燈誘草地貪夜蛾的識(shí)別鑒定及交配狀態(tài)分析

龔建福 武晴雯 王攀

摘要 [目的]明確誘蟲燈能否有效地監(jiān)測(cè)與防治草地貪夜蛾以及燈誘草地貪夜蛾的交配狀態(tài)。[方法]從玉米田中燈誘得到疑似草地貪夜蛾成蟲，對(duì)其進(jìn)行生殖系統(tǒng)解剖與分子鑒定，明確其生物型、性別、交配及產(chǎn)卵狀態(tài)。[結(jié)果]誘蟲燈共誘捕到43頭疑似草地貪夜蛾，經(jīng)分子鑒定，確定其中40頭是草地貪夜蛾;燈誘草地貪夜蛾中，雌蟲全部已交配，占總數(shù)的62.5%，其中已產(chǎn)卵雌蟲占總雌蟲的88%，單燈平均每晚誘捕已產(chǎn)卵雌蟲5.3頭，交配未產(chǎn)卵雌蟲為1頭。[結(jié)論]草地貪夜蛾具有趨光性，可使用燈光誘控技術(shù)對(duì)草地貪夜蛾進(jìn)行監(jiān)測(cè)或防控;燈誘草地貪夜蛾雌蟲中，大部分都已交配產(chǎn)卵。

關(guān)鍵詞 草地貪夜蛾;燈光誘控;形態(tài)識(shí)別;分子鑒定;交配狀態(tài)

Abstract [Objective]To clarify whether the light trap can effectively monitor and control Spodoptera frugiperda and analyze the mating state of the moth captured by light trap.[Method]The suspected adult of S.frugiperda were captured by light trap in the corn field，and analysis of anatomy of reproductive system and molecule information of the suspected moth were followed then，so that determining biotype identity，sex，mating and spawning status.[Result]The trap light captured a total of 43 suspected S.frugiperda，after molecular identification，it was determined that 40 of them were S.frugiperda.Among the S.frugiperda captured by light trap，the females all had mated，accounting for 62.5% of the total，and most of them had laid eggs，accounting for 88% of the total females，and there were 5.3 produced females and only 1 unfertilized females was trapped per night averagely.[Conclusion]This study states that the moth has phototropism and it can be monitored or controlled by light trap and most of the females had laid eggs.

Key words Spodoptera frugiperda;Light trap;Morphological identification;Molecular identification;Mating status

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （Smith）也稱秋黏蟲，屬鱗翅目夜蛾科，廣泛分布于美洲大陸，是一種為害嚴(yán)重的雜食性農(nóng)業(yè)害蟲，有“玉米型”和“水稻型”2個(gè)生物型[1]。近年來，草地貪夜蛾的擴(kuò)散范圍與速率逐漸增大，2018年5月草地貪夜蛾入侵南亞的印度，隨后向周邊國家蔓延[2-3]，2019年1月11日在我國云南省普洱市首次發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾[4]。草地貪夜蛾具有繁殖力高、遷飛能力強(qiáng)及暴發(fā)為害等特點(diǎn)，對(duì)我國的糧食作物安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。

草地貪夜蛾入侵我國后，國內(nèi)專家在其遷飛擴(kuò)散、鑒定識(shí)別、監(jiān)測(cè)防控等方面迅速開展了大量工作[5-7]。研究表明，可應(yīng)用黑光燈及性引誘劑來監(jiān)測(cè)草地貪夜蛾成蟲發(fā)生動(dòng)態(tài)[8];提出了可以通過種植抗性或耐受性的玉米品種，利用天敵以及使用生物農(nóng)藥，使用誘蟲燈誘殺等防控草地貪夜蛾[9]。燈光誘控技術(shù)具有使用方便、效果明顯、易于大規(guī)模推廣應(yīng)用等特點(diǎn)，被廣泛用于很多農(nóng)林害蟲的防治和種群監(jiān)測(cè)[10]。截至目前，國內(nèi)外對(duì)利用燈光誘控來防治與監(jiān)測(cè)草地貪夜蛾的研究不足，國內(nèi)雖提出使用誘蟲燈防控草地貪夜蛾，但燈光誘控草地貪夜蛾如何識(shí)別，燈光誘控技術(shù)能否應(yīng)用于草地貪夜蛾的監(jiān)測(cè)與防控，尚需進(jìn)一步明確。

