甘蔗Rieske Fe/S蛋白前體基因ScPetC的克隆及表達(dá)分析

鄭清雷 余陳靜 姚坤存 黃 寧 闕友雄,4 凌 輝許莉萍,4,*

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前體基因的克隆及表達(dá)分析

鄭清雷1余陳靜1姚坤存1黃 寧1闕友雄1,4凌 輝2,3,*許莉萍1,4,*

1福建農(nóng)林大學(xué)/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002;2福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建福州 350002;3玉林師范學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 廣西玉林 537000;4福建農(nóng)林大學(xué)/ 教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

細(xì)胞色素bf復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體(Cytochrome bfcomplex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由細(xì)胞核基因編碼的蛋白, 其成熟蛋白參與構(gòu)成細(xì)胞色素bf復(fù)合體, 是電子傳遞的重要元件。基于前期構(gòu)建的受高粱花葉病毒(, SrMV)侵染的甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫, 從主栽甘蔗品種‘新臺(tái)糖22號(hào)’葉片中成功克隆到該基因, 并命名為(GenBank登錄號(hào)為MH333037.1)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),基因cDNA全長(zhǎng)824 bp, 包含了一個(gè)678 bp的開放閱讀框, 編碼226個(gè)氨基酸。ScPetC屬于PRK13473超家族, 其C末端具有典型的Rieske保守結(jié)構(gòu)域; 蛋白理論等電點(diǎn)為8.19, 屬于穩(wěn)定的、親水性蛋白; 二級(jí)結(jié)構(gòu)多為無規(guī)則卷曲, 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其比其他植物PetC多出一段α螺旋結(jié)構(gòu)。在本氏煙()葉片瞬時(shí)表達(dá)中, ScPetC定位于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。盡管前人研究表明,的表達(dá)量會(huì)受SrMV侵染的影響, 不同于半夏() PetC與大豆花葉病毒(, SMV) P1蛋白之間的互作, ScPetC不能與SrMV-P1蛋白互作, 但能與甘蔗黃葉病毒(, SCYLV) P0蛋白互作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,基因在甘蔗不同組織中均有表達(dá), 但在葉片中的表達(dá)量最高。甘蔗受脫落酸脅迫3 h時(shí),表達(dá)量顯著上調(diào), 但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng), 表達(dá)受到抑制; 在茉莉酸甲酯、水楊酸、氯化銅、氯化鎘和氯化鈉脅迫下,表達(dá)量均顯著下調(diào)。本研究通過對(duì)ScPetC生物學(xué)功能、環(huán)境外源激素與重金屬等脅迫下的表達(dá)模式及其與甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究, 增加了對(duì)甘蔗PetC的了解, 也為深入研究其在甘蔗受黃葉病毒侵染中的作用奠定基礎(chǔ)。

甘蔗; 細(xì)胞色素bf復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體; 生物信息學(xué); 亞細(xì)胞定位; 蛋白互作; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

甘蔗(spp. hybrids)是最重要的糖料作物和重要的能源作物[1]。甘蔗花葉病和黃葉病是甘蔗生產(chǎn)上最主要的2種病毒性病害, 嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量[2-4]。感染花葉病的甘蔗葉片會(huì)出現(xiàn)黃綠相間的嵌紋、條斑等癥狀, 嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致葉片失綠[2]。高粱花葉病毒(, SrMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬(), 是引起甘蔗花葉的主要原因之一[5]。甘蔗黃葉病毒(, SCYLV)屬馬鈴薯卷葉病毒屬(), 甘蔗感染后也會(huì)出現(xiàn)失綠癥狀[3], 但其典型癥狀是葉片的中脈發(fā)黃[3]。研究這2種病毒與宿主甘蔗基因的互作機(jī)制對(duì)甘蔗抗病育種具有重要意義。

一般而言, 植物RNA病毒的基因組具有多個(gè)開放讀碼框(open reading frame, ORF), 它們編碼的蛋白控制著病毒侵染植物過程中的不同機(jī)制, 但不同的病毒之間也存在一些功能相似的蛋白。P1和P0蛋白分別是SrMV和SCYLV基因編碼的首個(gè)蛋白, 并且都參與病毒—寄主互作以及病毒抑制宿主免疫反應(yīng)[6-11]。前人通過對(duì)馬鈴薯Y病毒屬的李痘病毒(, PPV) P1蛋白進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)此蛋白并沒有直接的沉默抑制效應(yīng), 但可以通過自身剪切, 與HC-Pro配合行使沉默抑制功能[8-9]; 同屬的黃瓜脈黃病毒 (, CVYV) P1蛋白中的P1a前導(dǎo)蛋白對(duì)控制病毒特異性識(shí)別寄主具有重要作用[8]。在對(duì)植物致病方面, 當(dāng)從PPV基因組中移除編碼P1蛋白的區(qū)域后, 受PPV侵染的本氏煙()葉片壞死和萎縮癥狀加深[9]; 相反地, 當(dāng)馬鈴薯卷葉病毒屬的甘蔗黃葉病毒P0蛋白缺失N端的15個(gè)氨基酸后, 該蛋白則會(huì)丟失對(duì)植物的致病性[10]。另外, 也有報(bào)道稱其同屬的甜菜西黃病毒(, BWYV) P0區(qū)域能轉(zhuǎn)錄出一個(gè)參與病毒和寄主相互識(shí)別作用的蛋白[11]。

