膽酸鈉自組裝行為的小角X射線散射研究

李博楠，李天富，劉榮燈，王子軍，劉蘊韜，陳東風

(中國原子能科學研究院，北京 102413)

1 引言

膽酸鈉是膽汁酸中的主要成分之一，屬于一種生物表面活性劑，具有促進脂溶性食物消化的作用[1-3]，同時，還通過調(diào)節(jié)某些基因影響脂肪、葡萄糖和能量代謝[4]。研究其在溶液中的自組裝行為，對于理解其在分子層面上的生物學功能具有重要意義。與常見頭-尾式柔性表面活性劑(例如十二烷基磺酸鈉SDS，磷脂分子等)不同，膽酸鈉具有類固醇剛性骨架，包含特殊的雙親面式結(jié)構(gòu)[1-4]。在溶液中，分子間除了存在靜電相互作用、疏水相互作用之外，還存在氫鍵相互作用[2]。這導致膽酸鈉在溶液中表現(xiàn)出不同于SDS等常規(guī)表面活性劑的自組裝行為。

目前，通過X射線衍射、動態(tài)光散射等技術(shù)手段已經(jīng)對膽酸鈉的基本參數(shù)、晶體結(jié)構(gòu)進行了較為系統(tǒng)詳盡的研究[5-8]。但對于膽酸鈉在水溶液中的自組裝行為機制尚不明確，無法給出準確的膽酸鈉聚集數(shù)以及明確的聚集體模型。小角X射線散射技術(shù)可以原位、無損的測量介觀尺度(1～100 nm)下存在電子密度起伏的微粒形貌、尺寸、分布等信息，是研究溶液狀態(tài)下膽酸鈉自組裝行為的有力工具。已有學者通過小角散射技術(shù)對膽酸鹽自組裝進行研究[9-14]，但對于膽酸鈉溶液自組裝行為的系統(tǒng)實驗研究還未見報道。

我們首先通過等溫滴定量熱法和Zeta電位測量初步確定了膽酸鈉自組裝行為機制隨濃度升高而發(fā)生改變。通過同步輻射小角X射線散射技術(shù)，測量了一系列濃度的膽酸鈉水溶液，發(fā)現(xiàn)了膽酸鈉自組裝行為驅(qū)動方式存在變化確定了膽酸鈉自組裝體存在最大尺寸，并給出了膽酸鈉自組裝體隨濃度變化的形貌尺寸信息。

本文主要通過小角X射線散射技術(shù)輔以等溫滴定量熱法對膽酸鈉在水溶液下的自組裝行為進行研究，分析膽酸鈉隨濃度變化的自組裝體形貌尺寸變化，討論自組裝體的形成機制。

1 實驗

1.1 樣品準備

實驗所用的膽酸鈉(NaC)樣品從麥克林(MACKLIN)公司購得，用去離子水進行配置并靜置以充分溶解。

1.2 小角X射線散射

小角X射線散射是一種研究材料微觀結(jié)構(gòu)的有力技術(shù)手段，其原位測量、對樣品無損傷十分適合于研究溶液狀態(tài)的樣品。小角X射線散射實驗(SAXS)在上海光源BL19U2生物小角線站上完成。測量參數(shù)選擇如下，入射X射線的波長為1.08 ?，樣品到探測器的距離為2.0 m，散射矢量Q范圍為0.04到4.5 ?-1。將樣品置于0.5 mL離心管中，用10 μm通徑毛細管吸取至曝光位置。膽酸鈉(NaC)濃度為0～100 mg/mL，分別對不同濃度的NaC溶液和緩沖溶液(去離子水)進行了測量，將測量結(jié)果按照監(jiān)視器計數(shù)進行歸一化處理。

1.3 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法(ITC)是一種研究生物熱力學與動力學的重要方法，該方法使用一臺具有高靈敏、高自動化的可實時、連續(xù)、準確監(jiān)測與記錄一個完整變化過程中的熱量變化的微量量熱儀，可以獲得原位、在線的熱力學與動力學信息，同時對樣品沒有損傷。等溫滴定量熱實驗是在清華大學蛋白質(zhì)中心完成，實驗儀器型號為MicroCal ITC200。實驗測量參數(shù)為樣品池注入300 μL去離子水，滴定針中為膽酸鈉濃度62 mg/mL(135 mM)，溫度設(shè)置為25 ℃，設(shè)定滴定次數(shù)40次，滴定體積1 μL，滴定間隔時間為120 s，攪拌速度為750 rpm，實驗DP值設(shè)為5.0 μcal/s。