筆者利用試制的誘蟲燈田間誘捕得到草地貪夜蛾成蟲，室內(nèi)基于COⅠ和Tpi? 2個(gè)基因片段對(duì)其進(jìn)一步分子鑒定和解剖觀察其交配狀態(tài)，為明確燈光誘控在草地貪夜蛾監(jiān)測(cè)與防治中的作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和方法 試驗(yàn)在湖北省武漢市農(nóng)科院蔬菜研究所的甜玉米地（114.47°E、30.71°N）進(jìn)行，面積約3 000 m2，玉米苗株高40 cm左右。2019年9月3日調(diào)查發(fā)現(xiàn)，玉米田中有草地貪夜蛾卵塊，設(shè)置試制誘蟲燈（功率為15 W）誘集草地貪夜蛾成蟲，誘蟲燈集蟲口與地面距離約1 m，燈周圍100 m內(nèi)無高大建筑遮擋與大功率照明光源。2019年9月5—9日連續(xù)開燈進(jìn)行草地貪夜蛾誘捕試驗(yàn)，試驗(yàn)期間天氣晴朗無風(fēng)，開燈時(shí)間為19：00至次日07：00。

1.2 草地貪夜蛾形態(tài)學(xué)鑒定 通常，燈誘鱗翅目昆蟲鱗粉多已掉落，難以通過前翅準(zhǔn)確鑒定。依據(jù)趙勝園等[11]和郭井菲等[12]報(bào)道的草地貪夜蛾形態(tài)特征，觀察誘集成蟲的個(gè)體大小、后翅顏色與頂角處灰色斑紋及延伸位置（圖1），對(duì)燈誘草地貪夜蛾進(jìn)行鑒定。

1.3 性別及雌蟲交配產(chǎn)卵狀態(tài) 對(duì)燈誘疑似草地貪夜蛾進(jìn)行解剖，根據(jù)生殖系統(tǒng)差異判別雌雄后，參考趙勝園等[13]的研究方法，通過雌蛾交配囊狀態(tài)判定其交配產(chǎn)卵情況。然后，將單頭樣品迅速裝入2 mL離心管，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于種類及生物型的分子鑒定。

1.4 種類及生物型鑒定 研究表明，基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome coxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因序列分析可以準(zhǔn)確鑒定草地貪夜蛾，以及位于Z染色體上的磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因（triosephosphate isomerase，Tpi）可以鑒定其生物型[14-15]，故利用COⅠ基因和Tpi基因?qū)Σ莸刎澮苟赀M(jìn)行分子鑒定。樣品DNA的提取使用DNA試劑盒Animal Tissue DNA Kit（Simgen，中國），按照說明書進(jìn)行操作。將得到的DNA產(chǎn)物作為PCR擴(kuò)增的模板，參考張磊等[6]的方法分別對(duì)COⅠ基因和Tpi基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列：CoⅠ-F 5′-TTCGAGCTGAATTAGGGACTC-3′，CoⅠ-R 5′-GATGTAAAATATGCTCGTGT-3′;Tpi-F 5′-GGTGAAATCTCCCCTGCTATG-3′，Tpi-R 5′-AATTTTATTACCTGCTGTGG-3′[16]。將PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析 在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載草地貪夜蛾與近緣物種COⅠ基因序列，利用MEGA 7.0進(jìn)行序列比對(duì)與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹鑒定是否為草地貪夜蛾，比較Tpi基因序列的特異性堿基位點(diǎn)的差異，明確草地貪夜蛾“玉米型”和“水稻型”[17]。采用SPSS 21.0 軟件對(duì)每晚誘蟲燈捕獲的草地貪夜蛾雌、雄及已產(chǎn)卵與交配未產(chǎn)卵雌蛾數(shù)量進(jìn)行Student′s t test測(cè)驗(yàn)（*P<0.05，**P<0.01）。