葉綠體是高等植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所。一方面, 對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用; 另一方面, 也成為自身健康生長(zhǎng)的隱患[12-13]。當(dāng)植物感染病毒后, 會(huì)利用葉綠體進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)繁, 破壞葉綠體相關(guān)的結(jié)構(gòu)原件, 影響光系統(tǒng)、電子傳遞鏈等過程, 最終影響植物正常生長(zhǎng)[13]。截至目前, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)植物葉綠體蛋白會(huì)同病毒蛋白互作并參與病毒侵染過程, 洋蔥1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基(Rubisco large subunit, RbcL)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(Rubisco small subunit, RbcS)都能與馬鈴薯Y病毒屬的青蔥黃條病毒 (, SYSV)、蕪菁花葉病毒(, TuMV)、大豆花葉病毒(, SMV) P3蛋白互作, 參與葉片失綠癥狀的形成[14]。甘蔗花葉病毒(, SCMV)的VPg會(huì)和甘蔗NAD(P)H脫氫酶復(fù)合體O亞基在葉綠體內(nèi)發(fā)生互作, 阻礙電子循環(huán), 影響葉綠體的形成, 最終導(dǎo)致花葉病癥[15]。半夏()中的細(xì)胞色素bf復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體(Cytochrome bfcomplex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)會(huì)和大豆花葉病毒(, SMV)P1蛋白發(fā)生互作, 引起寄主對(duì)病毒的適應(yīng)性改變[16]。在馬鈴薯卷葉病毒屬病毒蛋白的研究中, 擬南芥S-相激酶相關(guān)蛋白(S-phase kinaserelated protein 1, AtASK1)能與甜菜西黃病毒(, BWYV)、南瓜蚜傳黃化病毒(, CABYV)的P0蛋白發(fā)生互作, 降低植物對(duì)病毒的抵抗能力; 敲除本氏煙草內(nèi)擬南芥同源基因后, 感病本氏煙恢復(fù)對(duì)病毒的抵抗; 同時(shí), 在突變P0氨基酸序列中最保守的F基序后, P0丟失了沉默抑制功能, 并且不再與AtASK1互作[17]。本氏煙草1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基裝配因子2 (Rubisco Assembly Factor 2, RAF2)會(huì)與蕓薹黃化病毒(, BrYV)的P0蛋白互作, 并協(xié)助病毒進(jìn)行侵染[18]。

植物的光合電子鏈主要由PSII (光反應(yīng)系統(tǒng)II)、質(zhì)體醌(plastoquinone, PQ)、細(xì)胞色素bf復(fù)合體(cytochromebfcomplex, Cytbf)、質(zhì)藍(lán)素(plastocyanin, PC)、PSI (光反應(yīng)系統(tǒng)I)和鐵氧還原蛋白組成; 電子傳遞方式主要分為非環(huán)式電子傳遞、環(huán)式電子傳遞和假環(huán)式傳遞3種。在這3種電子傳遞過程中, Cytbf皆有參與[19]。Cytbf復(fù)合體包含4個(gè)大亞基 (細(xì)胞色素、細(xì)胞色素b、Fe/S蛋白和亞基IV)和4個(gè)小亞基 (PetG、PetI、PetM和PetN)[20]。自從Rieske等人在線粒體細(xì)胞色素bc中發(fā)現(xiàn)大量攜帶有[2Fe-2S]結(jié)合域的蛋白之后, 這類蛋白就被大家稱為Rieske蛋白[21-22]?，F(xiàn)已從菠菜()[23]、豌豆()[24]等植物細(xì)胞色素bf復(fù)合體中分離到Rieske Fe/S蛋白, 并且了解到該蛋白是由細(xì)胞核基因編碼[25], 在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成蛋白前體, 由N端信號(hào)肽引導(dǎo)至葉綠體基質(zhì), 后被加工成成熟蛋白, 結(jié)合到類囊體膜上[26-27], 與細(xì)胞色素、細(xì)胞色素b和亞基IV共同裝配成葉綠體細(xì)胞色素bf復(fù)合體, 參與光合電子傳遞過程[28-30]。在轉(zhuǎn)入基因的水稻()[31]和擬南芥()[32]的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), PetC成熟蛋白在葉片內(nèi)富集會(huì)提高光合系統(tǒng)電子傳遞量, 從而提高產(chǎn)量。西瓜在強(qiáng)光干旱脅迫下通過轉(zhuǎn)變PetC蛋白翻譯后修飾模式, 穩(wěn)定此蛋白的表達(dá)量, 維持電子傳遞量, 進(jìn)而緩解脅迫對(duì)植物的危害[33]。

時(shí)至今日, 越來越多植物中編碼PetC的基因被克隆出來[31-34], 并發(fā)現(xiàn)它會(huì)響應(yīng)強(qiáng)光[33]、模擬干旱[34]等非生物脅迫。不僅如此, 植物在響應(yīng)生物脅迫方面也有報(bào)道, 在感染了白粉病菌()的小麥()表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags, EST)的表達(dá)文庫中, 編碼PetC的基因出現(xiàn)了差異表達(dá)[35]。課題組[36]前期在黑穗病菌()侵染甘蔗黑穗病易感與抗性品種后, 質(zhì)譜分析結(jié)果顯示, 甘蔗高感品種Ya71-374中PetC相對(duì)于高抗品種NCo376中的表達(dá)量增加。Ling等[37]利用RNA定量的方法對(duì)感染SrMV甘蔗葉片進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示在抗性品種YZ01-1314中下調(diào)表達(dá), 在易感品種ROC22、FN40中上調(diào)表達(dá)。雖然編碼ScPetC成熟蛋白的序列已經(jīng)被克隆出來并被命名為[34], 但與此不同的是, 本研究中克隆到的是甘蔗細(xì)胞色素bf復(fù)合體鐵硫亞基蛋白前體基因。通過在本氏煙葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá), 我們觀察了ScPetC亞細(xì)胞定位情況, 并利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證該蛋白與SrMV-P1蛋白、SCYLV-P0蛋白的互作情況, 研究結(jié)果對(duì)深入了解PetC如何參與病毒引起甘蔗葉片變黃癥狀奠定一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理方法

供試甘蔗基因型為我國(guó)主栽品種新臺(tái)糖22號(hào), 由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

RT-PCR克隆材料: 取植株的+1葉(第1片可見肥厚帶的葉片), 用錫紙包好, 液氮速凍, 保存于-80℃冰箱。

組織特異性分析材料: 參照黃寧等[38]方法, 從田間選取健康長(zhǎng)勢(shì)一致的植株9株, 清理根部泥土, 取白色幼根作為材料; 從地面以上可見完整第1節(jié)間算起, 選取第7~8節(jié)段, 用75%酒精擦拭表皮, 從側(cè)芽、蔗皮、蔗髓取樣; 葉片選取甘蔗+1葉。以上樣品均選擇3株混合作為一個(gè)重復(fù), 共3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 用錫箔紙包好所有材料, 立刻投入液氮速凍, 保存于-80℃冰箱。

