玉米葉向值的全基因組關(guān)聯(lián)分析

彭 勃 趙曉雷 王 奕 袁文婭 李春輝 李永祥 張登峰 石云素 宋燕春 王天宇,* 黎 裕,*

玉米葉向值的全基因組關(guān)聯(lián)分析

彭 勃1,**趙曉雷1,**王 奕1,**袁文婭1李春輝2李永祥2張登峰2石云素2宋燕春2王天宇2,*黎 裕2,*

1天津市農(nóng)作物研究所 / 天津市農(nóng)作物遺傳育種重點實驗室, 天津 300384;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

葉向值是反映葉片“直”和“立”兩個特性的綜合指標。葉向值高的品種, 葉片直而不彎, 葉夾角小, 有利于群體通風(fēng)透光, 在群體密度較高時比平展型更容易獲得高產(chǎn)。闡明葉向值的遺傳基礎(chǔ), 對玉米理想株型分子設(shè)計育種具有重要的意義。本研究以285份多樣性玉米自交系為材料, 利用Illumina的maizeSNP50芯片基因分型結(jié)合連續(xù)2年的葉向值表型鑒定, 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析方法挖掘玉米葉向值顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點。方差分析表明, 不同自交系的葉向值差異達到極顯著水平(<0.01)。在最優(yōu)模型選擇時, 發(fā)現(xiàn)Q+K模型最適合本研究的葉向值關(guān)聯(lián)分析。在2個年份下, 共檢測到15個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的位點(<4.05E-5), 包括27個SNP, 解釋5.54%~8.73%的表型變異, 并挖掘了15個候選基因。其中1.07 bin上的位點2是本研究發(fā)現(xiàn)的重要位點, 其候選基因可能是編碼細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的, 有待進一步圖位克隆工作驗證。

玉米; 葉向值; 葉夾角; 單核苷酸多態(tài)性; 關(guān)聯(lián)分析

過去的幾十年中, 玉米株型結(jié)構(gòu)的改良, 尤其是直立葉型的品種對玉米產(chǎn)量的遺傳增益起了重要的作用[1-2]。直立葉型品種比平展葉型品種通常更耐密植, 通過較高的葉面積指數(shù)來增加群體光能截獲, 促進群體光合作用, 進而獲得高產(chǎn)[1,3-4]。葉向值是可以同時反映葉片“直”和“立”兩個特性的綜合指標。穗上葉向值高, 上部葉片直而不彎, 葉夾角小而上沖, 是理想株型育種的重要選擇目標[3]。因此, 闡明玉米葉向值的遺傳基礎(chǔ)對玉米理想株型育種具有重要的意義。

玉米葉向值是典型的數(shù)量性狀, 受多基因控制,遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜[5-6]。前人以不同雜交組合構(gòu)建的F2、F2:3、四交F1單株、RILs群體為材料, 利用SSR分子標記和連鎖作圖方法, 在染色體的很多區(qū)段都檢測到了控制葉向值的QTL[5-11]。其中, 主效QTL(解釋表型變異率大于10.00%的QTL)遺傳效應(yīng)大, 受環(huán)境影響小, 歷來是分子育種和QTL圖位克隆優(yōu)先關(guān)注的位點[2,12-13]。在1.01 bin、1.02 bin、1.10 bin、2.02 bin、2.04 bin、3.06 bin、3.08 bin、3.09 bin、4.01~4.02 bin、7.00 bin和7.04 bin上先后發(fā)現(xiàn)了葉向值的主效QTL[5-11]。隨著技術(shù)的發(fā)展, 近年來, 利用第3代分子標記SNP標記通過連鎖作圖方法, 在3.05 bin、7.05 bin上也發(fā)現(xiàn)了葉向值的主效QTL[14-15]。Zhao等[6]整合了前人關(guān)于葉夾角、葉向值、葉長、葉寬、葉面積和葉長/葉寬6個葉型性狀的QTL定位結(jié)果, 通過元分析方法, 發(fā)現(xiàn)22個meta-QTL (mQTL),并預(yù)測了其候選基因。

