離子色譜-脈沖安培法同時測定食品中9種糖和糖醇的含量

(仙樂健康科技股份有限公司,廣東汕頭 515041)

糖類是食品中重要的功能組分,過高的糖分攝入不僅容易導致肥胖、齲齒、營養(yǎng)不良等問題,還會加速皮膚老化,同時還易誘發(fā)痛風、骨質疏松,增加罹患多種慢性疾病如高血壓、糖尿病等疾病的風險[1-2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)于2015年發(fā)布了糖攝入量指南,建議在成人和兒童游離糖的攝入量應降至總能量攝入的10%以下[3-4]。近年來,隨著生活水平和健康意識的不斷提高,低糖、無糖食品越來越受到人們的認可和青睞。為了在減少糖的用量的基礎上同時保持產品口感和風味,市面上許多無糖或低糖食品通常會添加麥芽糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇等糖醇類物質來替代蔗糖和淀粉糖(葡萄糖、麥芽糖等)。

低糖、無糖食品中糖類物質的檢測普遍存在著含量低、樣品基質復雜,且有大量的同分異構體和手性化合物同時存在的難題。因此,建立一種能同時分離、測定低糖、無糖食品中多種糖和糖醇類成分的檢測方法意義重大。目前對于果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等常見單、雙糖的檢測方法主要有滴定法[5-6]、液相色譜-示差檢測法(HPLC-RID)[7-9]、液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)[10-12]、液質聯(lián)用法(LC-MS/MS)[13-15]、離子色譜法(IC)[16-18]等。滴定法操作步驟繁瑣,前處理耗時較長,且結果誤差較大,易受其他有色物質干擾。液相色譜-示差檢測法靈敏度較低,檢測器平衡時間長,基線噪聲大且無法梯度洗脫。液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法靈敏度較示差檢測器略高,但仍難以達到無糖(糖含量≤0.5%)的檢出限。液質聯(lián)用法分析時間短,但與液相色譜法一樣,均是采用氨基色譜柱進行分離,而市場上常見的氨基色譜柱均難以將麥芽糖醇與蔗糖、乳糖、麥芽糖完全分離開來。同時,由于許多常見的單糖和雙糖都互為同分異構體(如葡萄糖和果糖、麥芽糖和乳糖等),產生的碎片離子大都相似,因此液質聯(lián)用法也難以發(fā)揮其專屬性高的優(yōu)勢。離子色譜法利用糖類物質在堿性條件下呈離子狀態(tài)的特點,利用陰離子交換色譜柱進行分離,以氫氧化鈉/醋酸鈉為淋洗液梯度洗脫,能夠完全分離常見的幾種糖和糖醇;以安培檢測器檢測定量,靈敏度高,完全能夠滿足低糖甚至無糖產品中糖類成分的檢測。

本文擬建立一種利用離子色譜-脈沖安培檢測器同時分離、測定葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇的方法,該方法操作簡便,專屬性強,適用于低糖、無糖產品中糖類物質的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售軟糖1(無糖)、軟糖2(低糖)、軟糖3(低糖)、固體飲料1(低糖)、固體飲料2(低糖)、代餐粉(低糖)、能量棒(低糖) 均購自天貓旗艦店;葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖標準品 中國食品藥品檢定研究院;赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇標準品,50%氫氧化鈉溶液 美國Sigma公司;乙酸鈉(HPLC級) 上海安譜實驗科技股份有限公司。

