不同分子量殼聚糖對大鼠肝臟止血和生物相容性的影響

陳晶晶 竺靜

摘要 [目的]探究殼聚糖的分子量對其止血和生物相容性方面的影響。[方法]選取分子量約1萬、5萬、10萬Da的殼聚糖（脫乙酰度>90%）為研究對象，建立大鼠肝創(chuàng)面模型，進(jìn)行肝組織HE染色、PCNA免疫組化試驗和掃描電鏡觀察。[結(jié)果]殼聚糖各組止血的時間比模型對照組明顯縮短且組織粘連程度輕（P<0.05），分子量對殼聚糖止血時間和減輕粘連方面影響差別不顯著（P>0.05）。殼聚糖各組均能引起肝細(xì)胞水腫，其中，分子量5萬Da組影響程度最小，分子量1萬Da組最大。分子量5萬Da殼聚糖組肝細(xì)胞增殖活躍且電鏡下肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓清晰，細(xì)胞核完整，細(xì)胞器良好;分子量10萬Da組殼聚糖肝細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞核有變性、損傷;分子量1萬Da殼聚糖組增生活躍、輪廓大體清楚，線粒體水腫嚴(yán)重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和斷裂。[結(jié)論]分子量5萬Da殼聚糖對大鼠肝臟組織止血效果和生物相容性較好。

關(guān)鍵詞 殼聚糖;分子量;生物相容性;止血;大鼠肝臟

Abstract [Objective] The research aimed to explore the effect of molecular weight of chitosan on hemostasis and biocompatibility.[Method] Chitosan （deacetylation degree > 90%） with a molecular weight of about 10 000，50 000，100 000 Da was selected to establish a rat model of liver wound，HE staining，PCNA immunohistochemistry and SEM observation of liver tissue were carried out.[Result]The hemostasis time of each group was significantly shorter than that of the model control group （P<0.05），the molecular weight had no significant effect on hemostasis time and adhesion reduction of chitosan （P>0.05）.Among them，the effect of molecular weight 50 000 Da group was the least，and that of molecular weight 10 000 Da group was the most serious.Under the electron microscope，the hepatocytes of chitosan group with a molecular weight of about 50 000 Da proliferated actively，and the outline of the structure of hepatocytes was clear，the nucleus was complete，the organelles were good，the outline of the hepatocytes of chitosan group with a molecular weight of 100 000 Da was fuzzy，the nucleus was denatured and damaged，the proliferation of chitosan group with a molecular weight of 10 000 Da was active，the outline was generally clear，the mitochondria were seriously swollen，the endoplasmic reticulum was expanded and broken.[Conclusion]The chitosan group with a molecular weight of 50 000 Da is ideal for hemostasis and compatibility of liver tissue in rat.

Key words Chitosan; Molecular weight;Biocompatibility; Hemostasis;Rat liver

殼聚糖（chitosan，CTS），化學(xué)名稱為 β-（l，4）-2- 乙酰氨基 -2- 脫氧 -D-葡聚糖，是一種來源于蝦、蟹殼的天然有機(jī)高分子多糖，具有良好的生物相容性和物理化學(xué)特性，并具有抗炎、抑菌、促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)、減少瘢痕增生等生物活性[1-5]，是由甲殼素（化學(xué)式N-乙酰-2-氨基-2-脫氧葡聚糖）在堿性條件下部分脫乙?；蟮玫剿崛苄晕镔|(zhì)。通常，乙?；摱却笥?0%的甲殼素，被稱之為殼聚糖，或者說能在 1%乙酸或 1%鹽酸中溶解 1%的脫乙酰甲殼素，稱之為殼聚糖[6-7]。殼聚糖可以在體內(nèi)降解，首次可降解成寡聚糖，進(jìn)一步水解，通過代謝轉(zhuǎn)化成糖蛋白，以不同方式代謝并排泄[8-9]，因此殼聚糖對人體無毒，相對安全，用途廣泛。食品方面如食品保鮮、食用膜及增稠劑等方面有大量研究[10-12]。在生化、生物醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用取得重大進(jìn)展，殼聚糖具有良好抗菌性、抗腫瘤活性，可用于促進(jìn)傷口愈合、預(yù)防腦血管疾病[13]。殼聚糖具有生物相容性和止血作用，多用于止血材料的應(yīng)用和研究[14-16]。目前認(rèn)為殼聚糖的止血原理是血液中帶負(fù)電荷的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等與其相結(jié)合，形成細(xì)胞栓子或凝血栓產(chǎn)生凝血作用相關(guān)[17-21]。而分子量、脫乙酰度和外觀形態(tài)是影響殼聚糖止血效果和生物相容性的主要因素[22]，李訓(xùn)虎等[23]研究指出殼聚糖的分子量差異對體外培養(yǎng)Hela細(xì)胞生長有影響。目前有關(guān)殼聚糖的分子量差異對體內(nèi)組織的研究報道不多，筆者通過研究3種不同分子量殼聚糖（脫乙酰度>90%）在大鼠體內(nèi)對肝細(xì)胞的影響，來評價分子量差異對殼聚糖的止血性能和生物組織相容性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 殼聚糖粉（脫乙酰度>90%），安徽博美生物科技有限公司;戊巴比妥鈉，上海榕柏生物技術(shù)有限公司;成年健康SD大鼠，重190～210 g，60只， 雌雄不限 ，廣東維伯鑫生物科技有限公司（SCXK（粵）2016-0041）; PCNA試劑盒，武漢純度生物有限公司;電子天平，德國Sartorius 公司。