綜上, 連鎖作圖為玉米葉向值遺傳基礎(chǔ)的解析提供了重要的參考, 但是由于受到群體重組率、標記密度等限制, QTL定位區(qū)間較大, 而且僅僅能分析少數(shù)幾個等位基因。與連鎖分析互補, 全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)可以高效挖掘多個多樣性玉米種質(zhì)資源的優(yōu)異等位基因。關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)被用于葉夾角遺傳基礎(chǔ)的剖析[12,16-17], 而且[12]、和[2]、[13]4個控制葉夾角的QTL已經(jīng)實現(xiàn)了圖位克隆。在玉米葉向值上, 僅Lu等[18]以80份玉米骨干自交系為材料, 利用1.49×106個SNP結(jié)合2年的表型鑒定, 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)方法檢測到33個與葉夾角和葉向值顯著相關(guān)的SNP (<1.00E-6), 并在顯著的SNP位點上下游9.7 kb的LD衰減距離內(nèi), 挖掘到22個葉夾角候選基因和7個葉向值候選基因。相比于葉夾角, 葉向值全基因組關(guān)聯(lián)分析的報道較少。本研究以285份遺傳多樣性豐富的玉米自交系為關(guān)聯(lián)群體, 結(jié)合覆蓋玉米整個基因組的56,110個SNP標記, 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法(GWAS)挖掘玉米種質(zhì)資源中調(diào)控葉向值的基因資源, 旨在為耐密植的玉米理想株型分子設(shè)計育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供, 是從890份包含玉米自交系核心種質(zhì)[19]和近年來我國玉米育種常用優(yōu)良自交系, 以及近1000份其他國家的自交系[20]中, 選擇出適應(yīng)天津地區(qū)種植, 且遺傳多樣性較高的285份玉米自交系, 其中271份來源于我國北方、黃淮海、西南主要玉米生產(chǎn)區(qū)域, 12份來源于美國, 1份來源于非洲, 1份來源于墨西哥。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗設(shè)計 全部材料于2017年和2018年連續(xù)2年種植在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院武清創(chuàng)新基地, 采用完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計, 單行區(qū), 2次重復(fù), 行長3 m, 行距0.6 m, 密度67,500株 hm–2。施肥、灌溉、防蟲和除草同當(dāng)?shù)卮筇锕芾怼?/p>

在玉米散粉后10 d, 從第4株開始, 每行連續(xù)測量5株穗上3片葉的葉夾角(θ)、葉長(L)和高點長(葉片基部至葉片最高點的距離, Lf), 并采用Pepper等[21]提出的方法計算葉向值(leaf orientation value, LOV), LOV = 1/Σ(90 ? θ) × (Lf/L),表示測定葉片數(shù)。

1.2.2 表型數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對2個環(huán)境下葉向值(LOV)的平均值、標準差、頻率分布等進行描述性統(tǒng)計分析。利用R語言(http://www. r-project.org/) lme4包的混合線性模型, 計算每份材料最佳線性無偏預(yù)測(best linear unbiased prediction, BLUP)值, 模型中將基因型(Geno)、年份(Year)、基因型與年份互作(Geno:Year)和重復(fù)(Rep)都作為隨機效應(yīng), 所得到的每份材料的BLUP值與截距相加, 即可得到每份材料真正的遺傳效應(yīng)表型數(shù)值, 用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.2.3 基因型鑒定與SNP質(zhì)量控制 285份材料利用MaizeSNP50 BeadChip芯片基因分型, 該芯片包括56,110個SNP標記, 基因型數(shù)據(jù)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。利用PLINK1.09軟件[22]過濾掉最小等位基因頻率(maf)<0.05, 基因型缺失率(geno)>0.2的SNP標記。最終39,827個SNP通過軟件質(zhì)量控制。

1.2.4 連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)分析

利用Haploview 4.2軟件計算SNP之間的LD衰減距離, 同一染色體上兩個位點之間的距離以25 kb的基本分類單元分類, 并計算不同分類單元的平均LD[23]。標記間相關(guān)系數(shù)(2)小于0.1, 認為沒有相關(guān)性[24]。

