L-半胱氨酸功能化的碳量子點(diǎn)為探針快速檢測(cè)花旗松素

程家維，張宇輝，楊季冬

(重慶三峽學(xué)院， 重慶 404100)

1 引言

花旗松素(taxifolin)也稱(chēng)二氫槲皮素(dihydroquercetin)，化學(xué)名為5,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮醇，是一種生物類(lèi)黃酮準(zhǔn)維生素P，其分子式為C15H12O7，常溫下呈淡黃色粉末，主要來(lái)源于落葉樹(shù)的果肉和許多果實(shí)中，如大黃花、葡萄和桔子等[1-3]?；ㄆ焖伤?fù)碛形鍌€(gè)酚羥基的特殊分子結(jié)構(gòu)(如圖1)，成為目前發(fā)現(xiàn)的最良好的天然強(qiáng)效抗氧化劑。有研究表明，其可有效去除人體內(nèi)的自由基與毒素，具有消炎、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、消除黑色素、改善微循環(huán)等生物或藥理活性，且無(wú)毒、無(wú)致畸、無(wú)突變，工業(yè)上用作食品添加劑[4]，是許多珍貴藥品及保健品的關(guān)鍵成分。日本學(xué)者Fukui 首先從針葉樹(shù)(Chamaecyparis obtusa) 葉中分離出了花旗松素，其生物活性隨后被發(fā)現(xiàn)并得到了證實(shí)[5]。

圖1 花旗松素分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The molecular structure of taxifolin

由于花旗松素難溶于水，致其生物利用率低，在醫(yī)藥和臨床上的使用受到很大的限制[6]。同時(shí)，花旗松素的提取方法各異，伴生物很多，加之市場(chǎng)需求量大，不少以劣充次，因此發(fā)展一種快速檢測(cè)的分析方法尤為重要。目前，常用的檢測(cè)方法有，高效液相色譜法(HPLC)[7], 紫外-可見(jiàn)分光光度法(UV-vis)[8]，方波伏安法(SWV)[3]，毛細(xì)管區(qū)電泳(CZE)[9]，液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS)[2]等，這些方法大都需要樣品前處理，成本高、操作復(fù)雜耗時(shí)[10]。與這些報(bào)道相比，共振瑞利散射(RRS)光譜法作為一種高靈敏檢測(cè)的新技術(shù)，以其快捷、簡(jiǎn)單和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受分析工作者青睞[11,12]。

納米科技是21世紀(jì)快速發(fā)展的主流科技之一，有"21世紀(jì)最有前途的材料"的美稱(chēng)，而旗下的一種新興碳基材料--碳量子點(diǎn)(CDs)作為一種分析新技術(shù)材料更是發(fā)展迅猛。合成CDs的粒徑一般小于10 nm，具有類(lèi)似于有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)的強(qiáng)熒光發(fā)射[13]，與傳統(tǒng)有機(jī)染料和普通量子點(diǎn)相比，碳量子點(diǎn)具有光穩(wěn)定性好、生物相容性好、低毒、分散等優(yōu)點(diǎn)[14]。據(jù)報(bào)道，碳量子點(diǎn)替代其它生化類(lèi)傳感器，或作為熒光指示劑的文章層出不窮[15,16]，而結(jié)合碳點(diǎn)新技術(shù)利用共振瑞利散射(RRS)光譜法作為檢測(cè)手段卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

日立F-4500熒光光譜儀(日本，東京)，用于測(cè)定實(shí)驗(yàn)體系的熒光光譜及RRS光譜，在掃描熒光光譜和RRS光譜時(shí)狹縫分別設(shè)置為10/10 nm和5/5 nm，同時(shí)記錄好相應(yīng)的光譜強(qiáng)度。島津UV-2700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，東京)，用于體系紫外吸收光譜的記錄。FA1104N電子天平稱(chēng)(中國(guó)，上海)，用于實(shí)驗(yàn)中藥品試劑的稱(chēng)量。利用Nicolet IS10(美國(guó)尼高力)光譜儀測(cè)量傅里葉紅外光譜，通過(guò)Zetasizer Nano S(英國(guó)馬爾文公司)測(cè)試合成CDs的zeta電位值，而CDs的XRD則是在BRUCKER D8(德國(guó)布魯克)的檢測(cè)下完成的。三信Phs-3C-02型酸度計(jì)(中國(guó)，上海)，主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中緩沖溶液pH值的調(diào)節(jié)。

