蔣承順,李旺,柳艷,陸峰,*
(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福州 350122;2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,上海 200433)
DNA即脫氧核糖核酸,由脫氧核苷酸組成,具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。每個脫氧核苷酸都由磷酸、脫氧核糖和含氮堿基組成。其中,含氮堿基又分為腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T四種類型。四種含氮堿基含量與排列順序的不同決定了遺傳物質(zhì)的多樣性。作為大多數(shù)生物的遺傳信息載體,對DNA的研究一直是科學(xué)研究的熱點之一。
傳統(tǒng)的DNA分析方法,如聚合酶鏈反應(yīng)和微陣列技術(shù),通常需要熒光標記,不僅程序復(fù)雜、成本較高,還會導(dǎo)致DNA分子內(nèi)在化學(xué)結(jié)構(gòu)信息出現(xiàn)損失。而目前建立的檢測分析技術(shù)常涉及DNA標靶的標記和雜交后標記,使檢測過程更加復(fù)雜[1,2,3]。表面增強拉曼光譜是一種超靈敏的檢測方法,當分子與粗糙的貴金屬表面接近時,可產(chǎn)生強Raman散射信號[4,5]。許多學(xué)者運用SERS對DNA進行檢測和分析。Papadopoulou[6,7]用硫醇化修飾DNA,使之附于金屬粒子表面,得到了增強的拉曼信號。而后發(fā)現(xiàn)在Ag膠基底中加入一定量的MgSO4能夠促進Ag納米顆粒的聚集從而獲得DNA的SERS光譜,而不需要對DNA進行硫醇化。2015年,Xu[8]等人用碘化鉀修飾Ag納米顆粒(Ag IMNPS),同時添加MgSO4以中和表面電荷并增強DNA與Ag納米顆粒的相互作用,在模仿人生理環(huán)境的溶液中檢測到具有高度可重復(fù)性的拉曼信號。該方法操作簡單,不需要特殊的基底,能檢測到豐富的信號且重現(xiàn)性較好。因此,本文以此方法為基礎(chǔ),進一步優(yōu)化SERS對ssDNA(single-stranded deoxyribonucleic Acid)的檢測條件。
已有的文獻研究中,SERS檢測ssDNA常使用大型且昂貴的臺式顯微共聚焦系統(tǒng),有時不能滿足快速現(xiàn)場檢測的需求。相比之下,便攜式拉曼光譜系統(tǒng)具有易于攜帶、操作簡便、快捷、價格低的優(yōu)點,在現(xiàn)代分析中應(yīng)用越來越廣泛。然而,以Ag IMNPS為基礎(chǔ)的方法卻不直接適用于便攜式拉曼系統(tǒng)對DNA的檢測。因此,本文對該方法的檢測條件進行優(yōu)化,使其適用于便攜式拉曼光譜系統(tǒng),并對優(yōu)化后的方法進行穩(wěn)定性、重復(fù)性和檢測限的考察,還對檢測結(jié)果進行峰位歸屬,為便攜式拉曼光譜系統(tǒng)檢測ssDNA提供一種新的方法基礎(chǔ)。
單鏈DNA GO18(序列為AACCTTTGGTCGGGCAAGGTAGGTT (5′~3′)),購自生工生物工程(上海)股份有限公司;硝酸銀(AgNO3)、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O72H2O)、硝酸(HNO3)均為分析純,購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;碘化鉀(KI)、硫酸鎂(MgSO4)均為分析純,購自上海泰坦科技股份有限公司;其他實驗耗材均購于探索平臺;實驗用水為去離子水。