1.2.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析 (1)閾值確定: 由于很多SNP之間可能存在高度連鎖不平衡, 因此采用GEC軟件(http://grass.cgs.hku.hk/gec/estimateB.php? function=Bonferroni)[25]計算有效標記數(shù)(effective number, Ne), 并根據(jù)軟件計算出的建議閾值(1/Ne)作為葉向值與SNP間是否顯著關(guān)聯(lián)的依據(jù)。(2)模型選擇與全基因組關(guān)聯(lián)分析: 利用TASSEL5.0軟件的3種常用的模型, 即只控制群體結(jié)構(gòu)的Q模型(Q)、只控制親緣關(guān)系的K模型(K)、控制群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的Q+K模型(Q+K)對葉向值進行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 通過比較QQ圖來選擇最優(yōu)模型, 并分析最優(yōu)模型下SNP與葉向值的關(guān)聯(lián)。(3)候選基因預(yù)測: 定義同一染色體上物理距離小于連鎖不平衡(LD)衰減距離的所有顯著關(guān)聯(lián)的SNP為1個位點, 在每個位點內(nèi)?lg()峰值的SNP上下游各LD衰減距離的區(qū)間范圍內(nèi)挖掘候選基因[26]?；趨⒖蓟蚪M(B73_RefGen_ v4), 在ensembl網(wǎng)站上搜索每個位點內(nèi)的所有候選基因, 利用ensembl數(shù)據(jù)庫和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫預(yù)測候選基因執(zhí)行的生物學(xué)功能, KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測候選基因可能參與的生物學(xué)通路信息。此外, 通過序列比對水稻(RAP數(shù)據(jù)庫)或者擬南芥(Tair數(shù)據(jù)庫)相關(guān)同源基因的功能來注釋玉米候選基因。結(jié)合上述基因注釋以及MaizeGDB上qTeller的表達部位分析, 在每個QTL區(qū)間內(nèi)確定1個最有可能的葉向值候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉向值表型數(shù)據(jù)分析

不同年份葉向值的基本統(tǒng)計量分析(表1和圖1)顯示, 285份多樣性自交系關(guān)聯(lián)群體的葉向值在不同年份呈現(xiàn)廣泛的連續(xù)變異。2018年葉向值群體均值高于2017年, 表明關(guān)聯(lián)群體總體上在2017年更趨于平展, 2018年更趨于緊湊上沖, 而2年葉向值BLUP居中。不同年份葉向值的峰度和偏度的絕對值都小于1 (表1), 表明葉向值在不同年份均服從正態(tài)分布, 說明葉向值為典型的數(shù)量性狀, 受多基因控制。

方差分析結(jié)果表明(表2), 不同年份關(guān)聯(lián)群體葉向值的基因型效應(yīng)、年份效應(yīng)和基因型×年份互作效應(yīng)達到極顯著水平(<0.01), 而重復(fù)間方差不顯著(>0.05)。因此, 各自交系間的葉向值存在極顯著差異, 且年份對葉向值也有顯著的影響。葉向值在不同年份間的遺傳力達到87.86%, 提示該性狀主要受遺傳因素控制, 不同年份的環(huán)境效應(yīng)影響較小。相關(guān)分析結(jié)果表明不同年份之間葉向值的相關(guān)達到極顯著水平(<0.01)。最佳線性無偏預(yù)測(Best Linear Unbiased Prediction, 簡稱BLUP)可以對多環(huán)境數(shù)據(jù)整合, 消除環(huán)境效應(yīng), 得到材料穩(wěn)定遺傳的表型。BLUP與不同年份葉向值相關(guān)系數(shù)高達0.90以上, 進一步驗證了葉向值具有較高的遺傳力, 受環(huán)境影響較小。

表1 不同年份葉向值的基本統(tǒng)計量分析及相關(guān)分析

*和**分別表示在< 0.05和< 0.01水平顯著。BLUP: 最佳線性無偏預(yù)測。

*and**indicate significance at< 0.05 and< 0.01, respectively. BLUP: Best Linear Unbiased Prediction.

表2 不同年份葉向值的方差分析

*和**分別表示在< 0.05和< 0.01水平顯著。

*and**indicate significance at< 0.05 and< 0.01, respectively.

圖1 不同年份玉米葉向值的頻率分布圖

A: 2017年; B: 2018年; C: 2年聯(lián)合的BLUP值。

A: Year of 2017; B: Year of 2018; C: BLUP for combined 2 years.