1.2 試劑藥品

主要試劑包括：花旗松素(Taxifolin，98%，阿拉丁試劑有限公司，中國(guó)上海)、L-半胱氨酸(L-Cys)、檸檬酸、九水合硝酸鐵購(gòu)于中國(guó)上海阿拉丁試劑有限公司；其他的一些無(wú)機(jī)鹽(Cu(NO3)2,Mg(OH)2,NaCl,eta)購(gòu)于中國(guó)上海Sinopharm化學(xué)試劑有限公司?；ㄆ焖伤氐呐渲剖窍扔?5%的乙醇溶解，再用二次蒸餾水稀釋?zhuān)w積比控制為1∶9。本實(shí)驗(yàn)所用到的所有化學(xué)品及化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水(電阻率為18.2 Ω·cm-1)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)的合成

碳量子點(diǎn)的合成是在Yalin Zhang[17]的制備基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，通過(guò)簡(jiǎn)易的水熱處理法得到，同時(shí)得到了L/D-半胱氨酸功能化的CDs，經(jīng)過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸功能化的CDs更穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)采用L-半胱氨酸作為修飾劑。在一個(gè)典型的反應(yīng)過(guò)程中，利用適量的檸檬酸(1.92g,0.01 mol)和L-半胱氨酸(2.42 g，0.02 moL)作為前驅(qū)體共混于燒杯中，再加入5 mL去離子水使其充分溶解分散，并進(jìn)行30分鐘的超聲處理；然后將混合液轉(zhuǎn)到聚四氟乙烯密封高壓反應(yīng)釜中，烘箱設(shè)定180℃加熱1小時(shí)；待反應(yīng)完成，將反應(yīng)釜放置于室溫中自然冷卻，獲得深棕色溶液；最后透析五天就可獲得棕色的發(fā)射強(qiáng)藍(lán)綠色熒光的L型CDs，最后存放于4℃的冰箱中備用。

1.3.2光譜掃描測(cè)定

在室溫條件下，于10 mL的比色管中依次加入20 μL的L型CDs，一定量的Fe3+，最后再加入適當(dāng)濃度的花旗松素溶液。用二次蒸餾水將上述混合溶液稀釋至刻度，振蕩搖勻，并在室溫條件下靜置25 min。最后，掃描體系紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜(λex=345 nm)及RRS光譜。以ΔF=F-F0和ΔIRRS=I-I0記錄熒光和RRS變化值。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)

2.1.1L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)的吸收和光學(xué)特性

實(shí)驗(yàn)在室溫條件下，以檸檬酸和L-半胱氨酸(Cys)作為前驅(qū)體，采用水熱處理法一步合成了高熒光產(chǎn)率的CDs。如圖2所示，L-Cys修飾的CDs的紫外吸收光譜其最大吸收峰位于347.5 nm處。而觀察CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，二者呈現(xiàn)出明顯的對(duì)稱(chēng)關(guān)系。在345 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，得到最大發(fā)射峰位波長(zhǎng)為419 nm，斯托克位移大于50 nm，表明合成的CDs可以消除背景干擾，具有較好的光學(xué)性能。

圖2 L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of L-cysteine modified CDs

2.1.2L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)的紅外光及其它光學(xué)特性

用該法合出的CDs在紫外燈下發(fā)射出強(qiáng)的藍(lán)綠色熒光，如圖3(a)所示，用X射線衍射(XRD)研究了CDs的晶體結(jié)構(gòu)，可以觀察到20°的寬峰，表明其具有明顯的非晶結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步確認(rèn)L-Cys修飾的CDs的表面官能團(tuán)，利用了傅里葉近紅外光譜(FT-IR)對(duì)其討論，如圖3(b)。3124 cm-1處明顯特征峰是由-OH基的拉伸振動(dòng)引起的，1711 cm-1可歸屬于C=N的拉伸振動(dòng)，1585 cm-1處的弱峰很有可能來(lái)源于C=C的拉伸振動(dòng)，而1400 cm-1處的強(qiáng)峰及1225 cm-1處的弱峰都可視為C-N和C-H的變形振動(dòng)。因此，我們推測(cè)半胱氨酸經(jīng)過(guò)水熱合成法制備的CDs表面含有大量的-OH、-COOH及-NH等含N/C基團(tuán)，且具有以水為介質(zhì)合成CDs的典型特征峰。同時(shí)，根據(jù)圖4發(fā)現(xiàn)，制備的水溶性CDs通過(guò)Zeta電位測(cè)試單峰明顯，表明其在水溶液中分散性較好，zeta電位值為-6.60毫伏。