1.4 Zeta電位測量

Zeta電位是通過激光多普勒電泳檢測樣品散射光的微小頻率移動，得到帶電粒子電泳遷移率，利用Herry方程計算得到電位。Zeta電位用以表征膠體分散系穩(wěn)定性。Zeta電位測量在哈爾濱工業(yè)大學應用化學實驗中心完成測量，實驗儀器型號為Zetasizer nano zs90。

2 結(jié)果與討論

2.1 等溫滴定量熱法測量結(jié)果

通過ITC實驗測量得到膽酸鈉在水溶液中隨濃度變化的量熱信息，如圖1所示。圖中每一個峰代表每次滴定所產(chǎn)生的量熱變化，其中向下的峰代表放熱峰，向上的峰代表吸熱峰。隨著每次滴定，在這一過程中樣品池中膽酸鈉的濃度逐漸增加，可以得到膽酸鈉濃度變化形成自組裝體過程中量熱的變化，發(fā)現(xiàn)在膽酸鈉濃度范圍為0～20 mg/mL，膽酸鈉隨濃度升高是發(fā)生連續(xù)的放熱變化，這說明膽酸鈉分子發(fā)生聚集形成自組裝體放出熱量。在濃度到達20 mg/mL附近是，吸放熱到達平衡出現(xiàn)曲線中的明顯拐點，但隨著濃度繼續(xù)升高，量熱持續(xù)放生吸熱變化，可以得出NaC自組裝行為機制在拐點附近發(fā)生改變，判斷是膽酸鈉形成自組裝體的驅(qū)動方式發(fā)生改變，由疏水相互作用主導的驅(qū)動方式逐漸轉(zhuǎn)為由氫鍵相互作用主導的驅(qū)動方式，高濃度下膽酸鈉剛性結(jié)構(gòu)與雙親面式結(jié)構(gòu)導致為了使自組裝體自由能最少需要膽酸鈉自組裝體以氫鍵結(jié)合的方式聚集，這一過程中需要將已經(jīng)由疏水相互作用結(jié)合的自組裝體分解再形成以氫鍵結(jié)合的自組裝體，這一過程會隨著濃度升高而逐漸吸收熱量。

圖1 膽酸鈉的ITC實驗結(jié)果Fig.1 ITC results of Sodium cholate

2.2 Zeta電位測量結(jié)果

Zeta電位的大小表示膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性趨勢。如果懸浮液中所有粒子具有較大的正的或負的Zeta電位，那么他們將傾向于互相排斥，沒有絮凝的傾向。但是如果粒子的Zeta電位值較低，則沒有力量阻止粒子接近并絮凝。不同濃度膽酸鈉的Zeta測試結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯霎斈懰徕c濃度為20 mg/mL時，Zeta電位最低，達到-44 mV，體系處于最穩(wěn)定狀態(tài)，這與ITC測量結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的拐點相吻合，說明此時由疏水相互作用為主的驅(qū)動方式與形成氫鍵為主的驅(qū)動方式達到了平衡，所以此時體系最為穩(wěn)定。

圖2 不同濃度膽酸鈉的Zeta電位變化曲線Fig.2 Zeta potential curves of sodium cholate at different concentrations

2.3 小角X射線散射實驗結(jié)果

采用小角X射線散射技術(shù)，測得不同濃度下膽酸鈉在水溶液中的小角散射強度曲線I(Q)與散射矢量Q的一維曲線，如圖3所示。隨著膽酸鈉濃度升高，小角散射強度逐漸增強。在低濃度下散射曲線整體升高且曲線形狀發(fā)生明顯變化，這表明膽酸鈉在水溶液中發(fā)生了自組裝行為。這與一般表面活性劑相似，在表面活性劑濃度達到臨界膠束濃度(CMC)后，表面活性劑由于其親疏水作用趨向于聚集在一起形成膠束，從而降低表面能，且自組裝體會隨著濃度升高繼續(xù)增大或者改變聚集體形狀。

圖3 不同濃度下(4～100 mg/mL)，膽酸鈉在水溶液下膽酸鈉的小角X射線散射結(jié)果Fig.3 Small Angle x-ray scattering of Sodium cholate in aqueous solution at different concentrations (4-100 mg/mL)

為了進一步獲得膽酸鈉自組裝體的結(jié)構(gòu)信息，需要對散射數(shù)據(jù)進行模型擬合分析。通過計算給定模型的理論結(jié)果，再用非線性最小二乘法擬合實驗數(shù)據(jù)，便可獲得自組裝體的結(jié)構(gòu)信息。對于所研究的系統(tǒng)，SAXS強度分布I(Q)可以通過以下解析表達式給出：

