藥物雜質(zhì)普卡必利-N-氧化物的結(jié)構(gòu)分析*

謝 倩，陳鳳宇，周建華，周中高,?

(1.贛南師范大學(xué) a.化學(xué)化工學(xué)院;b.江西省高校功能材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 贛南師范高等?？茖W(xué)校 數(shù)學(xué)系，江西 贛州 341000)

藥物雜質(zhì)的存在是影響藥物純度和功效的主要因素，藥物雜質(zhì)含量較高時(shí)，不僅僅大幅度的降低藥物活性，還會(huì)增加毒副作用，另外還有可能導(dǎo)致藥物理化常數(shù)、外觀性狀發(fā)生變化，因此藥物雜質(zhì)的確定，特別是結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確解析是理解藥物性能中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié). 藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確解析對(duì)藥物制備機(jī)理和工藝，以及如果規(guī)避副反應(yīng)提供非常直接的參考價(jià)值，對(duì)藥物的藥性和副作用的研究也具有極其重要的作用[1-3]. 核磁共振(NMR)技術(shù)，特別是氫-氫(1H-1H)和碳-氫(1H-13C)二維相關(guān)譜在藥物分子分析鑒定和結(jié)構(gòu)歸屬方面具有舉足輕重的位置[4-5]. 藥物分子往往具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在核磁共振譜上，化學(xué)環(huán)境接近的碳?xì)湓拥暮舜殴舱裥盘?hào)也相近，另外化合物的構(gòu)象差異同樣會(huì)影響其化學(xué)位移. 因此，詳盡歸屬藥物雜質(zhì)的1H和13C NMR數(shù)據(jù)，不僅需要1H和13C NMR譜圖之外，還需要1H-1H和1H-13C二維相關(guān)譜的核磁共振數(shù)據(jù)[6-7].

普卡必利-N-氧化物(prucalopride-N-oxide)是一種二氫苯并呋喃的衍生物，其化學(xué)名為4-氨基-5-氯-2,3-二氫-N-[1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶氧基]-7-苯并呋喃甲酰胺(普卡必利-N-氧化物，化合物1)[8-9]，通常被認(rèn)為是治療慢性便秘藥物普卡必利[10-11]的一種藥物雜質(zhì).從最近文獻(xiàn)報(bào)道可知，普卡必利-N-氧化物的制備及其藥理研究較少[12-16]；文獻(xiàn)也未用二維核磁共振技術(shù)詳細(xì)研究其結(jié)構(gòu)，僅對(duì)1H和13C NMR的特征峰進(jìn)行了簡(jiǎn)單歸屬[17-23].本文以4-乙酰氨基-5-氯-2,3-二氫苯并呋喃-7-羧酸甲酯(3)為原料，水解后用酰胺縮合反應(yīng)，4-氨基-5-氯-2,3-二氫苯并呋喃-7-羧酸(4)直接與1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺(5)進(jìn)行縮合反應(yīng)得化合物1，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)體系中至少含有化合物1[12-16]、普卡必利(化合物2)、化合物3以及化合物4.本文主要對(duì)普卡必利-N-氧化物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，先用元素分析(EA)和液相色譜-高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)對(duì)普卡必利-N-氧化物的組成進(jìn)行成分分析，隨后采用一維(1H、13C和DEPT)和二維(1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC)等多種核磁共振技術(shù)開展研究，通過解析上述系列核磁共振譜得到普卡必利-N-氧化物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)，對(duì)普卡必利衍生類藥物的臨床實(shí)驗(yàn)具有重要積極作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

液相色譜-高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)是在H-Class/Xevo G2-S QTof型超高效液相色譜/四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀上進(jìn)行測(cè)試.一維(1H、13C和DEPT)和二維(1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC)譜圖在Bruker Avance III-400型超導(dǎo)NMR譜儀測(cè)定，采用PABBO-5 mm多核寬帶探頭.

參考文獻(xiàn)方法[14,16]，制得普卡必利-N-氧化物(prucalopride-N-oxide).1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺(99.5%)、4-乙酰氨基-5-氯-2,3-二氫苯并呋喃-7-羧酸甲酯(98.5%)購(gòu)于上海贏瑞化學(xué)科技有限公司，薄層板GF254、硅膠(200-300目)、碳酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、碳酸氫鈉、氯仿、乙醇、四氫呋喃、甲醇等均為國(guó)產(chǎn)市售試劑.直徑5 mm的NMR樣品管(ST-500，NORELL)、DMSO-d6(99.8%)購(gòu)于青島騰龍微波科技有限公司.