2.2 LD分析

285份材料10條染色體平均LD衰減距離為457 kb (圖2), 其中1號到10號染色體LD衰減距離分別為332、299、432、500、382、421、445、500、631和694 kb (圖2)。

2.3 葉向值的全基因組關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 閾值確定 利用GEC軟件分析39,827個高質(zhì)量SNP的有效標記數(shù)表明, 有效標記數(shù)Ne為24,703個, 建議值為4.05E-5, 即?lg為4.39。因此, 該值將作為葉向值全基因組關(guān)聯(lián)分析中標記-性狀顯著關(guān)聯(lián)的閾值。

圖2 285份自交系全基因組LD衰減圖

2.3.2 模型選擇 利用3種模型(Q、K和Q+K)分別對2個年份葉向值及其BLUP值進行了GWAS分析。QQ圖顯示(圖3), Q模型(圖中綠色點)和K模型(圖中藍色點)對假陽性的控制效果較差, 而Q+K模型(圖中紫色點)對假陽性的控制較好。因此, 全基因組關(guān)聯(lián)分析利用基于Q+K的混合線性模型來檢測與葉向值顯著相關(guān)的SNP。

圖3 不同年份玉米葉向值3種GWAS模型的QQ圖

A: 2017年; B: 2018年; C: 2年聯(lián)合的BLUP值。綠色點: Q模型; 藍色點: K模型; 紫色點: Q+K模型。

A: Year of 2017; B: Year of 2018; C: BLUP for combined two years. Green spot: Q model; blue spot: K model; purple spot: Q+K model.

2.3.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析 利用覆蓋基因組的39,827個SNP標記結(jié)合285份多樣性自交系連續(xù)2年的葉向值表現(xiàn)及其BLUP值進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析。基于Q+K模型, 一共檢測到27個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的SNP (<4.05E-5)(圖4和表3)。

基于每條染色體的LD衰減距離, 27個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的SNP分布于基因組的15個位點, 分別位于1號、2號、5號、7號和10號5條染色體上(圖5), 其中2017年、2018年和BLUP下分別檢測到8個、2個和12個位點。

位點1位于1.02 bin上, 能夠在2017年和2個年份聯(lián)合分析(BLUP)下檢測到, 可以解釋8.73%和7.95%的表型變異。位點2、3和4都位于1.07 bin上, 其中位點2能夠在2017年和2018年2個環(huán)境以及2環(huán)境聯(lián)合(BLUP)均被檢測到, 且發(fā)現(xiàn)7個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的SNP, 可以解釋6.24%~8.49%的表型變異; 位點3能夠在2017年和2個年份聯(lián)合分析(BLUP)下檢測到, 可以解釋7.30%和7.55%的表型變異; 位點4能夠在2017年、2018年和2環(huán)境聯(lián)合(BLUP)檢測到, 與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的SNP都為PZE-101166565, 可以解釋6.67%~7.65%的表型變異。位點5、6、7、8、9、10、11、13、14和15, 分布在1.08 bin、2.01 bin、2.04 bin、2.07 bin、7.02 bin、10.03 bin和10.04 bin上, 僅在1個環(huán)境或者2環(huán)境聯(lián)合(BLUP)下檢測到, 可解釋5.54%~8.24%的表型變異。位點12位于5.06 bin上, 能夠在2017年和2個年份聯(lián)合分析(BLUP)下檢測到, 可以解釋7.52%和7.70%的表型變異。

圖4 不同環(huán)境下玉米葉向值GWAS (Q+K模型)的曼哈頓圖

A: 2017年; B: 2018年; C: 2年聯(lián)合的BLUP值。綠色點: 位點2峰值SNP上下游各50個SNP在不同年份的曼哈頓圖。

A: Year of 2017; B: Year of 2018; C: BLUP for combined two years. Green spots: the Manhattan plots of 50 SNPs in the upstream and downstream of lead SNP at site 2 in two years.

圖5 本研究檢測的與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的位點在染色體上的分布及與前人研究結(jié)果的比較

Fig. 5 Distribution of the loci significantly association with leaf orientation value detected in this study on chromosomes and the comparison with the results of previous studies

染色體上粗體的bin代表本研究檢測的與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的位點。

Bin with bold on the chromosomes represents the site detected in this study that is significantly association with leaf orientation value.