不同外源脅迫處理材料: 考慮到植物會(huì)釋放內(nèi)源激素來抵抗病毒的侵染[13], 因此我們用不同外源脅迫處理甘蔗的方法來模擬病毒侵染。參照蘇亞春等[39]方法, 在田間隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株, 將其蔗莖砍成單芽莖段、洗凈, 放在含有100 mg L-1多菌靈(福瑞得, 中國(guó)鄭州)水溶液中進(jìn)行52℃溫浴脫毒30 min, 然后將這些莖段種在無菌土中(16 h光/ 8 h暗, 28℃)培養(yǎng), 直至長(zhǎng)出蔗苗, 切下蔗苗用于無菌苗的誘導(dǎo)生根。隨后放入蒸餾水中培養(yǎng)一段時(shí)間待其生長(zhǎng)穩(wěn)定, 從中挑選一部分健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的蔗苗, 置于250 mmol L-1氯化鈉(sodium chloride, NaCl)、100 mmol L-1氯化銅(copper chloride, CuCl2)、500 mmol L-1氯化鎘(cadmium chloride, CdCl2)的水溶液中培養(yǎng), 并于0、6、12、24 h取樣; 取另一部分蔗苗在100 μmol L-1脫落酸(abscisic acid, ABA)、5 mmol L-1水楊酸 (salicylic acid, SA) (含0.01%吐溫-20, v/v)和25 mmol L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmine, MeJA)(含0.01%吐溫-20, v/v)水溶液中培養(yǎng), 并于0、3、6、12 h取樣, 每個(gè)處理選擇3株混合作為1個(gè)重復(fù), 共取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品取樣完成、液氮速凍, 保存于-80℃冰箱。

1.2 RNA提取與cDNA的合成

采用TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, USA)試劑提取所有甘蔗樣品的總RNA, 提取方法參照Liu等[40], cDNA第一鏈合成方法參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Lithuania, Vilnius)和PrimerScript RT-PCR Kit (Takara, 中國(guó)大連)試劑盒說明書。

1.3 甘蔗ScPetC基因序列獲取與RT-PCR克隆

基于課題組構(gòu)建的感染SrMV葉片的甘蔗轉(zhuǎn)錄組uingene注釋庫, 挖掘得到基因unigene序列(轉(zhuǎn)錄本ID: T2_Unigene_BMK.38583), 并根據(jù)其序列設(shè)計(jì)克隆特異性引物-F/R (表1), 以甘蔗葉片cDNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 4 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 60 s, 40個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min; 隨后進(jìn)行回收、純化、測(cè)序與鑒定。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ExPaSy、Prabi、SWISSMODEL在線軟件, 對(duì)ScPetC進(jìn)行一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 使用NCBI conserved domains、SignalP 4.1 Server、TMHMM 2.0 Server、ProtScale和WoLFPSORT, 分別進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、疏水性和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 在線軟件網(wǎng)址如表2所示。使用DNAMAN 6.0將基因編碼的氨基酸序列與NCBI下載的來自其他植物的PetC的氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)。參考Schmidt等[41]的方法, 使用MEGA 6.0軟件對(duì)ScPetC、其他高等植物PetC和細(xì)胞色素bcRieske Fe/S蛋白、藍(lán)藻細(xì)菌細(xì)胞色素bfRieske Fe/S蛋白和細(xì)菌細(xì)胞色素Rieske Fe/S蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。通過MEME對(duì)植物氨基酸進(jìn)行motif (基序)預(yù)測(cè), 在Adobe Photoshop CS6上進(jìn)行圖片美化。

表1 引物序列及用途

表2 生物信息學(xué)研究的數(shù)據(jù)庫和軟件

1.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

以pMD19-、pMD19-、pMD19-(課題組前期實(shí)驗(yàn)獲得)質(zhì)粒為模板, 以-AD-F/R、-BK-F/R、-BK-F/ R (表1)為引物, 通過PCR、膠回收獲得基因編碼序列。隨后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit (諾唯贊, 中國(guó)南京)同源重組的方法, 將基因編碼序列導(dǎo)入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶RI和HI (Thermo Scientific, Lithuania, Vilnius)雙酶切的pGADT7、pGBKT7載體中, 構(gòu)建載體pGADT7-pGBKT7、pGBKT7-。測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒以共轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞(上海維地, 中國(guó)上海)。實(shí)驗(yàn)參照Matchmaker Gold酵母雙雜交系統(tǒng)說明書, 在SDO (SD/-Trp)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行毒性驗(yàn)證, 在SDO (SD/-Trp/X-α-Gal/AbA)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行自激活驗(yàn)證, 在QDO (SD/-Ade/-His/ Leu/-Trp/X-α-Gal)和QDO/X/A (SD/-Ade/-His/Leu/- Trp/X-α-Gal/AbA)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行互作驗(yàn)證。

1.6 植物表達(dá)載體構(gòu)建

以攜帶有、、基因的相關(guān)質(zhì)粒為模板, 用引物-YN-F/R、- YC-F/R、-YC-F/R (表1)進(jìn)行PCR、膠回收獲得基因編碼序列。隨后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組的方法, 將基因編碼序列導(dǎo)入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶I和I、I和I雙酶切的pCAMBIA1300S-YN、pCAMBIA2300S- YC[42]載體中, 構(gòu)建載體pCAMBIA1300S-YN-、pCAMBIA2300S-YC-、pCAMBIA2300S- YC-用于雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn) (Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)。

以pMD19-T-陽性質(zhì)粒為模板, 使用引物-Subloc-F/R (表1)進(jìn)行PCR、膠回收獲得基因編碼序列。隨后使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組的方法, 將基因編碼序列導(dǎo)入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶I和HI雙酶切的pCAMBIA2300-YFP載體中, 構(gòu)建載體pCAMBIA2300--YFP用于蛋白亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。