2 結(jié)果與討論

2.1 普卡必利-N-氧化物的制備與純化

2.1.1 普卡必利-N-氧化物(1)的分離

N2保護(hù)下，將4-氨基-5-氯-2,3-二氫苯并呋喃-7-羧酸(2.0 g，9.36 mmol)和四氫呋喃(30 mL)加入150 mL三口燒瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5 h，再向其中加入N,N’-羰基二咪唑(2.0 g，12.17 mmol)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)0.5 h.持續(xù)滴加1-(3-甲氧基丙基)-4-哌啶胺(2.08 g，12.16 mmol)的四氫呋喃溶液(20 mL)，保持水浴50 ℃，攪拌反應(yīng)5 h.停止反應(yīng)，旋干溶劑，加入50 mL蒸餾水，室溫?cái)嚢? h，過濾，濾餅用水洗(3×20 mL)，其主要成分為普卡必利，柱層析分離得到的其中一種次要組分，即普卡必利-N-氧化物[14,16]，白色固體，真空干燥至恒重，mp 98～99 ℃．元素分析結(jié)果：實(shí)測(cè)值(理論值)(%)：C 56.31 (56.32), H 6.84 (6.83), N 10.94(10.95),C、H、N各元素測(cè)試值與計(jì)算值比較，兩次測(cè)定重現(xiàn)性良好.

2.1.2 普卡必利(2)的合成與分離

制備過程與普卡必利-N-氧化物相同，如圖1所示，得普卡必利[11,16,21]，白色固體，真空干燥至恒重，mp 90～92 ℃.

圖1 合成化合物1和2

2.1.3 4-乙酰氨基-5-氯-2,3-二氫苯并呋喃-7-羧酸甲酯(3)的分離回收

化合物3是制備普卡必利-N-氧化物的過程中添加的一種原料[15]，反應(yīng)結(jié)束后分離回收，結(jié)構(gòu)經(jīng)過核磁共振表征.1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δ):9.94(s, 1H, NH), 7.64 (s, 1H, Ar-H),4.68(t,J=8.8 Hz,2H,O-CH2),3.80(s,1H,OCH3),3.08(t,J=8.8 Hz,2H,Ar-CH2),2.10(s,1H,OCH3).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6,δ):167.91,164.21,160.01,136.34,129.51,120.34,110.78,73.12,52.38,29.76,23.15.

2.1.4 4-氨基-5-氯-2,3-二氫苯并呋喃-7-羧酸(4)的制備與分離

化合物4是制備普卡必利-N-氧化物的過程中的中間原料[15]，向裝有攪拌子的500 mL三口燒瓶中加入原料3(26.30 g，9.8 mmol)、甲醇(200 mL)、蒸餾水(150 mL)和現(xiàn)配的氫氧化鈉(50%，20 mL)，攪拌，升溫至85 ℃，反應(yīng)6 h，冷卻，進(jìn)一步控制溫度在5 ℃，攪拌2 h.蒸去甲醇，過濾，濾餅用蒸餾水洗滌，抽干，轉(zhuǎn)移至500 mL三口燒瓶中，甲醇(100 mL)和蒸餾水(150 mL)，攪拌，升溫至85 ℃，待固體全部溶解，滴加濃鹽酸(9.0 mL)，控制溫度在5至10 ℃，繼續(xù)反應(yīng)2 h.析出固體后抽濾，濾餅用蒸餾水(50 mL)洗，抽干，得白色固體4，真空干燥至恒重(17.78 g，85%)，mp253～255 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6,δ):12.02(s,1H,COOH),7.42(s,1H,Ar-H),5.98(s,1H,NH2),4.59(t,J=7.2 Hz,2H,O-CH2),2.96(t,J=8.8 Hz,2H,Ar-CH2).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6,δ):166.56,160.69,145.48,130.50,111.85,109.31,102.57,72.44,27.61.

2.2 普卡必利-N-氧化物的液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析

高分辨質(zhì)譜測(cè)試采用正離子檢測(cè)模式，普卡必利-N-氧化物高分辨質(zhì)譜圖(圖2)顯示得到m/z=383.161 2的信號(hào)峰，普卡必利-N-氧化物(分子式為C18H26ClN3O4)為理論分子量382.160 1，推測(cè)圖中信號(hào)峰為[M+H]+，與理論值一致，符合化合物化學(xué)結(jié)構(gòu).