便攜式拉曼光譜儀(BWS415-785H),激光激發(fā)波長785 nm,分辨率5 cm-1,配有放大倍數(shù)為20倍的物鏡,購自美國必達泰克公司;雙光束紫外可見分光光度計(TU-1902),購自北京普析通用儀器有限責任公司;高速離心機(TG16-WS),購自上海盧湘宜離心機有限公司;掃描電子顯微鏡(Zeiss EVO MA-10),購自德國Carl-Zeiss公司;多功能旋渦混合器(Vortex-Genie2),購自美國Scientific Industries 公司;實驗室純水系統(tǒng)(Smart-D UV),購自上海和泰儀器有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S),購自上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;電子天平,購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;圓底燒瓶,冷凝管等。
本實驗采用經(jīng)典的Lee法制備納米銀膠[9]。首先,精密稱取36 mg的硝酸銀,溶于200 mL的去離子水中,倒入500 mL三頸燒瓶內(nèi),加熱并磁力攪拌,當溶液微沸時,保持攪拌狀態(tài),將4 mL質(zhì)量分數(shù)1%的檸檬酸三鈉水溶液緩慢加入,繼續(xù)回流攪拌加熱60 min,可以觀察到溶液的顏色逐漸由無色透明變?yōu)樯钭厣?,最后變?yōu)榈S色并略顯綠色,停止反應(yīng)后室溫冷卻,即得到粒徑約為50 nm 的納米銀球,最后倒入干凈的棕色瓶中避光保存。由于銀膠屬于介穩(wěn)體系,因此每次取用納米銀膠時,均需搖晃均勻。取銀膠原溶液1 mL離心(5000 r/min,5 min),除去上清液,用等量去離子水復(fù)溶,再加去離子水至5 mL,然后在300~500 nm波長范圍進行紫外掃描。取銀膠原溶液1 mL離心(5000 r/min,5 min),除去上清液,加去離子水至1 mL,取2~3 μL滴于硅片上,在紅外燈下照射,待溶劑揮發(fā)完全后進行電鏡掃描。
單鏈DNA初始為粉末狀,加入去離子水配制成濃度為50 μM的母液,置于-20℃的冰箱中儲存。精確稱取KI粉末16.6 mg溶于100 mL去離子水中,得1 mM KI溶液。精確稱取MgSO4粉末60 mg溶于50 mL去離子水中,得10 mM MgSO4溶液?;趨⒖嘉墨I[8]并適當改變,用移液槍取2.5 μL濃縮膠,向其中精密加入2.5 μL 1 mM的KI溶液,渦旋,使其充分混合,并在室溫下孵育20 min,以確保KI完全清洗AgNPs表面。然后加入2.5 μL DNA溶液和適量10 mM的MgSO4溶液充分混合,再加去離子水至50 μL,混勻即得。
為了獲得更加靈敏的信號,同時闡明不同檢測參數(shù)對單鏈DNA SERS圖譜的影響,分析單鏈DNA GO18在便攜式拉曼光譜儀的不同檢測條件下的SERS譜圖。試驗參數(shù)設(shè)置為:銀膠濃縮倍數(shù)50倍、100倍和150倍;激發(fā)功率為30%(60 mW)、50%(100 mW)、80%(160 mW);積分時間為10 s、20 s、30 s;掃描次數(shù)為1次;顯微系統(tǒng)放大倍數(shù)為20倍;裝樣方式為96孔板、高純度石英毛細管1.0~0.8(外徑1.0 cm,內(nèi)徑 0.8 cm)、1.0~0.7、1.75~0.9);凝聚劑MgSO4(10 mM)用量0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL。分析不同試驗參數(shù)對SERS結(jié)果的影響,以獲得優(yōu)化的檢測條件。
采用BWSpec4軟件對采集的原始光譜進行平滑(savitzky-golay平滑)、基線校正(airPLS法)等處理。然后用MATLAB 13.0軟件對數(shù)據(jù)做進一步的處理,使其能夠用于Origin 8.5軟件進行繪圖。由于光譜波段400 cm-1之前和1800 cm-1之后幾乎沒有光譜特征,因此選取光譜波段400~1800 cm-1進行繪圖分析。