圖3 L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)的X射線衍射和傅里葉紅外分光光譜Fig.3 XRD and FT-IR spectra of L-cysteine modified CDs

圖4 L-半胱氨酸修飾的碳量子點(diǎn)的zeta電位圖Fig.4 zeta potential result of L-cysteine modified CDs

2.2 花旗松素對(duì)CDs-Fe3+體系的光譜影響

實(shí)驗(yàn)研究了CDs、Fe3+及花旗松素三者之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)三者可以相互反應(yīng)形成金屬螯合物，進(jìn)而引起體系熒光、吸收和RRS光譜的一系列變化。如圖5所示，掃描體系全段的熒光光譜圖，發(fā)現(xiàn)在350-500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)Fe3+、花旗松素本身是不具熒光特性的，而合成的碳量子點(diǎn)具有強(qiáng)烈的熒光特性，以345 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在419 nm處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的熒光發(fā)射特征峰。當(dāng)把一定量的Fe3+加入到CDs中，體系的熒光信號(hào)被顯著猝滅，而有趣的是，再向體系中加入一定量的花旗松素，猝滅的熒光竟又得以恢復(fù)，形成熒光“開(kāi)-關(guān)”的模式。體系中，花旗松素的濃度與恢復(fù)的熒光信號(hào)強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了分析測(cè)定花旗松素的分子熒光光譜法。

圖5 三元體系的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectrum of the CDs-Fe3+-taxifolin.Conditions: CDs, 20 μL; Fe3+, 4×10-5 mol/L; taxifolin:6 μmol/L

如圖6所示，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下掃描體系RRS光譜發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的CDs，F(xiàn)e3+和花旗松素以及兩兩存在CDs-Fe3+和CDs-花旗松素時(shí)的RRS強(qiáng)度均十分微弱，但Fe3+與花旗松素共存時(shí)其RRS強(qiáng)度有一定程度的增加，推測(cè)Fe3+與花旗松素的五個(gè)酚羥基發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)形成金屬配合物。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CDs，F(xiàn)e3+和花旗松素三者共存時(shí)體系的RRS強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這可能是由于三者相互作用形成離子締合物而引起的，并在381 nm處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的特征峰，RRS強(qiáng)度的變化與花旗松素濃度的增加在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，利用Fe3+與花旗松素相作用，線性關(guān)系不明顯，且沒(méi)有CDs-Fe3+檢測(cè)花旗松素構(gòu)成的三元體系靈敏度高。據(jù)此成功建立一種快捷、靈敏檢測(cè)花旗松素的RRS光譜方法。

圖6 三元體系的共振瑞利散射光譜圖Fig.6 RRS spectra of the CDs-Fe3+-taxifolin

Conditions: CDs, 20 μL; Fe3+, 4×10-5mol/L; taxifolin: 6 μmol/L

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1緩沖溶液的選擇

在實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)pH計(jì)測(cè)定，體系整個(gè)環(huán)境均處于弱酸態(tài)，pH值在3.80-5.72范圍內(nèi)。針對(duì)緩沖溶液的選擇，主要考察了pH值為3.6時(shí)部分酸性緩沖溶液(甘氨酸-鹽酸,乙酸-乙酸鈉,檸檬酸-檸檬酸鈉等)，pH值為7.2時(shí)常見(jiàn)中性緩沖溶液(HEPES,Tris-HCl,PBS等)，以及在不添加緩沖溶液的情況下分別觀察體系RRS光譜強(qiáng)度的變化，如圖7所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種類(lèi)的緩沖溶液對(duì)體系的影響不同，酸性環(huán)境中的ΔIRRS比中性條件下的大且光譜圖有明顯的紅移現(xiàn)象，但ΔIRRS卻在不添加任何緩沖溶液時(shí)呈現(xiàn)出最大值且RRS光譜較穩(wěn)定，從而推測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系是較穩(wěn)定的，這也是采用RRS技術(shù)作為檢測(cè)法鮮有的案例。最終，整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系按照其原始的弱酸態(tài)(pH=3.80-5.72)進(jìn)行后續(xù)研究，體系本身具有一定的穩(wěn)定性，不再需要加入緩沖溶液。