圖2 普卡必利-N-氧化物的高分辨質(zhì)譜

圖3 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H NMR譜

圖4 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的13C和DEPT NMR譜

圖5 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H-1H COSY譜(293 K)

2.3 核磁共振譜分析

2.3.1 1D NMR譜圖分析

首先以DMSO-d6為溶劑進(jìn)行1H NMR譜測(cè)試，普卡必利-N-氧化物的1H NMR譜(圖3)中給出了15組譜峰，結(jié)合普卡必利-N-氧化物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，譜峰的化學(xué)位移、裂分模式及面積，2,3-二氫苯并呋喃環(huán)上的氯原子具有吸電子效應(yīng)，導(dǎo)致苯環(huán)H-6的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，δH7.47(s，1H)處的單峰對(duì)應(yīng)苯環(huán)H-6；δH3.24(s，3H)可以歸屬為H-15；由于H-9與酰胺氮相連，因此受去屏蔽效應(yīng)作用，同時(shí)受到H-10a/b的耦合裂分，應(yīng)為低場(chǎng)的多重峰，故而δH3.90(m，1H)對(duì)應(yīng)H-9；由于2,3-二氫苯并呋喃環(huán)特殊化學(xué)環(huán)境，導(dǎo)致苯并呋喃環(huán)上OCH2的化學(xué)位移處于相對(duì)低場(chǎng)，可將δH4.74(t，J=8.8 Hz，2H)歸屬為H-2，與參考文獻(xiàn)[14,16]中的值相符；其余氫碳原子化學(xué)位移準(zhǔn)確歸屬需要進(jìn)一步借助HSQC和HMBC譜.

從普卡必利-N-氧化物的13C NMR、DEPT45和DEPT135譜圖(圖4)可以看出，該化合物中含1個(gè)伯碳信號(hào)峰(δC58.3)、7個(gè)仲碳信號(hào)峰(δC22.8、27.1、27.7、63.0、68.3、70.4、73.5)、2個(gè)叔碳信號(hào)峰(δC44.7、128.9)和6個(gè)季碳信號(hào)峰(δC105.2、110.3、111.3、144.5、157.4、162.9).其中C-15為伯碳，對(duì)應(yīng)δ58.3，C-8為羰基碳，結(jié)合其結(jié)構(gòu)特征，化學(xué)位移應(yīng)該處于最低場(chǎng)，對(duì)應(yīng)δ162.9.C-6和C-9為叔碳，δ44.7和δ128.9分別對(duì)應(yīng)C-9和C-6.其余碳原子的精確歸屬需進(jìn)一步借助HSQC和HMBC譜[14,16].

2.3.2 2D NMR譜圖分析

從普卡必利-N-氧化物的1H-1H COSY譜(圖5)可知，H-3是三重峰，與H-2存在相關(guān)峰的是2,3-二氫苯并呋喃環(huán)上的H-3，結(jié)合耦合常數(shù)(J=8.4 Hz)，δH3.03(t,J=8.4 Hz，2H)歸屬為H-3.由于分子內(nèi)的哌啶環(huán)具有一定剛性，導(dǎo)致C-10和C-11上的兩個(gè)質(zhì)子不等價(jià)(H-10a與H-10b、H-11a與H-11b)，與H-9存在相關(guān)峰的是哌啶環(huán)上的H-10，δH1.71(m,2H)和δH2.17(m,2H)，歸屬為H-10a和H-10b.δH3.29(t,J=11.2 Hz，2H)和δH3.01(d,J=10.8 Hz，2H)與H-10存在相關(guān)峰，歸屬為H-11a和H-11b.通過對(duì)COSY譜的解析，對(duì)普卡必利-N-氧化物大部分質(zhì)子進(jìn)行了歸屬，尚余H-12、H-13、H-14、NH和NH2未歸屬，需要1H-13C HMBC譜輔助解析.

由普卡必利-N-氧化物的1H-13C HSQC譜(圖6)可以看到δC73.5與H-2相關(guān)，歸屬為C-2；δC27.7與H-3相關(guān)，歸屬為C-3；δC128.9與H-6相關(guān)，歸屬為C-6；δC44.7與H-9相關(guān)，歸屬為C-9；δC27.1與H-10a和H-10b均相關(guān)，歸屬為C-10；δC63.0與H-11a和H-11b均相關(guān)，歸屬為C-11；δC58.3與H-15相關(guān)，歸屬為C-15. 尚有3個(gè)仲碳(δC22.8、68.3、70.4)和5個(gè)季碳(δC105.2、111.3、110.3、144.5、157.4)無(wú)法歸屬，需要1H-13C HMBC譜進(jìn)一步的輔助解析.

圖6 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H-13C HSQC譜(293 K)

圖7 普卡必利-N-氧化物在DMSO-d6中的1H-13C HMBC譜局部(293 K)

C-3a、C-4、C-5、C-7和C-7a尚未歸屬.結(jié)合圖7所示的1H-13C HMBC譜，可以發(fā)現(xiàn)δ111.3處13C信號(hào)峰與NH2、H-2和H-3均有交叉信號(hào)峰，可確定為C-3a，δ144.5處信號(hào)峰與H-6和H-3存在相關(guān)峰，歸屬為C-4，δ110.3處信號(hào)峰與H-6和NH2均有相關(guān)峰，歸屬為C-5，δ105.2處信號(hào)峰與H-6存在相關(guān)峰，歸屬為C-7，δ157.4處信號(hào)峰與H-2，H-3和H-6均有相關(guān)峰，歸屬為C-7a.