對制得的銀膠原溶液進行紫外掃描和電鏡掃描。掃描電鏡顯示所制得的納米銀膠顆粒呈直徑為50 nm的球體狀態(tài),且大小分布較為均一。紫外掃描只在410 nm處出現(xiàn)了一個尖銳的單峰,且其半峰寬較小,反映出納米銀膠顆粒具有良好的分散性與均一性,能夠滿足試驗的需要。
選擇合適的銀膠濃縮倍數(shù)是SERS實驗順利實施的一個重要因素。本實驗配制了濃縮50倍、100倍和150倍三種濃縮膠,在其他條件相同的情況下,探究濃縮倍數(shù)對SERS檢測結(jié)果的影響。圖1的結(jié)果表明:濃縮100倍與50倍的檢測信號強度相似,但前者能更快檢測到穩(wěn)定的信號,而濃縮150倍的銀膠未能出現(xiàn)正常的ssDNA SERS信號。原因可能是:50倍濃縮膠中,銀納米顆粒的量相對較少,不能夠最大程度地增強ssDNA的SERS信號,而且較少的銀納米顆粒需要更多時間聚沉到穩(wěn)定狀態(tài);100倍濃縮膠中銀納米顆粒的數(shù)量相對充足,能夠最大程度地增強ssDNA的SERS信號,且較多的銀納米顆粒能夠更快地聚沉至穩(wěn)定狀態(tài),更快檢測到穩(wěn)定的SERS信號;150倍濃縮膠中的銀納米顆粒數(shù)量過多、易聚沉,導(dǎo)致銀膠本身的信號較強,而ssDNA反而不易與銀膠接觸,導(dǎo)致ssDNA的信號變?nèi)醵汇y膠本身的信號掩蓋,出現(xiàn)了異常峰信號??傊?,銀膠濃縮100倍時,能更快地檢到穩(wěn)定且強度大的SERS信號。
圖1 不同銀膠濃縮倍數(shù)檢測結(jié)果Fig.1 Testing results of different silver sol concentrations
不同裝樣方式對檢測結(jié)果有較大影響,文獻[8]中使用96孔板進行檢測,該方式所需要的樣品量大且待檢體系易于沉淀,所以嘗試選用高純石英毛細管裝樣。考慮到不同內(nèi)外徑毛細管管壁不同,單位激光照射面積上的液體體積不同可能對檢測結(jié)果有影響,選用三種不同內(nèi)外徑毛細管1.0~0.8(表示該高純石英毛細管外徑1.0 cm,內(nèi)徑0.8 cm,下同)、1.0~0.7、1.75~0.9進行檢測并與96孔板相比較。96孔板的檢測結(jié)果峰信號很弱,原因是96孔板中待檢體系出現(xiàn)明顯沉淀,導(dǎo)致激光照射處ssDNA和銀納米顆粒濃度較低。1.75~0.9毛細管的信號也明顯低于1.0~0.7和1.0~0.8毛細管,可能是因為1.75~0.9毛細管的管壁較厚,降低了入射激光的效率導(dǎo)致檢測信號較弱。1.0~0.8和1.0~0.7毛細管的檢測結(jié)果基本相同,但考慮到1.0~0.8毛細管的內(nèi)徑更大,更有利于移液槍進樣,所以后續(xù)都使用1.0~0.8毛細管裝樣。
由于激光功率和積分時間對SERS檢測結(jié)果有比較大的影響,所以對二者同時進行優(yōu)化。首先,選擇三個常用激光功率(30%(60 mW)、50%(100 mW)和80%(160 mW))和三種積分時間(10 s、20 s、30 s),再將二者進行兩兩組合,即對9種檢測條件進行比較。激光功率-積分時間為10 s-30%、10s-50%和20s-30%的峰信號較弱,而20s-80%、30s-50%、30s-80%的峰信號超出量程,所以這6種條件加以排除。對10s-80%、20s-50%、30s-30%這三種檢測條件進行篩選(圖2),10s-80%的強度略低于20s-50%和30s-30%,而后兩者強度幾乎無差別,但是激光功率為30%(60mW)時,對低濃度樣品的檢測更有優(yōu)勢,檢測限更低,所以最終選擇30s-30%作為優(yōu)化條件。
圖2 激光功率-積分時間檢測結(jié)果篩選Fig.2 Screening of laser power-integration time detection results