2.3.4 葉向值候選基因挖掘 基于該群體每條染色體的LD衰減距離, 在每個位點內(nèi)–log10()峰值的SNP上下游各LD衰減距離的區(qū)間范圍內(nèi)挖掘候選基因。在與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的15個位點內(nèi)共計挖掘15個候選基因(表3)。位點1至位點15的候選基因依次為、、、、、、、、、、、、、和。這些基因主要是與葉枕部位細胞分裂和細胞伸長、植物激素的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞壁的生物合成或降解或者一些轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)的基因。

3 討論

3.1 葉向值全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果分析與比較

根據(jù)葉向值的計算公式[21]可知, 葉向值是反映葉片“直”和“立”兩個特性的綜合指標, 葉夾角越小(“立”), 葉片越直而不彎(“直”), 葉向值越大。前人研究也表明, 葉向值與葉夾角極顯著負相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為?0.72至?0.81), 但是與葉長和葉寬相關(guān)性不顯著[9,14]。Zhao等[6]發(fā)現(xiàn)14個具有葉向值QTL效應(yīng)的mQTL中, 約78.60%具有葉夾角QTL效應(yīng)。因此, 作為葉向值構(gòu)成因素之一的葉夾角, 其發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因也可能對葉向值的形態(tài)建成起重要作用[27]。

本研究共檢測到15個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的位點,這些位點可能是玉米葉向值發(fā)育調(diào)控的重點區(qū)域。其中, 位點2能夠在2017年和2018年2個年份環(huán)境, 以及2年份聯(lián)合的BLUP中均被檢測到(圖4), 且包含最多顯著關(guān)聯(lián)的SNP, 效應(yīng)最大的SNP解釋表型變異超過8.00%, 表明這個位點遺傳效應(yīng)較大, 受環(huán)境影響較小, 是葉向值分子設(shè)計育種或者葉向值QTL圖位克隆工作重點關(guān)注的位點。

由于前人檢測的葉向值QTL主要是采用低密度的SSR分子標記和基因重組次數(shù)有限的連鎖作圖群體(如F2:3或RILs群體), QTL定位的精度較低。因此, 在與前人研究結(jié)果相比較時, 若QTL位于相同bin, 則認為不同研究檢測的QTL是同一位點(圖5)[28]。

位于1.02 bin上的位點1, 在2017年解釋葉向值表型變異超過8.00%, 遺傳效應(yīng)較大。前人利用不同群體通過連鎖分析在該位點檢測到控制葉向值的QTL[10-11,14]和葉夾角的QTL[9,17,29-32]。其中, 張姿麗等[11]同時在3個環(huán)境在該位點都檢測到葉向值主效QTL, 可解釋10.10%~19.90%的表型變異。于永濤等[29]、劉正等[30]、Chen等[31]在該位點檢測到葉夾角主效QTL, 解釋14.00%~26.99%的表型變異。Ku等[9]利用豫82和沈137構(gòu)建的229個F2:3家系群體, 通過3個環(huán)境下聯(lián)合連鎖分析, 在1.02 bin位點上同時檢測到控制葉夾角和葉向值的主效QTL, LOD值分別為10.8和11.0, 分別解釋20.40%和23.20%的表型變異。Ku等[5]和Zhao等[6]整合前人研究也發(fā)現(xiàn)該位點同時存在葉向值和葉夾角的QTL。因此, 該位點可能存在1個或幾個不同環(huán)境不同遺傳背景穩(wěn)定表達的、同時控制葉夾角和葉向值的主效基因, 是玉米葉片形態(tài)建成的重要位點, 可用于玉米株型分子育種的前景標記選擇。

位點2、3、4均位于1.07 bin上, 其中位點2是本研究重點發(fā)現(xiàn)的位點。利用不同遺傳群體, Zhao等[6]和Ding等[32]分別都在2個環(huán)境下在該位點檢測到葉夾角QTL, 解釋4.88%~6.97%表型變異。然而, 可能由于群體類型、標記密度或是葉向值QTL定位研究相對較少, 目前還未發(fā)現(xiàn)該位點在調(diào)控葉向值中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)了3個位點共計12個與葉向值顯著相關(guān)的SNP標記都位于1.07 bin上, 提示該區(qū)段可能至少有3個重要基因參與葉向值的發(fā)育調(diào)控。

位點5和位點6都位于1.08 bin上, 包含3個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的SNP標記, 在該位點發(fā)現(xiàn)的葉向值和葉夾角QTL較少。Zhao等[6]在不同水分處理條件下, 在該位點發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定遺傳的葉夾角QTL, 可解釋5.30%~20.58%的表型變異。Ding等[32]也在該位點發(fā)現(xiàn)葉夾角QTL。因此, 該位點的遺傳效應(yīng), 還需要更多研究來證實。