1.7 本氏煙草葉片注射與熒光觀察

將pCAMBIA1300S-YN-、pCAMBIA 2300S-YC、pCAMBIA2300S-YC-和pCAMBIA 2300--YFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101 (上海唯地, 中國(guó)上海), 在含有35 μg mL-1利福平和50 μg mL-1卡納霉素的YPD液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁后, 收集農(nóng)桿菌菌體, 用MS鹽緩沖液懸浮, 并將菌體懸浮液OD600調(diào)至0.8。加入乙酰丁香酮(工作濃度200 μmol L-1), 28℃避光誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h, 隨后注射本氏煙葉片下表皮, 于48 h后在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8, 曼海姆, 德國(guó))下拍攝YFP熒光(激發(fā)光波長(zhǎng)514 nm, 捕獲波長(zhǎng)為530~590 nm)、葉綠體自發(fā)熒光(激發(fā)光波長(zhǎng)552 nm, 捕獲波長(zhǎng)為650~680 nm)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性定量引物-QF/QR (表1), 以clathrin adaptor complex ()和cullin ()作為內(nèi)參基因[43]。參照SYBR Green PCR Master Mix (Roche, 中國(guó)上海)試劑盒說明書配制定量反應(yīng)體系, 進(jìn)行定量PCR, 以檢測(cè)目的基因在甘蔗的不同組織(根、芽、葉、蔗髓和蔗皮)和不同外源脅迫(SA、MeJA、ABA、NaCl、CuCl2和CdCl2)處理樣品中的相對(duì)表達(dá)量。定量PCR程序?yàn)?0℃ 2 min; 95℃預(yù)變性10 min, 95℃變性15 s, 60℃退火延伸1 min, 40個(gè)循環(huán); 增加熔解曲線, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s, 60℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù), 陰性對(duì)照以無菌水為模板, 定量數(shù)據(jù)采用2–DDCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用DPS 7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析, Original 8.0軟件做柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ScPetC基因克隆及生物信息學(xué)分析

采用基于SrMV侵染甘蔗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基因Unigene序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物, 以葉片cDNA為模板, 擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)824 bp的片段 (圖1-A)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序, 獲得基因序列。經(jīng)過ORF Finder在線分析,基因的完整開放讀碼框?yàn)?78 bp, 編碼225個(gè)氨基酸。與基因(GenBank登錄號(hào)為JQ712582)進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 核酸相似度達(dá)到73.87%,在5￠端比多129個(gè)堿基, 在3￠端比少了97個(gè)堿基, 但不影響蛋白編碼。氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示, 2條基因編碼的氨基酸序列相似度為84.44% (圖1-B), 經(jīng)過進(jìn)一步的分析, ScPetC氨基酸鏈的N端比SoCYT多出33個(gè)氨基酸殘基, 并且2條鏈中的第47個(gè)(丙氨酸A~纈氨酸V)、第70個(gè)(絲氨酸S~甘氨酸G)氨基酸不同。綜上結(jié)果表明, 克隆自現(xiàn)代雜交種的與成熟蛋白基因的編碼序列和蛋白序列高度保守, 僅存在個(gè)別位點(diǎn)的差異。

圖1 甘蔗ScPetC基因的RT-PCR擴(kuò)增及其編碼氨基酸序列

(A) M: marker 100 bp; I: RT-PCR產(chǎn)物。(B): 甘蔗細(xì)胞色素bf復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體序列;: 甘蔗細(xì)胞色素bf復(fù)合體鐵硫亞基氨基酸序列[34]。

(A) M: DNA marker 100 bp; I: RT-PCR product. (B): Sugarcane cytochromebfcomplex reduced iron-sulfur protein precursor sequence;: Sugarcane cytochromebfcomplex iron-sulfur subunit amino acid sequence[34].

利用ExPaSy在線軟件對(duì)ScPetC一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果顯示該蛋白分子式為C1054H1668N294O315S11, 相對(duì)分子量為23.85 kD, 疏水性平均值為-0.146, 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為21.61, 等電點(diǎn)為8.19 (表3)。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)小于40, 等電點(diǎn)大于7.5, 表明該蛋白為穩(wěn)定的堿性蛋白; 通過SignaIP 4.1 server、TMHMM 2.0 Server和NCBI conserved domains軟件對(duì)ScPetC結(jié)構(gòu)域或基序進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果表明該蛋白無信號(hào)肽(圖2-A), 為非分泌蛋白, 并且在第66個(gè)到第88個(gè)氨基酸之間存在一個(gè)跨膜區(qū)域(圖2-B), 屬于PRK13474超家族(圖2-C)。因此推測(cè)ScPetC是一個(gè)堿性穩(wěn)定親水非分泌蛋白。

表3 ScPetC一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

圖2 甘蔗ScPetC的生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

A: 信號(hào)肽; B: 跨膜結(jié)構(gòu)域; C: 保守結(jié)構(gòu)域。

A: signal peptide; B: transmembrane domain; C: conservative domain.

ScPetC的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲的氨基酸殘基數(shù)分別為42、49和134個(gè), 占比分別為18.67%、21.78%和59.56%。

根據(jù)SWISSMODEL三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 比較甘蔗與單子葉植物水稻、雙子葉植物半夏和菠菜PetC三維空間結(jié)構(gòu) (圖3), 甘蔗ScPetC構(gòu)象與其他3種植物空間構(gòu)象基本相似, 都具有N末端α螺旋結(jié)構(gòu)和[2Fe-2S]結(jié)合域, 但甘蔗該蛋白的構(gòu)象中多出了一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)(圖3-A)。

圖3甘蔗、水稻、半夏和菠菜的PetC成熟蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

黃色箭頭處為PetC蛋白的[2Fe-2S]結(jié)合域; 藍(lán)色和紅色箭頭所指位點(diǎn)為氨基酸鏈的N端和C端; 綠色箭頭所指位點(diǎn)為α螺旋。圖A中白色箭頭表示ScPetC與其他植物PetC的差異α螺旋所在位置。

Yellow arrow is the conservative binding domain [2Fe-2S] of PetC; blue and red arrows represent the N-terminus and C-terminus of the amino acid chain; green arrows represent α helix. White arrow represents the α helix in sugarcane that is different from other plants of tertiary structure in figure A.