在檢測體系中加入MgSO4,可以中和Ag IMNPS表面電荷并增強ssDNA與Ag IMNPS的相互作用,從而能夠檢測到強烈且可再現(xiàn)的SERS信號[8]。加入MgSO4量的多少對檢測結(jié)果有較大影響,所以考察其加入量。在檢測體系的配制過程中,分別加入MgSO4(10 mM)0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL進行檢測,結(jié)果如圖3??梢娂尤?.5 μL、1.0 μL MgSO4的信號較弱,可能是因為MgSO4的量不能夠使Ag IMNPS與ssDNA充分凝聚。加入MgSO4體積為2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL、5.0 μL的峰信號強度無明顯差別,說明2.0 μL MgSO4就足夠使得Ag IMNPS與ssDNA充分凝聚,再增加MgSO4反而可能會因為凝聚劑過多,使得檢測體系出現(xiàn)沉淀,影響檢測結(jié)果。因此,加入2.0 μL MgSO4(10 mM)是最優(yōu)的條件。
圖3 不同MgSO4加入量的檢測結(jié)果Fig.3 Testing results of different MgSO4 addition amount
綜上,便攜式拉曼光譜儀對單鏈DNA檢測的最佳條件為:銀膠濃縮100倍,高純石英毛細管 1.0~0.8(外徑 1.0 cm,內(nèi)徑 0.8 cm)裝樣,激光功率30%(60 mW),積分時間30 s,凝聚劑MgSO4(10 mM)2.0 μL。
3.6.1重復(fù)性考察
按照優(yōu)化后的條件,對同一濃度待測體系進行6次檢測,檢測體系中樣品濃度為2.5 μM,每次取穩(wěn)定后的光譜圖進行重復(fù)性的檢驗。拉曼位移在788cm-1處出現(xiàn)最強峰,歸屬于PO2-的骨架伸縮振動,以該峰峰強計算RSD值,結(jié)果為4.72%,顯示該方法重復(fù)性較好。
3.6.2穩(wěn)定性考察
按照優(yōu)化后的條件,對同一待測體系進行了連續(xù)的SERS檢測,檢測體系中樣品濃度為2.5 μM,每次測量間隔為0 s,共采集120張光譜。圖4為第1、2、3、4、5、10、20、40、60、80、100、120張光譜圖,可見前5張圖譜信號一直上升,然后趨于穩(wěn)定(即檢測150s后)。主要原因為:在加入MgSO4之后,激光照射下銀納米顆粒的聚集加快,前5張圖譜是在凝聚點到達穩(wěn)定過程中檢測的,隨后納米顆粒聚集達到穩(wěn)定狀態(tài),信號也隨之穩(wěn)定。
圖4 同一樣品采集120次部分譜圖Fig.4 Part of 120 spectra from the same sample
3.6.3檢測限考察
按照優(yōu)化后的條件,采用倍比稀釋法配制了ssDNA終濃度為5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.313μM的檢測體系,如圖5所示,拉曼位移在1094 cm-1處出現(xiàn)最穩(wěn)定特征峰,文獻中已有報道其為ssDNA中磷酸骨架的特征峰,以此峰計算檢測限。當樣品最終濃度為0.625μM時,S/N>3;終濃度為0.313μM時,S/N<3,因此0.625μM可作為檢測限。該濃度已低于大多數(shù)文獻報道的SERS測定DNA的濃度,說明優(yōu)化后的方法具有一定優(yōu)勢。
圖5 不同樣品濃度檢測結(jié)果Fig.5 Testing results of different sample concentrations
3.6.4峰位歸屬
文獻中對ssDNA的SERS峰位進行了初步的歸屬但并不詳細,而且由于方法的改進及選用儀器的改變,可能會與已有報道的峰位歸屬存在一定的偏差,所以需要對優(yōu)化條件所得到的SERS圖譜重新進行峰位歸屬。