尚余3個(gè)仲碳(δC22.8、68.3、70.4)未歸屬，分別為C-12、C-13和C-14，不難發(fā)現(xiàn)C-12直接與雜環(huán)N原子相連，C-14直接與甲氧基的O原子相連，兩者均受到不同程度的去屏蔽作用，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特征及電子云密度對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移值，與C-13相比其化學(xué)位移處于低場(chǎng)，δC22.8歸屬為C-13，從HSQC譜上可以看出，δH2.06(m，2H)歸屬為H-13. 同時(shí)從HMBC譜上可以看出，C-14與H-12和H-13均有相關(guān)峰；C-12與H-11、H-13和H-14均存在交叉峰，δC68.3歸屬為C-12，結(jié)合HSQC譜，將δH3.17(t,J=8.0 Hz，2H)歸屬為H-12．結(jié)合COSY譜，H-13與H-12，H-13與H-14均有交叉信號(hào)峰，結(jié)果也驗(yàn)證了上述歸屬.

通過對(duì)普卡必利-N-氧化物一系列一維和二維核磁共振譜(1H、13C、DEPT45、DEPT135、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC)的解析，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)[13,18,22]中的數(shù)據(jù)，在此，對(duì)普卡必利-N-氧化物的1H和13C NMR進(jìn)行了全部指認(rèn)，結(jié)果詳見表1.

表1 普卡必利-N-氧化物的1H和13C NMR歸屬

*表示文獻(xiàn)中未明確歸屬的氫碳信號(hào)**表示文獻(xiàn)[14,16]已明確歸屬的氫碳信號(hào)

2.4 普卡必利-N-氧化物和普卡必利的化學(xué)位移對(duì)比

普卡必利-N-氧化物是在合成普卡必利時(shí)獲得的次要產(chǎn)物之一，是一種藥物雜質(zhì)，兩者結(jié)構(gòu)最大的差別在于其哌啶環(huán)結(jié)構(gòu)片段中是否含有N-O(陽(yáng)、陰離子)基，由于N-O基的存在，N-O基的氧原子存在兩對(duì)孤電子對(duì)，孤電子對(duì)的電子云較成鍵電子對(duì)而言，在空間具有更大的伸展，進(jìn)而容易影響哌啶環(huán)的化學(xué)環(huán)境，改變了化合物1的電子云密度，進(jìn)而影響附近碳?xì)湓拥?H、13C化學(xué)位移．表2是化合物1和化合物2的1H、13C數(shù)據(jù)，從結(jié)果對(duì)比可以看出，1H NMR化學(xué)位移相差較大的是H-6、H-10、H-11、H-12和H-13，差值分別為148 Hz、56 Hz和72 Hz、340 Hz和184 Hz、300 Hz、112 Hz；13C NMR化學(xué)位移相差較大的是C-10、C-11、C-12和C-13，差值分別為610 Hz、1 060 Hz、1 280 Hz和1 800 Hz，化合物1的靠近哌啶環(huán)的氫和碳NMR信號(hào)均向低場(chǎng)移動(dòng)，主要是由于N-O(陽(yáng)、陰離子)基的存在，導(dǎo)致哌啶環(huán)的電子云密度降低．相對(duì)而言，距離哌啶環(huán)較遠(yuǎn)的2,3-二氫苯并呋喃環(huán)因?yàn)轷０锋I的存在，哌啶環(huán)上電子云的變化對(duì)2,3-二氫苯并呋喃環(huán)的影響較小，與化合物2的相關(guān)的1H、13C化學(xué)位移相差不大[19].

表2 化合物1和2的1H NMR和13C NMR對(duì)比

*表示文獻(xiàn)[19]已明確歸屬的碳?xì)湫盘?hào).

3 結(jié)論

通過優(yōu)化合成工藝，分離獲得一種重要的藥物雜質(zhì)普卡必利-N-氧化物，綜合運(yùn)用元素分析和液相色譜-高分辨質(zhì)譜對(duì)普卡必利-N-氧化物進(jìn)行了化學(xué)組成分析，借助液體一維和二維核磁共振技術(shù)，特別是得益于異核多鍵相關(guān)譜，充分高效地呈現(xiàn)了化合物中1H-13C遠(yuǎn)程相關(guān)耦合的異核信息，結(jié)合異核單量子相關(guān)譜，以及普卡必利-N-氧化物和普卡必利的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)兩者的1H、13C NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，揭示了N-O(陽(yáng)、陰離子)基對(duì)屏蔽效應(yīng)的影響，分析和準(zhǔn)確的歸屬了普卡必利-N-氧化物的1H NMR和13C NMR信號(hào)，確定了普卡必利-N-氧化物的化學(xué)結(jié)構(gòu).