根據(jù)WoLFPSORT對(duì)ScPetC氨基酸序列的掃描結(jié)果, 了解到該蛋白定位于甘蔗細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的可能性由大到小, 分別為葉綠體類囊體(65.7%)、線粒體(15.38%)、細(xì)胞質(zhì)(13.29%)、細(xì)胞核(11.59%)、液泡(11.01%)和葉綠體基質(zhì)(8.95%)。因此, 本研究推測(cè)ScPetC最有可能定位于葉綠體類囊體。

2.2 甘蔗ScPetC的保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化

對(duì)比甘蔗與其他植物PetC氨基酸序列(圖4), 發(fā)現(xiàn)甘蔗與高粱()、水稻、半夏、本氏煙、菠菜和豌豆的PetC序列相似度分別是97.35%、84.14%、70.74%、68.87%、66.95%和64.38%。這7種植物的PetC序列中均含有N末端的轉(zhuǎn)移多肽區(qū)域、跨膜α螺旋區(qū)域、結(jié)合[2Fe-2S]的Rieske區(qū)域和靠近C末端的脯氨酸環(huán)區(qū)域(圖4)。

將甘蔗與27個(gè)其他物種PetC的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示, 所有物種的PetC可以被劃分為細(xì)胞色素bc復(fù)合體和細(xì)胞色素bf復(fù)合體2個(gè)亞類。在細(xì)胞色素bf復(fù)合體亞類中, 不同物種的PetC可以被分為5組(I、II、III、IV、V), 其中甘蔗與高粱的PetC聚為一個(gè)分支, 表明其親緣關(guān)系較近。細(xì)胞色素bc復(fù)合體亞類中, 不同物種的PetC可以被分為2組(VI、VII)。MEME軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, ScPetC和其他高等植物細(xì)胞色素bf復(fù)合體PetC一樣具有6個(gè)motif。綜上, 本研究推測(cè)ScPetC也可能與其他植物PetC具有相似的功能。

圖4 甘蔗ScPetC與其他植物PetC氨基酸序列對(duì)比

紅色方框表示ScPetC內(nèi)為已報(bào)道保守氨基酸基序。CAM57108: 半夏; XP_015647138: 水稻; XP_002441121: 高粱; P08980: 菠菜; P26291: 豌豆; CAA45705: 本氏煙。

Red squares indicate the reported conserved motif of amino acid regions within the ScPetC. CAM57108:; XP_015647138:; XP_002441121:; P08980:; P26291:; CAA45705:.

2.3 甘蔗ScPetC的亞細(xì)胞定位

由圖6可知, 對(duì)照組中YFP黃色熒光信號(hào)在本氏煙葉表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有分布; ScPetC-YFP融合蛋白的黃色熒光信號(hào)既定位于質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì), 又與葉綠體的自熒光信號(hào)重合, 顯示出橙色, 表明ScPetC定位于葉綠體(圖6)。

2.4 甘蔗ScPetC與病毒蛋白的互作

酵母雙雜交互作實(shí)驗(yàn)中, 分別導(dǎo)入以下質(zhì)粒組合pGADT7-T+pGBKT7-Lam、pGADT7-T+pGBKT7- 53、pGADT7-+pGBKT7-、pGADT7-+ pGBKT7-、pGADT7-+pGBKT7、pGADT7+ pGBKT7-、pGADT7+pGBKT7-到Y(jié)2Hgolden菌株中, 它們均能在DDO (SD/-Leu/-Trp)固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng), 說明質(zhì)粒組合成功轉(zhuǎn)入酵母感受細(xì)胞。同時(shí), 在QDO (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal)和QDO/X/A (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)固體培養(yǎng)基上, 陽性對(duì)照能正常生長(zhǎng)并在加入X-α-Gal后表現(xiàn)出藍(lán)色, 陰性對(duì)照不能正常生長(zhǎng), pGADT7+pGBKT7-不能在酵母缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(圖7-A), 而pGADT7-+pGBKT7-能在缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并且在加入X-α-Gal后成功顯色, 說明ScPetC與SrMV-P1蛋白不存在互作, 與SCYLV-P0蛋白存在互作(圖7-B)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證互作結(jié)果, 本研究將基因構(gòu)入pCAMBIA1300S-YN載體, 形成YN-ScPetC; SCYLV-P0基因構(gòu)入pCAMBIA2300S-YC載體, 形成YC-P0; 結(jié)果在注射YN-ScPetC和YC-P0的本氏煙葉片細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了黃色熒光(圖7-C)。酵母互作和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致, 說明ScPetC和SCYLV-P0確實(shí)存在互作。

圖5 甘蔗ScPetC與其他物種PetC的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析與motif預(yù)測(cè)

圖中進(jìn)化樹橘色部分代表細(xì)胞色素bf復(fù)合體類, 藍(lán)色部分代表細(xì)胞色素bc復(fù)合體類; III組中的紅色圓圈標(biāo)記為ScPetC; 不同顏色的方框代表不同的組(I、II、III、IV、V、VI、VII)。NP_001237648.2: 大豆; XP_015647138.1: 水稻; XP_0202013301.1: 小麥; Q9ZR03.1: 擬南芥; P26291: 豌豆; AAD55565.1: 團(tuán)藻; CAA27194: 類紅球細(xì)菌; CAA45705: 本氏煙; CAA70823: 席藻; CAB72244: 魚腥藻; CAM57108.1: 半夏; CAM57109.1: 馬蹄蓮; O49078: 貝母; P05417: 脫氮副球菌; P08067: 釀酒酵母; P08980: 菠菜; P14698: 藍(lán)藻; P23136: 深紅紅螺菌; P26290: 集胞藻; P26291: 豌豆; P26292: 聚球藻; P37841: 馬鈴薯; P49728: 衣藻; Q9ZR03: 擬南芥; XP_002441121: 高粱; ACG28308: 玉米; XP_004951312: 小米。

The orange part of the phylogenetic tree represents the cytochromebfcomplex cluster, the blue part represents the cytochrome bccomplex cluster; the red cycle is labeled as ScPetC; the different color boxes in the figure represent different groups (I, II, III, IV, V, VI, VII). NP_001237648.2:; XP_015647138.1:; XP_0202013301.1:; Q9ZR03.1:; P26291:; AAD55565.1:; CAA27194:; CAA45705:; CAA70823:; CAB72244:; CAM57108.1:; CAM57109.1:; O49078:; P05417:; P08067:; P08980:; P14698:spPCC; P23136:; P26290:sp.PCC; P26291:; P26292:sp. PCC; P37841:; P49728:; Q9ZR03:; XP_002441121:; ACG28308:; XP_004951312:. motif 1: X6NAXCTHLGCVVPX3ENKFXCPCHGSX10GPAP; motif 2: NLX11PDX3RX3NLX22PX3GX3GXXAKGXXGNDX6LX7LXXGLKGDPTYX2V; motif 3: X7WXETDFRTX3PWW; motif 4: XGDX3GWFCPCHGSHYDX2GRIRXGPAPXNLX15; motif 5: X7MX4DX2AX5VX7GX6WXGKPVFXRXRX4IX5VX4LXDX10; motif 6: X2AXSIX ADXV; motif 7: XWLX3GXCTHLGCX; motif 8: X9QLX10; motif 9: LVVEXDXT; motif 10: FX5FX3DDSSX2RSXSPSLXSXFLX3RGFS SNSVSPAHX2GLVXDLPXTVAAIKNPXSKIVYDX2NHERYPPGDPSKRAFAYFVLTGGRFVY.