2 結(jié)果 與分析

2.1 燈誘草地貪夜蛾的物種分子鑒定

燈誘共獲得43頭疑似草地貪夜蛾成蟲，依次編號(hào)為Wuhan1～Wuhan 43，并基于COⅠ基因和Tpi基因進(jìn)行分子鑒定。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，COⅠ基因長(zhǎng)度約800 bp，Tpi基因長(zhǎng)度約400 bp，均與預(yù)期片段大小一致（圖2）。通過測(cè)序得到所有樣品COⅠ基因片段和Tpi基因片段的準(zhǔn)確序列，利用序列比對(duì)和從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜集到草地貪夜蛾近緣物種及鱗翅目其他昆蟲的COⅠ序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)Wuhan12、Wuhan15、Wuhan24與其余樣品的COⅠ基因、Tpi基因序列相似度低，BLAST結(jié)果顯示其與斜紋夜蛾親緣最近，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示W(wǎng)uhan12、Wuhan15、Wuhan24與斜紋夜蛾聚為一支，鑒定為斜紋夜蛾，而非草地貪夜蛾。其余40個(gè)樣品的COⅠ基因和Tpi基因的序列與草地貪夜蛾的相似度高達(dá)99%，確定為同一物種，選取樣品Wuhan1作為代表進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，樣品Wuhan1與草地貪夜蛾聚為一支（圖3），表明燈誘所得40個(gè)樣品均為草地貪夜蛾。

2.2 燈誘草地貪夜蛾的生物型鑒定 分別將已確定40個(gè)草地貪夜蛾樣品的Tpi基因序列與已發(fā)表2種生物型的Tpi基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在能夠區(qū)分“水稻型”和“玉米型”的10個(gè)堿基位點(diǎn)中，確定為草地貪夜蛾的40個(gè)樣品與“玉米型”完全一致（圖4），表明燈誘的草地貪夜蛾樣品均為“玉米型”。

2.3 燈誘草地貪夜蛾的性別及交配產(chǎn)卵狀態(tài) 對(duì)分子鑒定確定的40頭燈誘草地貪夜蛾分析表明，雄蟲占37.5%，雌蟲占62.5%，雌蟲全部已交配，其中大部分已產(chǎn)卵，占總雌蟲的88%。單燈每晚平均誘捕草地貪夜蛾10頭，其中，雌蟲6.2頭，雄蟲3.8頭，二者無顯著差異（t=1.109，P=0.348）;單燈每晚平均誘捕已產(chǎn)卵雌蟲5.3頭，交配未產(chǎn)卵雌蟲1頭，二者差異顯著（t=4.490，P=0.021）（圖5）。

3 討論

利用誘蟲燈控制農(nóng)林害蟲高效、環(huán)保，極大地減少了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的施用。草地貪夜蛾成蟲具有較強(qiáng)遠(yuǎn)距離飛行能力，成蟲在產(chǎn)卵前可遷飛500 km[18]。國外利用誘蟲燈研究草地貪夜蛾擴(kuò)散能力的試驗(yàn)表明，誘蟲燈對(duì)草地貪夜蛾成蟲的誘捕率與釋放距離有關(guān)，但總體誘捕效果不佳[19]。與國外研究結(jié)果較為類似，該研究表明誘蟲燈可誘捕到草地貪夜蛾成蟲，但誘捕效率低，每晚單燈誘捕成蟲僅10頭左右;昆蟲的趨光行為受性別、交配行為及發(fā)育階段等因素的影響[20]，該研究誘捕到的草地貪夜蛾雌蛾大部分已交配，推測(cè)草地貪夜蛾的趨光行為與其交配、產(chǎn)卵等生殖行為有關(guān)。因此，燈光誘控技術(shù)對(duì)草地貪夜蛾的監(jiān)測(cè)與防控的效果還需進(jìn)一步探討。

草地貪夜蛾與斜紋夜蛾的形態(tài)與個(gè)體大小十分相似[11]，加之燈誘鱗翅目成蟲鱗粉大部分已掉落，識(shí)別較為困難。該研究在基于后翅形態(tài)鑒別出草地貪夜蛾的基礎(chǔ)上[11-12]，再利用COⅠ基因序列鑒定，發(fā)現(xiàn)形態(tài)鑒定準(zhǔn)確率達(dá)93%，說明草地貪夜蛾后翅特征可用于野外燈光誘捕監(jiān)測(cè)或防控中草地貪夜蛾的識(shí)別，必要時(shí)可再輔助分子鑒定。國內(nèi)報(bào)道，入侵我國的草地貪夜蛾為“玉米型”[6]，該研究燈誘草地貪夜蛾分子鑒定進(jìn)一步說明入侵到我國的草地貪夜蛾為“玉米型”，“水稻型”是否入侵我國，有待進(jìn)一步監(jiān)測(cè)。

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