大鯢肉酶解肽抗氧化及免疫活性研究

賀屹潮， 金文剛，2*， 陳德經(jīng),2， 楊 慧

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000)

大鯢(Andriasdavidiauns)為兩棲動物，全身是寶，其皮膚、皮膚分泌物、肌肉、骨骼含有很多生物活性物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，素有“水中活人參”之稱[1]。大鯢肉蛋白質(zhì)含量為17.21%，粗脂肪為1.30%，灰分為1.01%，水分為80.40%，大鯢肉蛋白質(zhì)中含有8種人體必需氨基酸，含量在32.5%，人體必需氨基酸指數(shù)(EAAI)為91.53[2]，大鯢肉中含有14種脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸含量為35.80%，DHA、EPH含量分別為4.54%、6.68%[3]，大鯢體內(nèi)鉀含量310 mg/100 g，鈉62 mg/100 g，磷196 mg/100 g，鈣16.22 mg/100 g，鋅1.60 mg/100 g，鐵0.5 mg/100g，銅0.07 mg/100 g，每100 g肉提供的硒可達(dá)0.04 mg[4]。近年來，人工養(yǎng)殖大鯢在我國形成了規(guī)?；攴敝?00萬尾，存養(yǎng)商品鯢3000萬尾，養(yǎng)殖規(guī)模的增大導(dǎo)致商品鯢價格不斷下滑[5]。大鯢的直接食用受到加工、運輸?shù)认拗疲乙话愕娜庵破芳庸じ郊又档?。因此，需要對大鯢肉進(jìn)行高附加值加工利用，以提高大鯢肉的加工效益。

食源生物活性肽通常由2～10個氨基酸組成，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強記憶、改善元素吸收等生物活性，是一類低敏、無毒、安全性高的蛋白片段，在人類營養(yǎng)健康和疾病調(diào)節(jié)方面顯示出廣闊的發(fā)展前景[6-7]。食源生物活性肽的制備方法主要是酶解法，具有操作條件溫和、易控、安全性高等特點。食源蛋白質(zhì)酶解肽的功能性如溶解性、乳化性、起泡性通常要優(yōu)于原蛋白[8]。

大鯢肉具有營養(yǎng)滋補作用，但增強免疫作用缺乏系統(tǒng)的實驗研究。為此，本研究利用酶解法制備大鯢肉酶解肽，鑒定其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性，為大鯢高附加值多肽產(chǎn)品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：漢中大鯢，購于漢中市龍頭山水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)公司養(yǎng)殖基地。

主要試劑：堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，購于廣西南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶，購于上海生工生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)購于SIGMA公司；抗壞血酸；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、青霉素-鏈霉素溶液(Penicillin-Streptomycin)、胰蛋白酶-EDTA(0.25%)、酚紅(Trypsin-EDTA，phenol red)等，購于美國Corning公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA320413電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；AD500S-H型實驗室數(shù)顯分散均質(zhì)機，上海昂尼儀器儀表有限公司；pHS-3C型pH計，上海雷磁儀器廠；UV2100型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；SYKAM433D氨基酸分析儀，蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱，三洋電機株式會社；5702R型低速離心機，Eppendorf生命科學(xué)公司；MULTISKAN MK3型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 方 法

1.3.1 原料預(yù)處理

鮮活大鯢，宰殺后去皮、去可見脂，于絞肉機中絞碎為肉糜。

1.3.2 酶解工藝流程

肉糜按1∶3料液比加入蒸餾水→恒溫水解6 h→冷卻至室溫→10 000 rpm離心10 min→取上清→濃縮→冷凍干燥→天然肽。

提取天然肽后的肉→加水調(diào)pH值(堿性蛋白酶：pH 8.0，溫度55 ℃；風(fēng)味蛋白酶：pH 7.0，溫度50 ℃；胰蛋白酶：pH 7.0，溫度50 ℃)→2500 U/g加酶→恒溫水解3 h→沸水浴滅活→冷卻后調(diào)pH至中性→10 000 rpm離心10 min→透析→濃縮→冷凍干燥→酶解肽樣品。