(圖6)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)及空載體在本氏煙葉片瞬時(shí)表達(dá)48 h后的亞細(xì)胞定位結(jié)果; 本氏煙葉片表皮細(xì)胞被用于明場(chǎng)、黃色熒光、葉綠體自發(fā)熒光、明場(chǎng)和黃色及紅色熒光疊加后的圖像分析; 藍(lán)色箭頭1、2分別表示細(xì)胞核、質(zhì)膜; 紅色虛線框表示被放大區(qū)域; 比例尺=50 μm; 35S::YFP: 攜帶空載pCAMBIA2300-YFP的農(nóng)桿菌菌株; 35S:: ScPetC::YFP: 攜帶重組載體pCAMBIA2300--YFP的農(nóng)桿菌菌株。

Subcellular localizations of themediated transformation ofand empty vector inleaves after 48 h infiltration; the epidermal cells ofwere used for taking images of visible light, yellow fluorescence, chloroplast autofluorescence, and merged visible light. Blue arrows 1 and 2 indicate nucleus and plasma membrane. The area in the red rectangle is magnified. Bar=50mm; 35S::YFP: thestrain carrying the empty vector pCAMBIA2300-YFP; 35S:: ScPetC::YFP: thestrain carrying the recombinant vector pCAMBIA2300--YFP.

圖7 甘蔗ScPetC與高粱花葉病毒和甘蔗黃葉病毒蛋白的互作實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

A: 甘蔗ScPetC與SrMV-P1蛋白的酵母雙雜交互作驗(yàn)證。B: 甘蔗ScPetC與SCYLV-P0蛋白的酵母雙雜交互作驗(yàn)證; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp: 腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal: 腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基(添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷); SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA: 腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸和色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基(添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷和金擔(dān)子素A)。C: ScPetC與SCYLV-P0蛋白的雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn); YC、YN、YN-ScPetC和YC-P0分別代表質(zhì)粒pCAMBIA2300S-YC、pCAMBIA2300S-YN、pCAMBIA2300S-YN-和pCAMBIA2300S-YC-[42]。

A: ScPetC was verified by yeast double-hybrid interaction with SrMV-P1 protein. B: ScPetC was verified by yeast double-hybrid interaction with SCYLV-P0 protein; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp: synthetic dropout medium plate without adenine, histidine, leucine, tryptophan; SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal: synthetic dropout medium plate without adenine, histidine, leucine, tryptophan (plus 5-bromo-4-chloro-3- indoxyl-α-D-galactopyranoside); SD/-Ade/-His/Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA: synthetic dropout medium plate without adenine, histidine, leucine, tryptophan (plus 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside and aureobasidin A). C: the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay of the interaction between ScPetC andSCYLV-P0 protein; YC, YN, YN-ScPetC, YC-P0 represent the plasmids pCAMBIA2300S-YC, pCAMBIA2300S-YN, pCAMBIA2300S-YN-, pCAMBIA2300S-YC-, respectively[42].

2.5 甘蔗ScPetC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式分析

由圖8-A可知,基因在甘蔗葉片中的表達(dá)量最高, 其次是蔗皮、蔗芽和蔗髓, 在根中幾乎不表達(dá)。分析結(jié)果顯示, 該基因在葉片中的表達(dá)量分別是蔗髓、蔗芽、蔗皮和根部表達(dá)量的15、15、4和174倍, 說明該基因在葉綠體和線粒體豐富的細(xì)胞中均有表達(dá)。

分析基因在不同外源脅迫下的表達(dá)特性, 結(jié)果表明在對(duì)甘蔗施以CuCl2、CdCl2和NaCl處理后,的表達(dá)量下降并顯著低于對(duì)照(圖8-B); 用SA、MeJA處理甘蔗后,表達(dá)量隨著施用時(shí)間延長(zhǎng), 持續(xù)下降; 甘蔗在受ABA處理3 h后,的表達(dá)量顯著提高并達(dá)到峰值, 為對(duì)照組的1.3倍, 當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到6 h時(shí), 表達(dá)量下降但仍高于對(duì)照, 處理達(dá)到12 h時(shí), 表達(dá)量下降并顯著低于對(duì)照(圖8-C)。我們推測(cè)該基因可以在短時(shí)間內(nèi)積極響應(yīng)ABA的脅迫。

圖8 甘蔗ScPetC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式分析

A: 甘蔗基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)情況; B和C: 甘蔗基因在不同外源脅迫下的相對(duì)表達(dá)情況。不同的小寫字母(a、b、c、d)表示差異顯著性(≤ 0.05); 誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。

A: the tissure-specific expression analysis ofgene in sugarcane; B and C: relative expression ofin sugarcane under different exogenous stresses. Bars with different superscripts (a, b, c, d) represent differ significantly (≤ 0.05) and error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

3 討論

植物受到病毒侵染時(shí), 會(huì)通過改變體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)量來抵抗病毒侵染。葉綠體作為植物重要的細(xì)胞器, 其中的基因與蛋白也會(huì)參與到病毒抵御過程[13]。到目前為止, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)葉綠體蛋白能參與到病毒的復(fù)制、移動(dòng)、致病等過程中[13]。ScPetC成熟蛋白是植物細(xì)胞色素bf復(fù)合體的元件之一, 在葉綠體光合電子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要的作用[20], 但是關(guān)于植物ScPetC與病毒蛋白互作研究仍比較少見, 截至目前只有兩例, 一例是半夏PetC與馬鈴薯Y病毒屬SMV-P1蛋白互作[16]; 另一例是擬南芥PetC與馬鈴薯Y病毒屬TuMV-HC-Pro蛋白互作[44]。本研究是首次報(bào)道ScPetC與馬鈴薯卷葉病毒屬SCYLV- P0蛋白互作。

