河南漢族人群21個(gè)常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列基因座的遺傳多態(tài)性檢測(cè)

康 冰,王 鑫，吳 東，王紅丹，何 淼，蘇俊祥，張 波，劉俢銘，廖世秀

1)河南省人民醫(yī)院河南省醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州450003 2)河南省遺傳性疾病功能基因組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450003 3)國家衛(wèi)生健康委出生缺陷預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州450003 4)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州450003 5)河南大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州450003

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)又稱微衛(wèi)星DNA，是一種可遺傳的不穩(wěn)定的并且具有高度多態(tài)性的短的核苷酸重復(fù)序列，符合孟德爾遺傳定律,在法醫(yī)學(xué)親子鑒定、個(gè)體識(shí)別及遺傳病連鎖分析等方面有廣泛應(yīng)用[1]。目前法醫(yī)學(xué)中最常用的復(fù)合擴(kuò)增體系均包括了13個(gè)DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)(combined of DNA index system,CODIS)STR基因座，能夠滿足一般法醫(yī)物證鑒定的要求，但在單親鑒定以及突變等疑難案例中往往需要檢測(cè)更多STR基因座才能得出最終結(jié)果[2-7]。本研究對(duì)河南漢族人群20個(gè)非CODIS和1個(gè)CODIS STR基因座等位基因頻率、最小等位基因頻率(minimum allele frequency,MAF)、觀察雜合度(observed heterozygosity,Hob)、期望雜合度(expected heterozygosity,Hex)、個(gè)體識(shí)別率(power of discrimination,PD)、多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)、典型父權(quán)指數(shù)(typical paternity index,TPI)、非父排除率(power of exclusion,PE)及匹配概率(matching probability,MP)等指標(biāo)進(jìn)行分析，為親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別提供新的基因座[8]。

1 材料與方法

1.1樣本采集按照知情同意和知情選擇原則，采集304例河南地區(qū)無關(guān)漢族人群樣本(男154例，女150例)，且三代以內(nèi)均為漢族，并世代居住于河南。采集靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器和試劑ABI 9700型基因擴(kuò)增儀、3500Dx型DNA測(cè)序儀(美國Life公司)、Lab-Aid 820型核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司)、GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒(中國基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司)、Chelex-100(美國Sigma公司)。

1.3基因組DNA提取采用Chelex-100方法。取200 μL EDTA抗凝血，加入1 mL ddH2O,混勻，室溫置30 min，間歇振蕩， 12 000 r/min離心3 min，去上清，加入200 μL 體積分?jǐn)?shù)5% Chelex-100和5 μL 20 g/L的蛋白酶K，56 ℃孵育30 min，振蕩后沸水浴8 min，振蕩后12 000 r/min離心3 min，4 ℃保存。

1.4STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增①參照GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC試劑盒說明操作。擴(kuò)增體系：去離子水4 μL，5×PCR預(yù)混液2 μL，5×22NC引物2 μL，模板DNA(0.25～0.50 μg/L)1 μL，10×增強(qiáng)劑1 μL，總體積10 μL。在ABI 9700型基因擴(kuò)增儀上擴(kuò)增：95 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，30個(gè)周期；60 ℃ 10 min；15 ℃保存。②PowerPlex?21體系(美國普洛麥格生物技術(shù)有限公司)中21個(gè)STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增參照試劑盒說明進(jìn)行操作。擴(kuò)增體系：去離子水5 μL，5×PCR預(yù)混液2 μL，5×PP21引物2 μL，模板DNA(0.25～0.50 μg/L)1 μL，總體積10 μL。擴(kuò)增條件：96 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30 個(gè)周期；60 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳分離及檢測(cè)用3500Dx型DNA測(cè)序儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，應(yīng)用Genemapper ID-X軟件與ORG-500內(nèi)標(biāo)進(jìn)行比對(duì)。片段大小的測(cè)定和記錄均以±0.5 bp為標(biāo)準(zhǔn)。

1.6GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC體系的效能驗(yàn)證選取21例親權(quán)指數(shù)<10 000的二聯(lián)體和存在突變位點(diǎn)的親權(quán)鑒定計(jì)算增加22NC體系后的累計(jì)親權(quán)指數(shù)(CPI)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)判斷各STR基因座的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用PowerStatsV12計(jì)算21個(gè)基因座的等位基因頻率、MAF、Hob、Hex、PD、PIC、PE、TPI、MP。

2 結(jié)果

304例河南地區(qū)漢族無親緣關(guān)系的無關(guān)個(gè)體的21個(gè)常染色體STR基因座等位基因頻率分布見表1。聯(lián)合利用PowerPlex?21 系統(tǒng)熒光標(biāo)記試劑盒和GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC體系對(duì)21例二聯(lián)體和存在突變位點(diǎn)的親權(quán)鑒定進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)規(guī)范要求，CPI>10 000，均能得出支持生物學(xué)親子關(guān)系的結(jié)論(表2)。

表1 河南省地區(qū)漢族人群中21個(gè)常染色體STR基因座的等位基因頻率和遺傳學(xué)參數(shù)(n=304)

續(xù)表1

表2 GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)22NC體系在21例二聯(lián)體鑒定中的效能分析

3 討論

《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》(GB/T 37223-2018)中提及：對(duì)于親權(quán)鑒定過程中，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果和親權(quán)指數(shù)計(jì)算結(jié)果形成鑒定意見時(shí)，在CPI不能滿足判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)增加檢測(cè)遺傳標(biāo)記。目前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常用的復(fù)合擴(kuò)增體系通常能夠滿足常規(guī)法醫(yī)物證鑒定(如標(biāo)準(zhǔn)親權(quán)鑒定)的要求，但在單親鑒定以及突變[9]等疑難案例中往往需要增加檢測(cè)更多STR基因座才能得出最終結(jié)果。在本研究21例單親鑒定案例中，單獨(dú)使用PowerPlex?21系統(tǒng)熒光標(biāo)記試劑盒檢測(cè)時(shí)CPI值均小于10 000，不能得出明確結(jié)論，在增加GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC基因座后，即使在部分案例(如案例11)出現(xiàn)2個(gè)STR基因座突變的情況下，21例單親鑒定案例CPI均大于10 000，能夠得出支持存在生物學(xué)親子關(guān)系結(jié)論。

本研究是利用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC，通過抽樣研究河南漢族人群，結(jié)果表明此體系中所用到的21個(gè)常染色體STR基因座多數(shù)在河南漢族人群中具有高度多態(tài)性[10-11]，GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC可以應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別與親子鑒定的日常工作和檢測(cè)中。GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)22NC中的基因座大多數(shù)不是常用基因座，在一些特殊個(gè)體識(shí)別和親子鑒定中是一個(gè)很好的補(bǔ)充。