NP：大鯢肉天然肽；APP：堿性蛋白酶酶解肽；FPP：風(fēng)味蛋白酶酶解肽；TP：胰蛋白酶酶解肽。

1.3.3 水解度測定

采用pH-stat法進(jìn)行水解度測定，依據(jù)酶解過程中加入體系用于維持pH值恒定消耗的堿液體積直接計算[9]，其計算公式為

DH(%)=[B×Nb/(Mp×α×htot)]×100%，

式中DH為水解度，%；B為消耗的堿的體積以維持pH不變，mL；Nb為堿的濃度，mol/L；Mp為底物中蛋白總量，g；htot為底物中肽鍵總數(shù)，mmol/g，本研究中以7.5計；α為水解過程中α-氨基的解離度，計算公式為α=10pH-pK/(1+10pH-pK)。

1.3.4 酶解肽分子量測定

采用凝膠滲透色譜(GPC)結(jié)合內(nèi)標(biāo)法，計算酶解產(chǎn)物中不同分子量范圍所占比例[10]。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

實驗方法參考文獻(xiàn)[11]，取3 mL酶解肽稀釋樣品(2、4、6、8、10 mg/mL)于試管中，再加入3 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，用去離子水進(jìn)行調(diào)零，用紫外可見分光光度儀測定517 nm處的吸光度，記錄數(shù)據(jù)并計算不同濃度樣品溶液對DPPH自由基的清除率。對照采用抗壞血酸(0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL)，其清除率計算公式為

清除率(%)=(A0-A)/A0×100%，

式中A0為3 mL去離子水+3 mL DPPH的吸光度，A為3 mL樣品溶液+3 mL DPPH的吸光度。

清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100%，

式中A為樣品組吸光度,A0為對照組吸光度,A1為空白組吸光度。

1.3.5.3 亞鐵離子螫合能力

測定方法參考文獻(xiàn)[13]，取1 mL酶解肽稀釋樣品(0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL)于試管中，與50 μL 2 mmol/L氯化亞鐵溶液和1 mL去離子水混合均勻后室溫靜置5 min，加入100 μL 5 mmol/L菲咯嗪溶液，室溫靜置5 min后，在2000 r條件下離心10 min，測上清液在562 nm下吸光值。對照采用EDTA-2Na(0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL),其螯合率計算公式為

鰲合率(%)=[1-A/A0]×100%，

式中A為樣品組吸光度，A0為用等體積去離子水代替樣品后吸光度。

1.3.6 免疫活性測定

測定方法參考文獻(xiàn)[14]，取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，按5000個/孔接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)液100 μL，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；按照50、100、200、400 μg/mL組，細(xì)胞培養(yǎng)所需48 h后，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h；加入150 μL DMSO震蕩10 min；測定各孔吸光值OD568，其增殖率計算公式為

增殖率(%)=[(A-A1)/(A0-A1)×100-A0]×100%，

式中A為樣品組吸光度,A0為正常細(xì)胞組吸光度；A1為空白組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度曲線

經(jīng)不同蛋白酶酶解，酶解肽的水解度隨水解時間變化曲線見圖1。由圖可見，隨時間的增長，90 min前水解度顯著上升，原因可能是因為在0～90 min時，隨著時間的變化，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白酶與分子內(nèi)部的酶切位點更易發(fā)生作用，促進(jìn)酶解[15]；之后水解度逐漸趨于平緩，2.5～3 h達(dá)到平臺期，原因可能是在90 min以后，可用于水解的肽鍵濃度降低，同時蛋白酶的活性隨時間逐漸降低，最終APP、FPP和TP的水解度為28.55%、10.36%和15.58%，與張佳嬋等[16]在其最佳實驗條件下的水解度結(jié)果(19.61%±0.12%)、馬小燕等[17]使用風(fēng)味蛋白酶酶解的水解度(19.11%)較為相似，和徐陽等[18]的水解度(27.96%±0.5%)較為接近。