ScPetC屬于PRK13474超家族, 包含由半胱氨酸和組氨酸組成的(CTHXXC, CPCHXX) Rieske結(jié)構(gòu)域 (圖4)。這個(gè)結(jié)構(gòu)域位于氨基酸鏈的C端附近, 是Rieske家族蛋白主要特征[41]。高等植物Rieske蛋白主要被分為兩類, 分別是細(xì)胞色素bf復(fù)合體類和細(xì)胞色素bc復(fù)合體類。本研究中ScPetC屬于細(xì)胞色素bf復(fù)合體類, 其N端存在一個(gè)由33個(gè)氨基酸組成的區(qū)域, 在梁潘霞等[34]克隆到的基因編碼氨基酸鏈中并不存在。通過與其他植物PetC氨基酸序列比對(duì)后, 認(rèn)識(shí)到這段氨基酸是轉(zhuǎn)移多肽區(qū)域, 其中的保守序列與前人研究結(jié)果相一致[23-24], 因此我們確定克隆到的是甘蔗葉綠體細(xì)胞色素bf復(fù)合體Rieske Fe/S蛋白前體基因。生物信息學(xué)分析顯示, ScPetC為堿性蛋白, 不同于基因所編碼蛋白質(zhì)pI值小于7的結(jié)果[34], 其主要原因是N端轉(zhuǎn)移多肽區(qū)內(nèi)存在多個(gè)堿性氨基酸引起ScPetC整體平均pI值大于7。使用SWISSMODEL對(duì)ScPetC進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 其結(jié)果表明其與擬南芥PetC成熟蛋白在三維結(jié)構(gòu)上極為相似[44], 說明植物PetC蛋白在結(jié)構(gòu)上極為保守, 極可能行使高度保守的生物學(xué)功能。經(jīng)過仔細(xì)比對(duì)觀察, 發(fā)現(xiàn)ScPetC三級(jí)結(jié)構(gòu)組成是從第55個(gè)纈氨酸V開始, N端轉(zhuǎn)移多肽不在ScPetC成熟蛋白的三維構(gòu)象中。另外, 在甘蔗與其他植物PetC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)比結(jié)果中, 我們發(fā)現(xiàn)ScPetC多出一段α螺旋結(jié)構(gòu)(圖3-A), 這或許是ScPetC和SrMV-P1蛋白之間不存在互作的原因, 這與半夏PetC蛋白和SMV-P1蛋白互作的結(jié)果有所不同[16]。從所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中, 我們發(fā)現(xiàn)甘蔗和高粱的PetC蛋白被聚為一簇, 表明其親緣關(guān)系最近, 這和前人研究結(jié)果一致[34]。有研究表明, 植物PetC一共有5個(gè)外顯子保守區(qū)域[25], 本研究結(jié)果顯示, ScPetC有6個(gè)motif, 包含了上述的5個(gè)保守區(qū)域。因此, 可以推測(cè)ScPetC與其他植物PetC具有相似的功能。

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能與其在細(xì)胞中的定位密切相關(guān)。本研究對(duì)ScPetC亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果顯示, 此蛋白定位在葉綠體類囊體的概率最大為65.70%, 細(xì)胞質(zhì)的概率為13.29%, 葉綠體基質(zhì)的概率為8.95%。在本氏煙葉片中的亞細(xì)胞定位分析表明, ScPetC定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和葉綠體, 這與擬南芥PetC融合GFP熒光標(biāo)簽在本氏煙葉片細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位結(jié)果相似[44]。課題組前期在SrMV侵染甘蔗的轉(zhuǎn)錄組研究中, 發(fā)現(xiàn)基因發(fā)生了差異表達(dá), 且在抗感品種中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[37]。前人研究表明半夏PetC和馬鈴薯Y病毒屬SMV-P1蛋白存在互作[16]。但酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, SrMV-P1蛋白和ScPetC不存在互作, 因此, 我們比對(duì)了SrMV和SMV的P1蛋白氨基酸序列, 發(fā)現(xiàn)相似性只有9.25%; 半夏和甘蔗的PetC蛋白之間相似率為70.74% (圖1-B), 我們推測(cè)是序列上的差異導(dǎo)致馬鈴薯Y病毒屬病毒的P1蛋白不能與其寄主PetC蛋白互作, 這種互作可能只存在某些物種之中, 因而基因在宿主受到SrMV侵染時(shí)所發(fā)生的差異表達(dá)可能是其他未知機(jī)制引起的。與此同時(shí), 酵母雙雜交和BiFC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, ScPetC與SCYLV-P0蛋白互作發(fā)生在細(xì)胞膜周和細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 這和擬南芥PetC蛋白與TuMV-HC-Pro蛋白存在互作的結(jié)果相一致[44]。PetC蛋白是由核基因編碼的, 在細(xì)胞質(zhì)中形成蛋白前體, 然后被引導(dǎo)到葉綠體內(nèi), 經(jīng)過加工后的成熟蛋白鉚在類囊體膜上, 參與Cyt bf的形成。因此, 推測(cè)SCYLV-P0與ScPetC在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生互作, 可能阻斷了ScPetC由細(xì)胞質(zhì)向葉綠體運(yùn)輸?shù)倪^程, 影響了Cyt bf正常組裝, 破壞光合電子傳遞過程, 從而引起了甘蔗葉片變黃等癥狀。另外, SCYLV-P0蛋白和馬鈴薯Y病毒屬病毒HC-Pro蛋白都具有沉默抑制的功能[10, 44], 但ScPetC是否參與P0蛋白沉默抑制作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