1.2 試驗方法 將SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組15只，A組為模型對照組，B組為分子量10萬Da殼聚糖組;C組為分子量5萬Da殼聚糖組，D組為分子量1萬Da殼聚糖組。

1.2.1 肝創(chuàng)面模型建立和止血時間測定[24]。將各組大鼠用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射、麻醉、固定、消毒，沿腹中線剪開皮膚，逐層進(jìn)入腹腔，充分暴露肝臟中葉。用無菌紗布吸凈周圍的腹腔液，在肝中葉遠(yuǎn)端，切取一長1 cm的切口。利用無菌紗布擦拭血液，B～D 組大鼠取等量殼聚糖粉（200 mg）進(jìn)行切口撒粉止血，A組不做止血處理，分別觀察和記錄止血時間。出血停止后，縫合，飼養(yǎng)。

1.2.2 材料代謝及組織形態(tài)學(xué)試驗[25]。術(shù)后1周、2周、3周、4周、6周，每組取3只大鼠，3%戊巴比妥鈉注射致死，沿原切口打開腹腔，觀察肝創(chuàng)面切口的愈合情況、局部反應(yīng)及材料的代謝吸收情況。4周時取肝創(chuàng)面標(biāo)本，戊二醛固定，依次用酒精梯度脫水，石蠟固定，切片，厚度為1 μm，做 HE染色。按上述方法進(jìn)行取材、固定、脫水，石蠟固定，切片，用大鼠抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）進(jìn)行免疫組織染色，觀察新生的肝細(xì)胞情況。同時取肝創(chuàng)面組織，用戊二醛固定、干燥、樣品裝臺，使用掃描透射電子顯微鏡觀察肝組織細(xì)胞微觀情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著性水平設(shè)置為P<0.05，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 止血時間測定

根據(jù)大鼠止血時間測定得知，各組大鼠處理后，A組大鼠肝臟切口未做任何處理，創(chuàng)面止血時間較長，時間長達(dá)（258.5±1.2）s，縫合處理后，還有少量血液流出。B～D組，出血時間之間差異不顯著，但與A組相比，止血時間明顯縮短（P<0.05）。切口撒上殼聚糖粉后，粉末很快凝集，逐漸形成凝膠狀堵塞出血口，血液慢慢停止流動。

2.2 術(shù)后各組大鼠腹腔觀察

術(shù)后觀察，A組：腹腔內(nèi)，1～6周不同程度的粘連，大鼠肝臟與附近的器官粘連一起，不易分開。B～D組：1～6周腹腔粘連相對較輕，較容易與周圍粘連臟器分開，創(chuàng)面的愈合良好，隨著時間推移，炎癥反應(yīng)逐漸減輕，4周無明顯炎癥，6周恢復(fù)正常組織狀態(tài);1～4周，殼聚糖粉吸收情況觀察，D組>C組>B組;6周，B組有少量殘留，C、D組基本吸收完全。

2.3 HE染色 從A～D組大鼠術(shù)后4周肝臟HE染色后肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)（圖1）可以看出，A組肝細(xì)胞基本完整，局部有壞死，有炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞有水腫;B組肝細(xì)胞水腫，炎性細(xì)胞浸潤，新生肝細(xì)胞較少;C組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，有新生肝細(xì)胞，輕度水腫;D組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤，水腫程度重。