ICS 5000+離子色譜儀(配四元梯度泵,脈沖安培檢測器(金工作電極,Ag/AgCl參比電極),Chromenleon 7.2 SR5色譜工作站) 美國Thermo Fisher公司;CarboPac PA1保護柱(4 mm×50 mm),CarboPac PA1分析柱(4 mm×250 mm),On Guard RP凈化柱(2.5 mL) 美國Thermo Fisher公司;XS205DU型分析天平 瑞士METTLER-TOLEDO公司;UNIVERSAL 320R型離心機 德國Hettich公司;DZKW-D-2型水浴鍋 上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司;CASCADA I型超純水機 美國PALL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 精密稱取葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇標準品各10 mg至100 mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,搖勻,得到濃度為100 μg/mL的標準儲備液(該溶液在4 ℃條件下可保存15 d)。精密吸取上述溶液適量,加水逐級稀釋成濃度為0.1、0.5、1、5、10、50 μg/mL的溶液,作為標準系列工作液,溶液臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品的處理及其溶液配制 取軟糖樣品和能量棒樣品約30 g,冷凍粉碎,混合均勻后備用;取固體飲料和代餐粉樣品5袋,混合均勻后備用。精密稱取混合均勻的樣品1 g,加水30 mL,于70 ℃水浴加熱至完全溶解分散,取出,冷卻至室溫。用1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)樣品溶液pH至1.7±0.1,放置約2 min后,再用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)樣品溶液pH至4.5±0.1。將樣品溶液轉移至100 mL容量瓶中,加水定容至刻度,搖勻。離心,吸取1 mL上清液,加水稀釋至10 mL。依次用8 mL甲醇和8 mL水活化RP凈化柱,再將樣品溶液依次通過0.22 μm水相濾膜和凈化柱,棄去前面3倍柱體積洗脫液,收集后面洗脫液待測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:CarboPac PA1保護柱(4 mm×50 mm)、CarboPac PA1分析柱(4 mm×250 mm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測器:脈沖安培檢測器,Au工作電極,Ag/AgCl參比電極;淋洗液:淋洗液A為超純水,淋洗液B為氫氧化鈉溶液(200 mmol/L),淋洗液C為氫氧化鈉(150 mmol/L)乙酸鈉(500 mmol/L)混合溶液,梯度洗脫程序見表1。分別吸取標準溶液和樣品溶液適量,按上述色譜條件進樣分析,根據(jù)保留時間定性,標準曲線法定量。

表1 梯度淋洗程序Table 1 The program of gradient elution

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜結果積分處理采用Thermo Chromenleon 7.2 SR5色譜工作站,并利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 離子色譜柱的選擇 糖和糖醇為弱酸性物質,pKa值為12～14之間。在堿性條件下以陰離子形式存在于溶液中,可采用氫氧化鈉/醋酸鈉淋洗液系統(tǒng),通過陰離子交換色譜柱對其進行分離[19-20]。試驗考察了CarboPac PA1、CarboPac PA20及CarboPac MA1三款不同的色譜柱,色譜圖見圖1。

圖1 不同色譜柱對應色譜圖Fig.1 Chromatogram of different columns 注:A:MA1;B:PA20;C:PA1;1.赤蘚糖醇;2.木糖醇;3.山梨糖醇;4.葡萄糖;5.麥芽糖醇;6.果糖;7.蔗糖;8.乳糖;9.麥芽糖。

其中,CarboPac MA1對糖和糖醇的保留較強,分離度良好,但運行時間較長,色譜峰峰寬較大,靈敏度相對較低。同時,如果淋洗液系統(tǒng)中含有醋酸鈉,MA1色譜柱的平衡時間較長;如果不含醋酸鈉,樣品中的其它強保留的雜質成分(如低聚糖類)又難以從色譜柱上洗脫下來,隨著樣品分析次數(shù)的增加,基線不斷抬高。CarboPac PA20分析速度快,靈敏度高,但對赤蘚糖醇和木糖醇保留較弱,出峰過快導致無法完全分離。CarboPac PA1能夠對9種糖和糖醇進行較好的分離,且保留時間適中,故采用PA1色譜柱作為本實驗的分析柱。

2.1.2 樣品前處理的優(yōu)化 食品基質復雜,尤其是本次實驗中檢測的軟糖、代餐粉和營養(yǎng)棒中,含有大量的明膠、果膠和蛋白質等物質,不僅會對目標色譜峰產生干擾,而且還容易對色譜柱及檢測器造成損壞。因此,需在樣品的前處理過程中增加除蛋白的步驟以減少干擾,保護色譜柱。常見的除蛋白的方法有鹽析法[21]、有機試劑沉淀法[21-22]、沉淀劑法[23]、pH沉淀法[24-25]等。鹽析法需加入大量鹽類物質,上機前需對樣品溶液進行脫鹽處理,否則高濃度的鹽易對色譜峰的峰形及保留時間造成影響。有機試劑沉淀法操作簡單,沉淀蛋白的分辨能力高于鹽析法,但考慮到部分離子色譜柱對有機試劑不耐受,故排除了有機試劑沉淀法。常用的蛋白沉淀劑有亞鐵氰化鉀-乙酸鋅,沉淀效率高,但考慮到金屬離子對離子色譜的不良影響,故不考慮沉淀劑法。最終采用調節(jié)pH的方式沉淀蛋白,沉淀效果較好且對離子色譜分析無影響。