位于2.01 bin上的位點7, 在2年聯(lián)合的BLUP下被檢測到, 可解釋7.11%的葉向值表型變異。前人利用不同群體在不同環(huán)境下在該位點都檢測到了葉向值QTL[5,7]和葉夾角QTL[7,14,32]。其中, Ku等[5]和Zhao等[6]分別整合前人關(guān)于葉夾角和葉向值QTL定位結(jié)果, 通過元分析發(fā)現(xiàn)2.01 bin位點存在同時調(diào)控葉向值和葉夾角的mQTL。

位點8和位點9都位于2.04 bin上, 都是在2年聯(lián)合的BLUP下發(fā)現(xiàn)的, 可解釋6.15%~7.91%的葉向值表型變異。路明等[7]、徐德林等[33]、劉鵬飛等[10]和張姿麗等[11]在該位點均檢測到葉向值QTL, 分別解釋10.92%、5.67%、10.60%和8.90%的表型變異。Ding等[32]還在該位點檢測到葉夾角QTL, 解釋4.54%表型變異。因此, 該位點可能存在調(diào)控玉米葉向值的主效基因。

2.07 bin上挖掘到位點10和位點11共2個控制葉向值的位點, 可解釋5.54%~6.82%表型變異。劉鵬飛等[10]和張姿麗等[11]分別在該位點檢測到葉向值QTL, 解釋6.90%和5.40%的表型變異。總體來看, QTL解釋的表型變異都較低。因此, 該位點可能存在效應(yīng)較小的葉向值調(diào)控基因。

位于5.06 bin的位點12附近檢測到多個葉向值和葉夾角QTL[5-7,11,14,34], 其中, 張姿麗等[11]在5.05~ 5.07 bin上檢測到的葉向值QTL可解釋7.80%~7.90%表型變異, 葉夾角QTL解釋9.30%~9.40%表型變異。Ku等[5]在5.06檢測到1個mQTL, 同時包含葉夾角QTL和葉向值QTL。Zhao等[6]在5.05~5.06 bin上同樣檢測到環(huán)境穩(wěn)定遺傳的葉向值QTL和葉夾角QTL, 可解釋3.38%~8.99%的表型變異。該位點還需進一步精細定位, 挖掘其潛在的候選基因。

位點13位于7.02 bin上, 只在2年聯(lián)合的BLUP下檢測到, 解釋葉向值表型變異較高(8.24%)。在該位點上, 張姿麗等[11]檢測到1個不同環(huán)境穩(wěn)定遺傳的葉向值主效QTL, 可解釋16.40%~20.10%的表型變異; Lu等[18]通過GWAS方法分別檢測到1個葉向值和1個葉夾角QTL。此外, 一些研究[5,32,34]也在該位點檢測到葉夾角QTL。因此, 該基因組區(qū)段可能是玉米葉型性狀重要的調(diào)控區(qū)段。

位點14和位點15分別位于10.03 bin和10.04 bin, 分別在2017年和2年聯(lián)合的BLUP中被檢測到。前人尚未在這兩個染色體區(qū)段檢測到調(diào)控葉向值和葉夾角的QTL。

3.2 葉向值候選基因挖掘

葉的發(fā)育是植物形態(tài)建成的一個重要部分, 其調(diào)控機理十分復(fù)雜。葉原基形成后, 在一系列基因精確調(diào)控下, 葉原基開始建立近-遠軸(面向莖的為近軸面, 背向莖的為遠軸面)、基-頂軸(由葉的基部指向尖部)和中-邊軸(從葉的主脈指向邊緣)三維軸向上的極性[35], 引導(dǎo)原基細胞朝著特定的方向分裂和分化, 最終發(fā)育成一定形態(tài)和大小的葉片。葉向值的形成與基-頂軸和近-遠軸極性的建立有關(guān)。

根據(jù)與葉向值顯著關(guān)聯(lián)的峰值SNP物理位置及LD衰減距離, 從15個位點共計挖掘最有可能的候選基因15個(表3)。與前人探索的葉夾角分子調(diào)控機制類似, 葉向值候選基因主要與葉枕部位細胞分裂和細胞伸長、植物激素的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[2,12-13,16,36-37]。