2.4 免疫組化

從A～D組大鼠術(shù)后4周采用PNCA免疫組化后高倍鏡觀察情況（圖2）可以看出，A組，新生肝細(xì)胞較少，局部壞死細(xì)胞較多;B組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，局部變性，炎性細(xì)胞浸潤，局部有壞死病灶，肝細(xì)胞水腫;C組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞輕度水腫;D組新生肝細(xì)胞較多，局部有水腫。

2.5 透鏡觀察 從圖3可看出，

A組，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓清晰，完整，細(xì)胞核圓形，有肝細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核萎縮現(xiàn)象和消失，正常肝細(xì)胞核內(nèi)染色均勻，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體分布均勻、豐富。B組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)大體輪廓清楚，水腫、壞死，細(xì)胞核圓形或橢圓形，有變形或破損、濃縮，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，細(xì)胞質(zhì)器官分布不均，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。C組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)大體輪廓清晰，肝細(xì)胞水腫較輕，細(xì)胞核圓形、橢圓形，染色均勻，無破損，細(xì)胞基本分布均勻，線粒體輕度水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，核糖體增加。D組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)大體輪廓模糊，細(xì)胞之間界限不清晰，細(xì)胞核圓形，無破損，核內(nèi)物質(zhì)均勻，細(xì)胞器腫脹明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)增，出現(xiàn)斷裂，不連續(xù)現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

該試驗通過創(chuàng)建鼠肝臟模型，觀察肝臟組織HE染色、PCNA免疫組化和電鏡變化，探究1萬、5萬、10萬分子量的殼聚糖對肝組織的影響。在肝臟創(chuàng)面止血過程中發(fā)現(xiàn)，殼聚糖粉末撒在各組創(chuàng)面?zhèn)诤?，粉末立即溶于血液，凝集成半凝膠狀，止血時間明顯縮短。關(guān)于殼聚糖的止血原理尚未明確定論，國外早期研究者Davle、Ratnof、Macfadane 在1964年提出了血液凝固的瀑布機(jī)制，他認(rèn)為殼聚糖的凝血主要是通過激活外源性凝血途徑實(shí)現(xiàn)的，對補(bǔ)體系統(tǒng)旁路途徑基本上沒有激活作用，糖鏈上的氨基在凝血過程中同樣也起了重要作用，另外殼聚糖吸取血液形成膜狀，能吸附大量的血清蛋白促進(jìn)止血[26]。

余雪松等[27]研究認(rèn)為殼聚糖粉末能夠迅速吸收血液中水分，膨脹，稱水凝狀，阻塞出血點(diǎn)，另外血液中凝集因子濃度增加，啟動內(nèi)源性凝血因子，加速凝血。何靜等[28]研究指出殼聚糖游離的氨基引起內(nèi)源性止血途徑的激活，同時引起血小板聚集活化及紅細(xì)胞的激活。另有研究認(rèn)為殼聚糖的凝血機(jī)制與自身攜帶正電荷有關(guān)[29]，殼聚糖是一種堿性多糖，主要是由葡萄糖胺聚合而成，具有2個主要的活性基團(tuán)（-NH2和-OH），與細(xì)胞黏附和生長的影響較大可能是殼聚糖的氨基（-NH2）基團(tuán)。殼聚糖含有大量自由的氨基 （-NH2），這些氨基可以轉(zhuǎn)化成陽離子（-NH3+），因此，殼聚糖可以通過電荷作用吸附表面帶負(fù)電荷的白細(xì)胞、紅細(xì)胞，從而增強(qiáng)了殼聚糖與細(xì)胞的黏附作用。

觀察各組大鼠術(shù)后腹腔，均出現(xiàn)不同程度的粘連，模型對照組程度最重，殼聚糖各組較輕，說明殼聚糖能夠減輕組織粘連。防止組織粘連可能是因為殼聚糖能夠選擇性促進(jìn)組織細(xì)胞生長且能抑制纖維細(xì)胞增生，抑制膠原纖維分泌形成疤痕組織，減少組織粘連。殼聚糖通過局部止血，抑制纖維蛋白束形成，從而減少了因血腫機(jī)化吸收造成的組織粘連。粉末通過吸水膨脹于周圍，阻止組織粘連發(fā)生。綜合因素作用下有效減輕組織的粘連[30-31]。大體觀察殼聚糖各組粘連情況區(qū)別不大，分子量并不是殼聚糖減輕組織粘連作用的主要因素。

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