圖7 緩沖溶液的選擇Fig.7 The choice of buffers kinds. CDs, 20 μL; Fe3+, 4×10-5 mol/L

taxifolin: 6 μmol/L in different buffers, respectively

2.3.2Fe3+濃度的優(yōu)化

對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系而言，F(xiàn)e3+扮演著非常重要的作用。為了提高體系的靈敏度和一個(gè)較寬的線性范圍，對(duì)體系中Fe3+的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，在控制其他條件不變的情況下，隨著體系中Fe3+量的逐漸增加，ΔF及ΔIRRS變化顯著。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，利用分子熒光光譜法測(cè)定體系時(shí)Fe3+的量確定為5×10-5mol/L。RRS光譜技術(shù)中Fe3+量的優(yōu)化如圖8所示，當(dāng)Fe3+的濃度達(dá)到4×10-5mol/L后，體系的ΔIRRS取得最大值。但此時(shí)若繼續(xù)增加過(guò)量的Fe3+，可以發(fā)現(xiàn)其RRS光譜是不穩(wěn)定的且ΔIRRS也有明顯減小的趨勢(shì)，這可能是由于過(guò)量的Fe3+以游離態(tài)的形式先與花旗松素的酚羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成金屬配合物，從而減小了與CDs表面功能團(tuán)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致該方法的靈敏度不夠。反之若進(jìn)一步減小Fe3+的量，很明顯反應(yīng)不完全，且ΔIRRS會(huì)相應(yīng)的減少而導(dǎo)致整個(gè)體系的線性范圍變窄，不利于實(shí)際樣品的分析應(yīng)用。因此，綜合考慮且結(jié)合RRS光譜圖，最終確定Fe3+的濃度為4×10-5mol/L。

圖8 Fe3+濃度的優(yōu)化Fig.8 (a) RRS spectra of CDs in the presence of Fe3+, (b) ΔIRRS of CDs in different amounts of Fe3+

2.3.4乙醇的影響

由于天然植物活性成分花旗松素是較難溶于冷水中的，因此本實(shí)驗(yàn)采用了95%的乙醇對(duì)其先進(jìn)行溶解，待充分溶解后再用二次蒸餾水將其稀釋及定容。所以，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步考慮乙醇溶液是否會(huì)對(duì)該體系的現(xiàn)象造成影響。將95%的乙醇溶液按照不同體積的量分別加入到CDs-Fe3+檢測(cè)花旗松素的實(shí)驗(yàn)體系中，記錄體系RRS強(qiáng)度變化。如圖9所示，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，隨著乙醇溶液量的增加，體系的ΔIRRS變化不大。故可推測(cè)，乙醇溶液對(duì)該體系的熒光信號(hào)基本無(wú)影響。

圖9 乙醇的影響Fig.9 Effect of ethanol volume

Conditions: CDs, 20μL; Fe3+, 4×10-5mol/L; taxifolin: 6 μmol/L

2.3.4反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性

為了保證體系中的反應(yīng)都能夠充分進(jìn)行，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系光譜信號(hào)的影響。每數(shù)分鐘測(cè)一次混合體系的RRS光譜并記錄ΔIRRS，從而確定反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)時(shí)間及其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)記錄從5 min開(kāi)始觀察現(xiàn)象，如圖10所示，反應(yīng)一開(kāi)始是較劇烈的，直到20 min后反應(yīng)趨于平緩，25 min后基本達(dá)到飽和態(tài)，且體系的ΔIRRS在1.0 h內(nèi)趨于穩(wěn)定。故體系的最佳反應(yīng)時(shí)間選擇為25 min，實(shí)驗(yàn)測(cè)定要求在1.5 h內(nèi)完成。

圖10 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.10 The reaction time and stability

Conditions: CDs: 20μL; Fe3+: 4×10-5mol/L; taxifolin:6 μmol/L

2.4 CDs-Fe3+-花旗松素體系的光譜響應(yīng)特性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，重復(fù)1.3部分的實(shí)驗(yàn)方法，記錄體系的分子熒光光譜及RRS光譜。由圖11(a)可知，將不具熒光特性的Fe3+加入到CDs中，體系的熒光信號(hào)被顯著猝滅，但當(dāng)加入同樣不具熒光特性的花旗松素后，發(fā)生了有趣的一幕，體系中猝滅的熒光信號(hào)竟得以恢復(fù)。經(jīng)計(jì)算，恢復(fù)的熒光強(qiáng)度與花旗松素的濃度在5-150×10-7mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。但是，鑒于該方法的靈敏度較低，同時(shí)討論了整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系的ΔIRRS與花旗松素濃度的關(guān)系。