同時,為了除去樣品中的其他雜質,沉淀蛋白后的樣品溶液還需通過凈化柱進行進一步的純化。常用的凈化柱有On Guard A柱,On Guard Na柱,On Guard RP柱等。A柱主要用于去除樣品溶液中的陰離子污染物并中和強酸;Na柱主要用于去除樣品溶液中的金屬離子;RP柱主要用于去除樣品溶液中的疏水性物質及表面活性劑?？紤]到樣品中可能存在部分脂溶性物質,故樣品溶液在上機測試之前還需依次通過0.22 μm微孔濾膜及On Guard RP柱以除去樣品中的脂溶性雜質,避免污染色譜柱。軟糖1(無糖)樣品溶液色譜圖見圖2。

圖2 樣品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample solution注:1.赤蘚糖醇;2.山梨糖醇;3.麥芽糖醇;4.葡萄糖;5.果糖;6.蔗糖;7.麥芽糖。

2.2 方法驗證

2.2.1 標準曲線與定量限 將1.2.1項下的標準系列工作液按方法規(guī)定的色譜條件進樣測試,以濃度(μg/mL)為橫坐標X,以峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線,并計算回歸方程和相關系數(shù)。

對標準溶液進行逐級稀釋,以信噪比為10時的溶液濃度作為定量限。結果表明,9種糖和糖醇在0.1～10 μg/mL范圍內線性關系良好,各指標線性回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、定量限見表2。

表2 9個化合物的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)和定量限(S/N=10)Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and LOQs of the nine compounds(S/N=10)

2.2.2 方法重復性 取軟糖1(無糖)樣品,按1.2項下方法操作,平行制備6份樣品溶液,按方法規(guī)定色譜條件進樣分析,計算樣品中9種糖和糖醇的含量及RSD值,結果見表3。結果表明,方法重復性良好,RSD值均小于3%。

表3 重復性測定結果(n=6)Table 3 Repeatability test results(n=6)

表5 市售產品檢測結果(%)Table 5 Test results of commercial products(%)

2.2.3 方法回收率 取已知含量的軟糖1(無糖)樣品9份,每份0.5 g,分成3組,每組平行3個樣,分別加入低、中、高濃度的混合標準品溶液,按方法要求操作并測定,計算9種糖和糖醇的回收率,結果見表4。結果顯示,9種糖和糖醇的回收率均在96.54%～103.71%之間,相對標準偏差在0.65%～2.53%之間,方法回收率良好,準確度較高。

2.3 市售樣品檢測

本次實驗共收集了市售的3款無糖或低糖型軟糖、3款低糖型粉劑及1款低糖型能量棒,按已建立的方法測定樣品中糖和糖醇的含量,結果見表5。結果顯示,本次試驗收集的7款市售樣品中,無糖樣品的含糖量均低于0.5%,低糖樣品的含糖量均低于5%,符合《GB 28050-2011 食品安全國家標準 預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》中對無糖和低糖食品含糖量的規(guī)定[26]。其中,軟糖中常添加的糖醇主要為麥芽糖醇和山梨糖醇;粉劑及營養(yǎng)棒中常添加的糖醇包括赤蘚糖醇和麥芽糖醇。

3 結論

本文建立了梯度洗脫-離子色譜-脈沖安培檢測方法同時測定葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇,并對樣品的前處理及色譜柱的選擇進行了考察和優(yōu)化,使其可用于實際市售各個劑型樣品的檢測。結果表明,9種糖和糖醇在0.1～10 μg/mL范圍內線性關系良好,定量限均小于0.1 μg/mL;樣品重復性相對標準偏差為1.34%;加標回收率均在96.54%～103.71%之間,相對標準偏差0.65%～2.53%。該方法操作簡便、重現(xiàn)性好、靈敏度高、定量限低,解決了實際檢測中糖和糖醇分離不佳、響應較差的難題,可廣泛應用于低糖、無糖食品中糖和糖醇的檢測,具有較高的實際應用價值。