植物激素的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是葉片發(fā)育調(diào)控重要分子機制之一。位點1的候選基因(cytokinin response regulator8, crr8), 其功能注釋與細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。細胞分裂素是植物生長所必需的激素, 主要作用是調(diào)節(jié)細胞增殖[38]。因此, 推測基因可能通過影響細胞分裂素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控葉枕部位細胞分裂或者葉片近-遠軸面厚壁組織細胞不對稱發(fā)育等途徑實現(xiàn)對葉向值的調(diào)控。此外, 1.02 bin上的基因(indeterminate floral apex1,)編碼C2C2-YABBY類型轉(zhuǎn)錄因子, 突變體葉片不能形成正常的中脈, 葉夾角減小, 葉片稍短, 葉片較窄, 葉鞘較長, 表現(xiàn)披葉的特性[39]。與本研究位點1峰值SNP距離1.86 Mb。因此, 1.02 bin上可能存在多個控制葉向值的主效基因。位點6的候選基因是參與油菜素內(nèi)酯(BR)合成途徑的(brassinosteroid-deficient dwarf1)基因, 距離本研究峰值SNP僅220 kb, 該QTL已被Tian等[2]圖位克隆。通過影響葉枕內(nèi)源BR水平控制葉枕細胞增殖, 最終影響葉夾角的大小。進一步證實了本研究所用關(guān)聯(lián)群體通過GWAS手段可有效挖掘調(diào)控葉向值的基因資源。位點5候選基因編碼一種SPX結(jié)構(gòu)域蛋白, 參與細胞對磷脅迫和冷脅迫響應(yīng)的生物過程。Ruan等[40]研究表明, 水稻磷饑餓誘導(dǎo)蛋白SPX1(Syg1/Pho81/XPR1)和SPX2負調(diào)控葉片傾斜角度。磷缺乏誘導(dǎo)產(chǎn)生SPX1蛋白, 后者與葉傾角調(diào)節(jié)因子1()直接相互作用, 阻止與下游基因BRASSINOSTEROID UPREGULATED1 ()和BU1-LIKE 1 COMPLEX1啟動子結(jié)合, 從而抑制水稻葉枕細胞伸長, 限制葉枕的大小, 誘導(dǎo)葉片直立。位點8候選基因編碼類似14-3-3蛋白, 是植物初級代謝和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子, 參與油菜素內(nèi)酯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[41]。位點11候選基因, 編碼生長調(diào)節(jié)因子(GRF-transcription factor 2, GRF2), 是一種轉(zhuǎn)錄激活因子, 通過控制細胞增殖來調(diào)節(jié)分生組織功能[42]。在擬南芥葉片形態(tài)建成中, 由miR396介導(dǎo)的生長調(diào)節(jié)因子(AtGRFs)調(diào)控葉片近-遠軸向的細胞極性分化[42]。位點12候選基因編碼一種B3轉(zhuǎn)錄因子, 調(diào)節(jié)BR合成途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達[2,43]。最近Tian等[2]發(fā)現(xiàn)玉米2號染色體上的B3轉(zhuǎn)錄因子(ABI3-VP1-transcription factor 12)基因(即)激活下游基因的表達, 從而提高葉枕內(nèi)源BR水平, 影響葉枕細胞的增殖, 導(dǎo)致葉夾角增大。位點14候選基因編碼一種含鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。Wang等[44]研究表明, 水稻中基因編碼一種鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白, 負調(diào)控BR信號。抑制內(nèi)源基因表達, 會導(dǎo)致水稻葉片和分蘗角顯著增加, 株高降低, 從而降低產(chǎn)量。

葉枕部位近軸面和遠軸面細胞分裂的不平衡也可調(diào)控葉向值。位點2是本研究發(fā)現(xiàn)的最重要位點, 其候選基因功能注釋具有細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinase, CDK)活性。該蛋白激酶是細胞周期調(diào)控機制的核心, 細胞周期蛋白(cyclin)依次激活相應(yīng)的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK), 推動細胞跨越細胞周期各時相轉(zhuǎn)換的限制點, 是推動細胞周期運行的動力因素[45]。其水稻同源基因()是一種與Cyclin-D3-1類似的細胞周期蛋白。水稻細胞周期蛋白可通過控制遠軸面厚壁組織細胞增殖, 正向調(diào)控葉片的直立性, 已被前人證實[46]。因此, 有必要進一步精細定位并圖位克隆該位點的功能基因。位點3的候選基因, 同樣具有調(diào)節(jié)細胞分裂和細胞周期的蛋白酶活性。其水稻同源基因()也是一種細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶。位點7候選基因為編碼一種細胞周期類似蛋白。位點10候選基因編碼NLP轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明, 在缺氮條件下類似NIN蛋白轉(zhuǎn)錄因子(NLP轉(zhuǎn)錄因子)與Teostine branched1/cycloidea/proliferating cell factor (TCP20)相互作用, 調(diào)控細胞周期蛋白基因[47]。位點15候選基因編碼一種TCP轉(zhuǎn)錄因子。TCP蛋白是植物特有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。在玉米中有兩個TCP家族的基因被較深入研究。一個是(branch angle deffective 1)編碼TCPⅡ類基因, 通過促進細胞增殖影響側(cè)枝角度的出現(xiàn), 并影響花序結(jié)構(gòu)[48]。另一個是玉米馴化基因(teosinte branched 1), 可抑制側(cè)枝的生長和發(fā)育,基因突變體導(dǎo)致玉米側(cè)枝的增加[49]。

