照.48 h之后查看生測結(jié)果，記錄每個菌株對應(yīng)的蚊幼蟲死亡率.將死亡率在50%以上的記為有毒菌株，死亡率在100%的菌株定為高毒株.對高毒株進(jìn)一步進(jìn)行生物測定，每次生測設(shè) 5-6個濃度，一組空白對照，每個濃度設(shè)2個重復(fù).在26±2 ℃室溫下處理48 h，檢查幼蟲死亡率.用SPSS 13.0軟件分別計算蚊幼蟲對分離菌株發(fā)酵液的LC50及LC90[17].

1.5 光學(xué)顯微鏡觀察

選取高毒菌株，接種于ICPM平板上培養(yǎng)3-7 d至芽孢晶體釋放，在載玻片上滴上無菌水，挑取少許菌在載玻片上涂布，用酒精燈微火固定后滴加染色液(0.133%的考馬斯亮藍(lán)，50%的乙酸)，染色2 min，用水清洗至無色，并在Olympus CX23 光學(xué)顯微鏡下觀察菌體和晶體形態(tài).

1.6 利用16S rDNA對菌株分類鑒定

用TIANamp Bacteria DNA Kit (DP302-02)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離得到的高毒力菌株基因組的總DNA，利用16S rDNA通用引物27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTC AG 3') 和1492R (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3')及高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase對分離菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95.0 ℃，3 min；94.0 ℃，1 min，51.0 ℃，1 min，72.0 ℃，1 min 30 s，35個循環(huán)；72.0 ℃，10 min.擴(kuò)增結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，切取目標(biāo)DNA條帶，用Omega D2500-02 Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后測序.所獲序列經(jīng)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性對比，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)親緣關(guān)系對分離菌株進(jìn)行鑒定.

1.7 殺蚊菌株蛋白的SDS-PAGE分析

將獲得的高毒力菌株在ICPM的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，使菌株的芽孢和晶體釋放，取1 mL菌液于EP管中，10,000 rpm/min離心1 min，收集菌體.用無菌去離子水洗滌菌體，加入200 μL的無菌水重懸菌體，加入5x加樣緩沖液，充分混勻后在沸水中煮10 min，12,000 rpm/min離心10 min，取上清10 μL點樣.在Bio-Rad電泳儀上進(jìn)行恒流電泳，分離膠的濃度為10%，濃縮膠的濃度為5%，以20 mA的電流至樣品進(jìn)入分離膠后，電流增大為25 mA繼續(xù)電泳.電泳結(jié)束后，取出凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色2.5 h，用脫色液脫色1 h，觀察結(jié)果.

2 實驗結(jié)果

2.1 殺致倦庫蚊幼蟲芽胞桿菌的分離

在陡水湖、五指峰、贛南師范大學(xué)校園、崇義陽明山和井岡山共采集103份土樣，分離獲得芽孢桿菌菌株159株，初步鑒定疑似蘇云金芽孢桿菌菌株68株，出菌率(蘇云金芽孢桿菌占芽孢桿菌總數(shù)的比率)為42.77%；其中有毒菌株52株，有毒率(有毒菌株占芽孢桿菌總數(shù)的比率)為32.70%，具體數(shù)據(jù)詳見表 1.其中高毒力菌株有6株，陡水湖分離出2株，標(biāo)號為D7-1、D4-2；贛南師范大學(xué)校園土樣分離出2株，標(biāo)號為X11-2、C3-2；陽明山分離出1株，標(biāo)號為Yang20-1；井岡山分離出1株，標(biāo)號為1-2.

表1 不同采樣點所分離的芽孢桿菌出菌率和有毒株出菌率

2.2 分離芽孢桿菌對致倦庫蚊幼蟲的毒力

將分離得到的6株高毒力菌株接種于ICPM液體培養(yǎng)基中，在搖床中震蕩培養(yǎng)3 d，待芽孢和晶體完全釋放，取發(fā)酵液對致倦庫蚊4齡幼蟲進(jìn)行生物測定，以商品化的殺蚊菌株球形芽胞桿菌C3-41作為陽性對照株.結(jié)果見表2.6株分離菌株對致倦庫蚊幼蟲50%的致死率LC50值在0.69～1.18 μL/mL之間，符合高毒力菌株的特征，都可以作為潛在的殺蚊微生物資源.其中X11-2、 C3-2毒力最高，分別為0.69和0.74 μL/mL，和商品化的殺蚊菌株B.sphaericusC3-41的毒力相當(dāng)，可以作為潛在的新型殺蚊制劑；Yang20-1、7-1毒力次之，4-2、1-2毒力稍弱.

表2 分離高毒菌株發(fā)酵液對致倦庫蚊幼蟲48 h的毒力

2.3 菌株形態(tài)觀察

用肉眼觀察生長在ICPM固體培養(yǎng)基上的6株高毒力菌株，發(fā)現(xiàn)其菌落為乳白色，煎蛋狀，菌落邊緣粗糙，呈現(xiàn)典型的芽孢桿菌菌落形態(tài).挑取菌落經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在油鏡下觀察所產(chǎn)生的伴胞晶體形態(tài)，菌株X11-2的晶體形狀以長方形為主，少量為正方形(圖1 A)；菌株C3-2的晶體形狀為長方形(圖1 B)；菌株Yang20-1的晶體形狀主要為不規(guī)則形，部分圓形(圖1 C)；菌株7-1的晶體形狀為以圓形為主，少量為長方形(圖1 D)；菌株4-2的晶體形狀為方形(圖1 E)；菌株1-2的晶體形狀也為方形(圖1 F).