如圖11(b)所示，波長(zhǎng)范圍220-800 nm內(nèi)隨著花旗松素濃度的增加，RRS光譜在381 nm特征峰處的散射強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，且ΔIRRS與花旗松素的濃度在0.9-160×10-7mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限為8.6×10-9mol/L，線性方程為ΔIRRS=45.67C花旗松素+454.87，相關(guān)系數(shù)為0.9975。對(duì)比熒光光譜法和共振瑞利散射光譜法的線性范圍及檢出限情況，綜合考慮，最終選擇更加靈敏且線性范圍較寬的RRS光譜法用于實(shí)際樣品中花旗松素的痕量測(cè)定。同時(shí)，將RRS光譜法測(cè)定花旗松素的相關(guān)參數(shù)與眾多文獻(xiàn)相比較，該方法簡(jiǎn)單、靈敏且快捷，在實(shí)際應(yīng)用中具有較大推廣潛值。

圖11 熒光光譜響應(yīng)特征和共振瑞利散射光譜響應(yīng)特征Fig.11 Fluorescence spectral response characteristics and RRS spectral response characteristicsConditions: CDs, 20μL; Fe3+, 4×10-5 mol/L; taxifolin, 6 μmol/L.

2.5 體系反應(yīng)機(jī)理的推測(cè)

2.5.1三元體系之間的反應(yīng)

如圖5所示，F(xiàn)e3+和花旗松素對(duì)CDs熒光信號(hào)的影響。CDs在345 nm處有較強(qiáng)的熒光特征峰，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)加入5×10-5mol/L的Fe3+，體系的熒光強(qiáng)度顯著猝滅。由于合成碳點(diǎn)的表面含有大量的羥基、羧基及含C、N基團(tuán)，故可以推測(cè)，體系熒光猝滅是由于Fe3+與CDs表面基團(tuán)發(fā)生相互作用形成配位化合物。另外，F(xiàn)e3+作為過(guò)渡金屬離子，其順磁性也可能通過(guò)分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移來(lái)猝滅熒光。如圖12所示，當(dāng)Fe3+加入到CDs中，二元體系的吸收光譜帶強(qiáng)度增強(qiáng)，從而進(jìn)一步佐證兩者之間發(fā)生了反應(yīng)。

圖12 體系的吸收光譜圖Fig.12 The UV-Vis absorption spectra of CDs-Fe3+-taxifolin

Conditions: CDs, 20 μL; Fe3+, 4×10-5mol/L; taxifolin, 6 μmol/L.

當(dāng)花旗松素加入到CDs-Fe3+體系中，體系的熒光得以恢復(fù)、RRS信號(hào)放大且紫外-可見(jiàn)吸收光譜帶強(qiáng)度明顯增加。根據(jù)熒光光譜、RRS光譜以及紫外-可見(jiàn)吸收光譜的變化，綜合考慮這可能是由于花旗松素?fù)碛形鍌€(gè)酚羥基的特殊結(jié)構(gòu)處于弱酸態(tài)易與金屬配合物相結(jié)合，加之Fe3+與酚羥基的顯色反應(yīng)，因此可以推斷CDs、Fe3+和花旗松素三者以Fe3+為媒介兩兩作用，最終形成了一種新的金屬螯合物。整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系的反應(yīng)現(xiàn)象簡(jiǎn)圖如圖13所示。

圖13 三元體系實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象圖Fig.13 ternary system experimental phenomenon diagram

如圖14所示，L-Cys功能化的CDs在與Fe3+作用后，原本在3124cm-1處的O-H特征峰發(fā)生了偏移，在3430 cm-1周?chē)纬闪?OH寬峰，同時(shí)也是以水為介質(zhì)形成碳點(diǎn)的典型特征峰；而CDs-Fe3+在2424 cm-1出現(xiàn)了一個(gè)新的特征峰，而1711 cm-1處的C=N拉伸振動(dòng)及1225 cm-1處的C-H變形振動(dòng)消失，原本處于1585 cm-1處的-NH2發(fā)生偏移出現(xiàn)在1632 cm-1。對(duì)于體系CDs-Fe3+-花旗松素，3430 cm-1周?chē)腛-H拉伸振動(dòng)變寬，在1263 cm-1處產(chǎn)生了C-H變形振動(dòng)的新峰，1167 cm-1峰源于C-O拉伸振動(dòng)，1087 cm-1峰可識(shí)別為C-N的變形振動(dòng)。綜上，均可以進(jìn)一步佐證前面的推測(cè)，即三元體系之間相互反應(yīng)最終生成新的金屬螯合物。