圖1 大鯢肉酶解肽的水解度曲線

2.2 分子量分布分析結(jié)果

本課題組測定了酶解產(chǎn)物分子量分布信息，結(jié)果見表1。從表中可看出，該物質(zhì)分子量分布主要集中在0～0.5 kDa、0.5～1 kDa和1～2 kDa3個范圍，其中2 kDa以下分別為98.85%、93.36%和98.22%，與王文莉等[19]研究結(jié)果相似，符合已報道的食源生物活性肽的分子量范圍特征。

表1 天然肽及酶解肽的分子量分布

2.3 酶解肽的抗氧化性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

酶解肽對DPPH自由基的清除作用如圖2所示。從圖中可看出，在實驗設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)酶解肽對DPPH自由基均有一定的清除作用，能力與質(zhì)量濃度成正比。當(dāng)濃度在10 mg/mL時，APP、FPP、TP對DPPH自由基的清除率為60.65%±3.15%、65.01%±3.16%和59.06%±0.29%，其IC50值分別為5.92、3.54、5.43 mg/mL，F(xiàn)PP最高，3種酶在10 mg/mL時的DPPH自由基清除能力均高于天然肽的清除率44.81%±0.99%。而VC的清除能力較強，在濃度為1 mg/mL時清除率已超過90%。

圖2 酶解肽及VC對DPPH自由基的清除率 圖3 酶解肽及VC對超氧自由基的清除率

2.3.3 亞鐵離子螯合能力

大鯢肉酶解肽的亞鐵離子螯合能力如圖4所示。從圖中可看出，在實驗設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)大鯢肉酶解肽有一定的亞鐵離子螯合能力，其能力與質(zhì)量濃度成正比。當(dāng)濃度在2 mg/mL時，APP、FPP和TP的亞鐵離子螯合能力為74.29%±0.11%、74.11%±0.42%和64.52%±0.41%，其IC50值分別為1.06、1.14、1.39 mg/mL，APP最高，且3種酶在2 mg/mL時的亞鐵離子螯合能力均高于天然肽的清除率49.78%±1.99%。同時EDTA-2Na的亞鐵離子螯合能力較強，在2 mg/mL時可達(dá)到90.87%。

2.4 細(xì)胞免疫活性

本課題組用MTT法測定了不同濃度肽對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響。RAW264.7細(xì)胞處理48 h后，與未經(jīng)樣品處理的RAW264.7細(xì)胞相比，隨著濃度的增長，細(xì)胞的增殖率逐漸升高，大鯢肉天然肽對細(xì)胞增殖率為20.52%，APP、FPP、TP的細(xì)胞增殖率最高為17.96%±0.49%、35.97%±1.56%和16.58%±0.78%，由圖5可以看出，與另兩種相比，F(xiàn)PP對RAW264.7細(xì)胞的增殖率在所有濃度下最高，同時，APP和TP對RAW264.7細(xì)胞的增殖率小于NP對細(xì)胞的增殖率，可能是因為這兩種酶對大鯢本身含有的免疫物質(zhì)造成了破壞，F(xiàn)PP的免疫活性最高。

圖4 酶解肽及EDTA-2Na的亞鐵離子螯合能力 圖5 不同濃度酶解肽對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

3 結(jié) 論

以大鯢肉經(jīng)堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶酶解，水解度依次為28.55%、10.36%和15.58%。3種酶解肽分子量分布97%以上集中在5 kDa以下，其中2 kDa以下占98.85%、93.36%和98.22%，更加有利于吸收。

3種酶解肽對DPPH自由基、超氧陰離子清除能力和亞鐵離子螯合能力均高于大鯢肉天然肽。3種酶解肽均有對RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖活性，濃度為400 μg/mL時，細(xì)胞增殖率為17.96%±0.49%、35.97%±1.56%和16.58%±0.78%。綜合比較，風(fēng)味蛋白酶酶解肽的抗氧化和免疫活性均高于其它酶解肽，并高于大鯢肉天然肽的抗氧化和免疫活性，可廣泛用于保健食品和化妝品。