圖1 分離殺蚊幼芽孢桿菌在光學(xué)顯微鏡下的芽孢以及伴孢晶體形態(tài)A:X11-2; B:C3-2； C: Yang20-1； D:7-1; E:4-2; F:1-2(箭頭所指為菌株的伴胞晶體形態(tài))

2.4 分離的對致倦庫蚊幼蟲高毒力菌株的分子鑒定

提取分離的6株高毒力菌株的基因組，利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均產(chǎn)生1.5 Kb左右的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致.測序后的序列用BLAST程序在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，從中獲取相近的典型菌株的16S rDNA序列，利用Mega7.0軟件將獲得的序列與相關(guān)菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18](圖2).結(jié)果顯示，6株菌與蘇云金芽胞桿菌親緣關(guān)系最近，序列一致性在98%以上.其中菌株7-1和蘇云金芽孢桿菌以色列亞種B.thuringinesisserovarisraelensis(MK002737)聚為一支，同源性達(dá)100%；綜合所分離各細(xì)菌的形態(tài)特征，培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列分析，將所獲得的菌株歸為蘇云金芽孢桿菌B.thuringinesis.

圖2 分離殺蚊芽胞桿菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)親緣關(guān)系分析

圖3 高毒力菌株SDS-PAGE檢測結(jié)果M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:X11-2;2:C3-2;3:Yang20-1;4:7-1;5:4-2;6:1-2(箭頭所指為菌株的晶體蛋白主帶)

2.5 殺蚊菌株晶體蛋白的SDS-PAGE

將分離到的6株高毒力菌株X11-2、C3-2、Yang20-1、7-1、1-2和4-2進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6株菌株均發(fā)現(xiàn)了明顯的晶體蛋白條帶(圖3).菌株X11-2在29 kDa左右有明顯的晶體蛋白主帶；菌株C3-2在32 kDa和95 kDa左右有明顯的晶體蛋白主帶；Yang20-1的晶體蛋白在60 kDa左右有晶體蛋白主帶；菌株7-1在29 kDa左右有明顯的晶體蛋白主帶；而4-2和1-2的晶體蛋白主帶小于20 kDa.這些結(jié)果說明分離所得高毒力殺蚊菌株的殺蚊幼蟲活性主要來自菌株芽孢期產(chǎn)生的晶體蛋白.

3 討論

芽孢桿菌作為優(yōu)良的生物防治藥劑，科學(xué)界對它的研究越來越深入，本研究從陡水湖、五指峰、崇義、學(xué)校附近、井岡山5個地點采集103份土壤樣本，共分離得159株芽孢桿菌，其中蘇云金芽孢桿菌有68株，出菌率為42.77%，有毒菌株52株，有毒菌株出菌率32.70%.從出菌率和生物測定的數(shù)據(jù)來看，發(fā)現(xiàn)陡水湖不僅出菌率高，而且高毒力菌株占比也高，推測這可能跟陡水湖生態(tài)環(huán)境更為原始，人為干擾程度相對較低有關(guān)，另外陡水湖地區(qū)水面較多，利于蚊蟲孳生、菌株和生態(tài)環(huán)境的協(xié)同進(jìn)化，更有利于篩選得到高毒力菌株.

通過重復(fù)生物測定方法，從分離篩選得到的52株有毒菌株中，最終篩選出6株高毒力菌株.通過與已商品化的滅蚊菌株球形芽孢桿菌C3-41對比發(fā)現(xiàn)，X11-2，C3-2的毒力與商品化的滅蚊菌株相當(dāng)，具有一定的發(fā)展為新型殺蚊幼劑的潛能，有望通過進(jìn)一步研究推廣應(yīng)用.對分離得到的6株高毒力菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其在平板上呈現(xiàn)典型的蘇云金芽孢桿菌的菌落特征，在進(jìn)一步晶體形態(tài)觀察中，7-1菌株的晶體以圓形和近球形晶體突出，其他5株的晶體都以方形晶體為主.通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對高毒力菌株進(jìn)行蛋白分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在我們所分離的6株高毒力菌株中，菌株X11-2、C3-2和7-1在29 kDa左右有明顯的蛋白主帶，推測這些菌株可能含有殺蚊毒素Cyt蛋白；C3-2除含Cyt蛋白外，在95 kDa左右還有一條明顯的蛋白主帶，推測為Cry類蛋白.而菌株4-2和1-2的晶體蛋白主帶小于20 kDa，推測可能是一種新的殺蚊毒素蛋白.可見，所分離高毒力菌株的殺蚊活性主要源于晶體蛋白，其蛋白歸類還有待于后續(xù)的質(zhì)譜分析和深入研究，以期為開發(fā)利用殺蚊幼蟲微生物奠定基礎(chǔ)，對豐富我國殺蚊菌種資源和發(fā)展我國生物殺蟲劑的研究和應(yīng)用具有實際意義.