圖14 傅里葉紅外光譜圖Fig.14 The fourier transform infrared(FT-IR) spectrum of ternary system

2.5.2體系熒光和RRS強(qiáng)度變化的原因探索

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)共振瑞利散射峰位于或接近于其分子吸收帶時(shí)，散射通過(guò)共振吸收光的能量而發(fā)生再散射過(guò)程會(huì)導(dǎo)致RRS強(qiáng)度增加[18,19]。通過(guò)比較吸收光譜和RRS光譜(如圖15)發(fā)現(xiàn)，RRS光譜特征峰與分子的特征吸收帶十分接近，產(chǎn)生再散射過(guò)程，導(dǎo)致體系的RRS信號(hào)放大，強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。

圖15 RRS光譜與吸收光譜比較Fig.15 RRS spectrum and absorption spectrum comparison

研究表明，體系中分子體積的大小改變是影響RRS強(qiáng)度的一個(gè)重要因素[20,21]。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，合成碳點(diǎn)在水溶液中呈單分散狀，其本身RRS強(qiáng)度較弱。體系中不存在花旗松素時(shí)，CDs-Fe3+的分子質(zhì)量較小，體積還不夠大故RRS強(qiáng)度變化不明顯。但是當(dāng)三者共存時(shí)，兩兩之間通過(guò)Fe3+為媒介，形成了新的金屬螯合物，分子體積增大，使三元體系CDs-Fe3+-花旗松素的RRS強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。

另一方面，影響RRS強(qiáng)度變化的因素還要考慮分子的剛性結(jié)構(gòu)[22,23]。在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)e3+能夠與CDs通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)形成金屬配合物，而Fe3+與花旗松素中的酚羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，三者之間以Fe3+為媒介兩兩反應(yīng)最終生成一種新的金屬螯合物。通過(guò)反應(yīng)，體系的分子體積增大，同時(shí)有可能導(dǎo)致分子的剛性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。所以，我們推測(cè)體系RRS強(qiáng)度增強(qiáng)的另一個(gè)重要原因是由于體系中分子的平面剛性結(jié)構(gòu)改變所致。

2.6 樣品分析

采用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0304 g花旗松素，先用95%的乙醇充分溶解再轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中用二次蒸餾水定容。實(shí)驗(yàn)中利用100 μL的移液槍取60 μL樣品溶液于10 mL的比色管中，重復(fù)1.3實(shí)驗(yàn)方法的平行測(cè)定5次，計(jì)算純度。并與出售方標(biāo)注的高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定值相比較，如表1所示。再以收集的長(zhǎng)江水樣做回收實(shí)驗(yàn)，將取得的長(zhǎng)江水過(guò)濾處理，除去一些懸浮的較大雜質(zhì)，然后3000 rpm轉(zhuǎn)速離心處理30分鐘后，取上清液于分析測(cè)定。測(cè)定方法按照1.3部分，每種濃度平行測(cè)定5次，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2中，結(jié)果令人滿意。

表1 花旗松素的測(cè)定結(jié)果Table.1 Results for determination of Taxifolin(n=5)

表2 回收率的測(cè)定結(jié)果Tabl 2 Determination of recovery rate in real samples(n=5)

3 結(jié)論

花旗松素作為一種市場(chǎng)稀缺的天然植物活性成分，應(yīng)用廣泛。建立一種快捷、靈敏的痕量檢測(cè)方法至關(guān)重要。文章在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，記錄了體系的RRS光譜、熒光光譜以及紫外-可見(jiàn)吸收光譜來(lái)討論L-Cys修飾的CDs、Fe3+和花旗松素三者之間發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。本文通過(guò)考察反應(yīng)條件、影響因素和機(jī)理推測(cè)，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，成功建立起一種快捷、靈敏痕量檢測(cè)花旗松素的共振瑞利散射光譜法，ΔIRRS與花旗松素的濃度在0.9-160×10-7mol/L范圍內(nèi)線性變化，檢出限為8.6×10-9mol/L。目前采用RRS光譜技術(shù)來(lái)分析檢測(cè)天然植物活性成分花旗松素的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系在沒(méi)有添加緩沖溶液的情況下具有較好的穩(wěn)定性，也是RRS光譜法作為檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)的少有案例，因此本項(xiàng)工作對(duì)RRS作為分析檢測(cè)的新技術(shù)應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。