葉枕部位機械支撐也是調(diào)控葉向值的重要機制。位點4的候選基因編碼果膠酯酶, 參與果膠分解代謝過程和細胞壁修飾等生物過程。果膠是植物細胞壁的重要組成之一, 與植物組織結(jié)構(gòu)形成等生物過程密切相關(guān)。果膠酯酶對細胞壁的降解[50]和果實軟化[51]具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn), 葉枕部位細胞壁機械強度降低, 葉夾角增大[52]。位點13候選基因參與細胞壁果膠代謝生物過程, 可能影響機械強度或者細胞擴展[53]來調(diào)控葉向值。

位點9候選基因編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子, 該類型轉(zhuǎn)錄因子對番茄葉發(fā)育具有重要作用[54], 其調(diào)控玉米葉向值的機理還需進一步研究。

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)15個與葉向值顯著關(guān)聯(lián)(<4.05E-5)的位點, 發(fā)掘出15個候選基因, 其中1.07 bin是最重要位點, 其候選基因有待進一步利用圖位克隆技術(shù)和CRISPR/Cas9基因敲除等技術(shù)驗證。

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Genome-wide association studies of leaf orientation value in maize

PENG Bo1,**, ZHAO Xiao-Lei1,**, WANG Yi1,**, YUAN Wen-Ya1, LI Chun-Hui2, LI Yong-Xiang2, ZHANG Deng-Feng2, SHI Yun-Su2, SONG Yan-Chun2, WANG Tian-Yu2,*, and LI Yu2,*

1Tianjin Crop Research Institute / Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Tianjin 300384, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Leaf orientation value is a comprehensive index reflecting the two characteristics of “straight” and “vertical” of leaves. The varieties with high leaf orientation value have straight and not curved leaves, and small angle, which are conducive to the wind ventilation and light transmission for maize population. When the planting density is high, it is easier to obtain high yield than the expanded plant-type. It is of great significance for molecular design breeding of ideal plant type to clarify the genetic basis of leaf orientation value. In this study, 285 diverse lines genotyped by the MaizeSNP50 chip were evaluated for leaf orientation in 2017 and 2018. The genome-wide association analysis (GWAS) were used to identified the SNPs, which were significant association with leaf orientation values. The analysis of variance showed that the significant variations were observed for leaf orientation value of different inbred lines (< 0.01). In the selection of the optimal model, it was found that the Q + K model was the most suitable for the leaf orientation association analysis in this study. A total of 15 loci (< 4.05E-5) were detected by GWAS, including 27 SNPs, explaining 5.54%–8.73% of phenotypic variation, and 15 candidate genes were mined in two years. Among them, site 2 in 1.07 bin was an important site found in this study, and its candidate gene might beencoding cyclin dependent protein kinase, which needed to be further confirmed by map-based cloning.

maize; leaf orientation value; leaf angle; single nucleotide polymorphism; association analysis

10.3724/SP.J.1006.2020.93063

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31601308), 青年科研人員創(chuàng)新研究與實驗項目(2018004), 天津市自然科學(xué)基金項目(19JCZDJC34500)和天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項目(17007)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601308), the Innovative Research and Experiment Project for Young Researchers (2018004), the Tianjin Natural Science Foundation (19JCZDJC34500), and the President’s Fund of Tianjin Academy of Agricultural Sciences (17007).

王天宇, E-mail: wangtianyu@caas.cn; 黎裕, E-mail: liyu03@caas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

彭勃, E-mail: snbopeng@163.com

2019-12-03;

2020-01-15;

2020-02-17.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200215.2228.006.html