在轉(zhuǎn)基因融合GUS標(biāo)簽的擬南芥中,基因在葉片、莖、花、莢均有表達(dá), 在根中卻沒有表達(dá)[25]。甘蔗組織表達(dá)定量結(jié)果顯示,在根中的表達(dá)量相對(duì)于蔗芽、蔗髓、蔗皮、葉片表現(xiàn)很低; 相反地, 其在葉中表達(dá)量最高。該基因之所以會(huì)在蔗芽、蔗髓、蔗皮等組織中有少量表達(dá), 可能因?yàn)槭羌?xì)胞核基因, 普遍存在于植物不同組織細(xì)胞中。課題組前期對(duì)感染SrMV的甘蔗易感和抗性品種進(jìn)行了RNA-seq和qRT-PCR定量相關(guān)實(shí)驗(yàn), 結(jié)果表明基因在SrMV易感品種ROC22和FN40中上調(diào)表達(dá), 在抗性品種YZ01-1413中下調(diào)表達(dá)[37]。由于沒有找到SCYLV侵染甘蔗的中間載體, 也無法通過人工對(duì)甘蔗實(shí)現(xiàn)該病毒的接種, 因此并沒有相關(guān)材料。但相關(guān)研究表明, SA或MeJa信號(hào)通路與病毒侵染相關(guān)[13], 因此我們用SA或MeJa模擬病毒等生物脅迫侵染。截至目前, 植物中的基因在ABA、MeJA、SA等激素處理?xiàng)l件的定量表達(dá)分析尚無人報(bào)道。ABA是響應(yīng)干旱、鹽脅迫等非生物的關(guān)鍵調(diào)控因子[45]。在本研究中, 發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的ABA處理可以引起基因上調(diào)表達(dá)。推測(cè)其原因是: 在施加ABA后, 甘蔗葉片缺水、細(xì)胞滲透壓變化, 引起光合效率降低, 植物為了補(bǔ)償光合作用而上調(diào)表達(dá)光合組分基因, 但長(zhǎng)時(shí)間的高表達(dá)對(duì)植物造成負(fù)擔(dān), 于是降低基因表達(dá)量以適應(yīng)低光合作用。SA、JA作為植物系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISP)的重要信號(hào)分子[46]。SA、MeJA處理甘蔗后,基因下調(diào)表達(dá), 說明在植物受生物脅迫過程中, 植物可能通過抑制的表達(dá), 降低光合作用。用CuCl2、CdCl2溶液處理后, 甘蔗因受到重金屬離子的毒害作用,下調(diào)表達(dá)。NaCl處理?xiàng)l件下,基因的表達(dá)量下降, 這與黃瓜幼苗在NaCl脅迫下, 葉片中的基因的下調(diào)表達(dá)結(jié)果相似, 這同樣可能是由于高鹽環(huán)境的刺激引起了甘蔗葉片氣孔閉合, CO2吸收量下降, 光合電子傳遞速率降低[47]。

4 結(jié)論

從甘蔗主栽品種新臺(tái)糖22號(hào)葉片中成功分離到基因, 該基因長(zhǎng)824 bp, 包含一個(gè)678 bp的ORF, 編碼226個(gè)氨基酸, 含有半胱氨酸和組氨酸[2Fe-2S]結(jié)合域, 屬于PRK13474超家族。ScPetC為堿性穩(wěn)定親水非分泌蛋白, 其二級(jí)結(jié)構(gòu)只有α螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲; 從ScPetC的序列、三維結(jié)構(gòu)推測(cè), PetC蛋白在植物中高度保守, 具有相似的生物學(xué)功能。ScPetC定位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞膜, 與SrMV-P1蛋白不存在互作, 但與SCYLV-P0蛋白存在互作。基因在甘蔗葉片中的表達(dá)量最高, 在蔗肉、蔗芽、蔗皮表達(dá)量較低, 在根中幾乎不表達(dá)。在外源激素SA和MeJA、重金屬 (CuCl2、CdCl2)和高鹽(NaCl)溶液處理下, 均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá); 但短時(shí)間ABA處理, 可以引起基因的上調(diào)表達(dá)。

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Cloning and expression analysis of sugarcane Fe/S precursor protein gene

ZHENG Qing-Lei1, YU Chen-Jing1, YAO Kun-Cun1, HUANG Ning1, QUE You-Xiong1,4, LING Hui2,3,*, and XU Li-Ping1,4,*

1Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture and Rural Area / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;3College of Crop Science, Yulin Normal University, Yulin 537000, Guangxi, China;4Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding and Comprehensive Utilization, Ministry of Education / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Cytochrome bf complex Rieske Fe/S precursor protein (PetC) is encoded by the nucleargene, and its mature protein involved in the formation of the cytochromebfcomplex, which is important for electron transfer. Based on our previous transcriptome data of sugarcane (spp. hybrids) infectedby(SrMV), a cytochrome bf complex reduced iron-sulfur precursor protein gene was cloned from leaves of sugarcane superior elite cultivar ‘ROC22’, and named as(GenBank accession number: MH333037.1). Bioinformatics analysis showed that thegene was 824 bp in length, containing a 678 bp open reading frame (ORF), and encoding a peptide of 226 amino acids. ScPetC belongs to the PRK13473 superfamily and has a typical Rieske domain at its C-terminus of the amino acid chain. ScPetC is a stable and hydrophilic protein with pI 8.19. Most of the secondary structural elements in ScPetC were random coil. Compared to the PetC from the other plants, ScPetC contained one more fragment of helix in its third dimensional structure. The transient expression of YFP-fused protein inleaves showed that ScPetC was located in the chloroplast, cytoplasm and cell membrane. Although the previous study indicated that the expression ofwas affected by SrMVinfection in sugarcane, different to the interaction betweenPetC and SMV-P1, without interaction between ScPetC and the SrMV-P1, it did interact with SCYLV-P0, i.e. the P0 protein of(SCYLV). Real-time quantitative PCR analysis showed thatgene was expressed constitutively in different tissues of sugarcane, and the highest level of its expression was found in leaves. When sugarcane plant was exposed to abscisic acid stress for 3 h, the expression ofwas significantly up-regulated, but the expression level was then inhibited with longer treatment time. Under the stress of methyl jasmine, salicylic acid, copper chloride, cadmium chloride and sodium chloride, the expression ofwas significantly down-regulated. The study on biological function, expression pattern and interaction of ScPetC with the proteins of sugarcane pathogenic virus will improve the understanding of the happening of yellow leaf symptom, which caused by SCYLV.

sugarcane; cytochrome bf complex Rieske Fe/S precursor protein; bioinformatics; subcellular location; protein interaction; real-time flourescent quantitative PCR

10.3724/SP.J.1006.2020.94171

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31801424)和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-17)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31801424) and the China Agriculture Research System (CARS-17).

許莉萍, E-mail:xlpmail@126.com; 凌輝, E-mail: linghuich@163.com

E-mail: zhengqinglei1666@163.com.

2019-11-10;

2020-01-15;

(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2020-02-17.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200215.1522.002.html