I(Q)=A·P(Q)·S(Q)+Ibgd

(1)

其中A為反差因子，取決于電子密度的起伏，P(Q)為形狀因子，S(Q)為結(jié)構(gòu)因子。選取橢球形狀因子[15]與HayterMSA結(jié)構(gòu)因子[16]理論模型，可對膽酸鈉一維散射強度曲線進行模型擬合分析。橢球形模型P(Q)表示為如下形式：

(2)

表達式中，scale為體積分數(shù)，V為散射體的體積，r是球體的半徑，bkg為本底。

通過將理論模型導入SasView數(shù)據(jù)處理軟件，利用非線性最小二乘法對所有數(shù)據(jù)進行了擬合分析。其中擬合形狀因子參數(shù)包括非相干散射本底、橢球長軸、橢球短軸、反差因子，結(jié)構(gòu)因子參數(shù)包括有效電荷、介電常數(shù)、鹽離子濃度、溫度以及體積分數(shù)。如圖4所示，以40mg/mL膽酸鈉散射強度曲線為例，將各組數(shù)據(jù)均擬合至收斂，可見理論模型與實驗結(jié)果擬合結(jié)果相對較好。

圖4 濃度為40 mg/mL的膽酸鈉水溶液小角X射線散射模型擬合結(jié)果Fig.4 Small Angle x-ray scattering model of Sodium cholate solution at 40 mg/mL

通過對每組數(shù)據(jù)進行擬合得到膽酸鈉受濃度影響的自組裝體形貌信息。膽酸鈉自組裝體長軸半徑在13.5-41.2 ?之間，短軸半徑在9.6～11.4 ?之間。膽酸鈉在低濃度為類球形，長短軸尺寸接近，隨著濃度升高，短軸尺寸幾乎無增長，長軸尺寸逐漸增大，在濃度達到40 mg/mL范圍時，長軸尺寸增長逐漸變緩以至于不再繼續(xù)增大，這說明膽酸鈉自組裝體存在最大尺寸(圖5)。

圖5 模型擬合方法得到的膽酸鈉長短軸尺寸隨濃度變化曲線Fig.5 Curve of Sodium cholate length and short axis size with concentration obtained by model fitting method

這與常規(guī)表面活性劑存在明顯不同，且通過擬合得到的膠束帶電情況和體積分數(shù)變化發(fā)現(xiàn)前后存在不同的自組裝行為機制(圖6、7)。

圖6 模型擬合方法得到的膽酸鈉體積分數(shù)隨濃度變化曲線Fig.6 Curve of Sodium cholate volume fraction with concentration obtained by model fitting method

膽酸鈉是由剛性的具有雙親性質(zhì)的類固醇骨架構(gòu)成，其剛性骨架親水一側(cè)上含有三個親水的羥基基團，因此在水溶液中能夠形成膠束等多種形式的聚集體。正是由于其非平面結(jié)構(gòu)的雙親面式骨架具有剛性，導致在聚集體形成中存在由空間阻礙效應影響而無法形成較大的聚集體，從而使得聚集數(shù)相較于一般表面活性劑少，所以膽酸鈉自組裝體存在最大尺寸且相較于常規(guī)表面活性劑更早的出現(xiàn)由結(jié)構(gòu)因子引起散射峰。

圖7 模型擬合方法得到的膽酸鈉有效電荷隨濃度變化曲線Fig.7 Curve of Sodium cholate effective charge versus concentration obtained by model fitting method

3 結(jié)論

1)通過小角X射線散射實驗方法、等溫滴定量熱法、Zeta電位測量對生物表面活性劑膽酸鈉在水溶液中的自組裝行為機制進行研究，得到了完整的受濃度變化影響的自組裝體形貌尺寸信息。

2)膽酸鈉受限于其獨特剛性類固醇骨架與雙親面式結(jié)構(gòu)具有相較于常規(guī)表面活性劑截然不同的自組裝行為，并且受限于空間阻礙效應與其自身結(jié)構(gòu)的影響，膽酸鹽無法形成較大的自組裝體，即自組裝體存在最大尺寸。

3)膽酸鈉在隨濃度升高過程中，形成自組裝體的驅(qū)動方式存在改變，由疏水相互作用主導的驅(qū)動方式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑肿娱g羥基形成氫鍵的驅(qū)動方式。

4 致謝

感謝上海同步輻射光源、國家蛋白質(zhì)科學中心(NFPS)BL19U2線站的工作人員在數(shù)據(jù)收集過程種給予的幫助。