首先設(shè)計了存在單一堿基類型的單鏈ssDNA序列,即在一條 ssDNA 鏈中所有的堿基類型都為A或T或C或G,即A11、T11、C11、G5(下標表示堿基個數(shù),需要注意的是,在單鏈ssDNA的合成中,一條鏈中連續(xù)G的個數(shù)不能超多5個,因此,G5的堿基個數(shù)為5個G,其他序列為11個同種堿基)。然后分別進行SERS檢測,與樣品檢測結(jié)果進行歸一化后相對比。
圖6為A11、T11、C11、G5以及GO18的SERS光譜圖,可以看出,四種不同的ssDNA具有豐富且獨特的SERS指紋信息。它們在1094cm-1處(歸屬于PO2-的對稱伸縮振動)顯示出共同的SERS強峰,在788 cm-1附近也能觀察到明顯的由PO2-骨架伸縮振動所產(chǎn)生的SERS峰,表明在該待測體系中磷酸骨架非常接近Ag IMNPs表面,從而產(chǎn)生增強的拉曼信號。A11的SERS光譜在730 cm-1處出現(xiàn)腺嘌呤的主要特征峰,來源于腺嘌呤的環(huán)呼吸振動。T11的SERS光譜圖在745 cm-1的峰為胸腺嘧啶的SERS特征峰,來源于胸腺嘧啶的環(huán)呼吸振動,同時1649 cm-1也出現(xiàn)胸腺嘧啶強的特征峰。對于C11的SERS光譜,其只在683 cm-1左右出現(xiàn)較小的特征峰,而在790 cm-1處出現(xiàn)一強峰,該峰并不完全來源于胞嘧啶的環(huán)呼吸振動,而是由于C的環(huán)呼吸振動所產(chǎn)生,它與磷酸骨架伸縮振動所產(chǎn)生的788 cm-1處的峰拉曼位移比較接近,兩者重疊后在791 cm-1左右處出現(xiàn)很強的包埋復(fù)合SERS峰。對于G5的SERS光譜,在683 cm-1、1325 cm-1、1487 cm-1、1576 cm-1處存在其主要的特征峰,分別對應(yīng)G環(huán)的呼吸振動、dG C2′-endo/syn、dG N7 H-bond to H2O、dG δNH (N2HH-bond to H2O)。另外,800 cm-1~1150 cm-1范圍內(nèi)也具有較為豐富的SERS峰,來源于磷酸骨架和脫氧核糖的分子振動。
圖6 樣品與單堿基單鏈DNA檢測結(jié)果Fig.6 Testing results of the sample and the single-base ssDNA
與文獻相比,可以很明確地發(fā)現(xiàn)方法的改進與檢測儀器的改變會對ssDNA的SERS峰位歸屬產(chǎn)生一定的影響(如文獻中PO2-的對稱伸縮振動在1087cm-1處出峰,而本文所測得的峰為1094cm-1),主要體現(xiàn)在峰位的小幅度偏移,以及個別峰的強度差異上。但同時也可以表明該方法可以真實地反映ssDNA的基本結(jié)構(gòu)組成的指紋信息,包括堿基、磷酸骨架及脫氧核糖,進一步證明了該方法具有較高的可靠性與一定的應(yīng)用前景。
通過對四種不同單一堿基類型的ssDNA的分析,以及參照已有文獻對各種ssDNA的SERS峰位歸屬,本文對改進的SERS方法檢測GO18得到的峰位進行了更加完善詳細的歸屬(表1)。
表1 GO18的SERS峰歸屬Table.1 The SERS peak position assignment of GO18
本文以GO18為例,研究銀膠溶液濃縮倍數(shù)、激發(fā)功率及積分時間、裝樣方式、凝聚劑MgSO4的用量等不同檢測條件對單鏈DNA的SERS檢測結(jié)果的影響,確定了最佳的檢測條件。該條件下,方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好,峰位歸屬明確,檢測限達0.625 μM。本研究為進一步擴大和推動SERS技術(shù)在單鏈DNA檢測中的應(yīng)用提供了方法基礎(chǔ)。