雞細(xì)小病毒與H9亞型禽流感病毒二重PCR檢測方法的建立

李丹 謝芝勛 李孟

摘要 [目的]建立一種能夠同時診斷雞細(xì)小病毒（chincken parvovirus，ChPV）和H9亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的檢測方法。[方法]根據(jù)GenBank中已發(fā)表的ChPV NS基因、H9亞型AIV HA基因的保守序列，分別設(shè)計多對引物，并通過一系列不同組合對溫度和反應(yīng)體系的調(diào)整試驗，最終篩選出2對最佳特異性引物組合，建立了ChPV和AIV二重PCR檢測方法用于ChPV和H9亞型AIV的檢測。[結(jié)果]特異性和敏感性的試驗結(jié)果表明，建立的二重PCR方法特異性良好，可以在一管PCR反應(yīng)同時檢測ChPV和H9亞型AIV。針對ChPV NS基因和H9亞型AIV HA基因的擴(kuò)增片段大小分別為558和367 bp，其他常見的禽病病原體均未見陽性反應(yīng);該法對ChPV和H9亞型AIV的檢測下限均為5×104拷貝/μL質(zhì)粒;臨床樣品檢測結(jié)果表明，對140份臨床樣品檢測結(jié)果與AIV分離測序及ChPV PCR陽性產(chǎn)物測序結(jié)果完全一致。[結(jié)論]建立的ChPV和H9亞型AIV 二重PCR檢測方法不僅特異性良好，而且檢測的靈敏度高，對ChPV和H9亞型AIV的監(jiān)測及有效防控具有重要意義。

關(guān)鍵詞 雞細(xì)小病毒;H9亞型禽流感病毒;二重PCR

Abstract [Objective] In order to establish a method to simultaneously detect chicken parvovirus （ChPV） and avian influenza virus（AIV）. [Method] Two pairs of specific primers were designed according to the sequences of ChPV NS genes， H9 subtype AIV HA genes which has been published in GenBank. Multiple pairs of primers were designed respectively， and through a series of experiments to adjust the temperature and reaction system of different combinations， the optimal combination of two pairs of specific primers was finally selected， and the duplex PCR detection method of AIV and ChPV was established for the detection of ChPV and H9 subtype AIV. [Result] The results of specificity and sensitivity test showed that the established triple PCR method was specific and good， and could simultaneously detect ChPV and H9 subtype AIV in one tube of PCR reaction. The amplified fragment size of the NS genes sequences of ChPV and HA genes sequences of H9 were 558 and 367 bp.The lower limit of detection for ChPV and H9 subtype AIV was 5×104 copies/μL plasmid.The results of clinical samples test showed that 140 clinical samples were completely consistent with the results of AIV isolation sequencing and ChPV PCR positive products sequencing. [Conclusion] The duplexPCR detection method for ChPV and H9 subtype AIV established in this study has not only good specificity， but also high detection sensitivity， which is of great significance for the monitoring and effective prevention and control of ChPV and H9 subtype AIV.

Key words Chicken parvovirus;H9 subtype avian influenza virus;Duplex PCR

雞細(xì)小病毒是引發(fā)雞群腸道疾病的重要病毒之一，臨床上以腹瀉、呈現(xiàn)精神抑郁和生長遲緩及料肉比增加等為特征[1]。ChPV主要侵害雛雞，造成患病雞腹瀉和發(fā)育不良，在某些雞群中普遍存在，有研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育障礙與矮小綜合征雞群的血清中能檢測出ChPV DNA[2]。流行病學(xué)調(diào)查表明，其在商品肉雞感染率較高，蛋雞或種雞次之[3]。近年來研究表明，ChPV在全球多個國家雞群中普遍存在，且近年相繼在北美的美國和巴西、東歐的波蘭、匈牙利、克羅地亞及亞洲的韓國和我國[4-6]等國家發(fā)現(xiàn)報道。

H9亞型禽流感病毒自1966年在美國被首次發(fā)現(xiàn)，隨后我國廣東地區(qū)也于1994年首次在發(fā)病雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了該亞型AIV[7]。研究表明，H9亞型AIV容易與其他病原（病毒和細(xì)菌等）混合感染，進(jìn)而給我國養(yǎng)禽業(yè)造成更為嚴(yán)重的損失;其與其他不同亞型AIV混合感染時，毒株間容易發(fā)生基因片段重組，并產(chǎn)生一些不可預(yù)知的新型禽流感病毒，進(jìn)而可能引起新型禽流感病毒的大流行。2013年以來的部分報道還表明，其可為H5N6和H7N9等高致病性亞型AIV提供內(nèi)部基因[8-10]。由上述報道可見，H9N2亞型AIV與ChPV都對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。

由于ChPV在正常雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)中難以大量增殖，因此應(yīng)用病毒分離及電鏡觀察等方法對該病進(jìn)行診斷的難度很大。傳統(tǒng)AIV檢測及診斷方法主要包括血清學(xué)鑒定、電鏡觀察和免疫熒光試驗等[11]，這幾種方法各有優(yōu)勢，但都存在檢測時間長、準(zhǔn)確性差和敏感度低等缺點。PCR技術(shù)可以直接檢測組織或培養(yǎng)物中是否存在目標(biāo)病原的核酸，快速且準(zhǔn)確的判斷樣品有無該病原體感染。另外，多重PCR具有同時對多種病原體混合感染進(jìn)行檢測的優(yōu)點，克服了常規(guī)單一PCR需要對混合感染樣品進(jìn)行逐項檢測耗時長的缺點，且經(jīng)過不斷完善和改進(jìn)后，該技術(shù)已被用于多種禽病及其他動物病原混合感染的診斷。為此，該研究根據(jù)ChPV的NS基因及H9亞型AIV HA基因的保守序列，設(shè)計2對針對2種病毒的特異性引物，建立了ChPV與H9亞型AIV二重PCR檢測方法，不僅可以快速準(zhǔn)確的鑒別上述2種不同病原的混合感染，而且為ChPV與H9亞型AIV的有效防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑。PCR儀購自美國Bio-Rad Laboratories公司;超微量分光光度計購自美國Thermo公司;2× PCR Super Mix，DNA/RNA共提試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體和DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;M-MLV、隨機(jī)引物、dNTP及RNA抑制劑購自寶生物（北京）有限公司。其他試劑均購自商業(yè)公司。

1.1.2 毒株。AIV毒株（H3N2、H6N2、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV）均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存;AIV（H7N2）的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈;AIV毒株（H5N1）cDNA 模板均由美國康涅狄格州立大學(xué)惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成。根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ChPV NS基因和H9亞型AIV HA基因的核苷酸序列，采用DNAStar軟件將下載的ChPV和AIV目的基因進(jìn)行比對，進(jìn)而篩選出它們的特異性保守區(qū)域，利用Primer6.0和Oligo6.0軟件設(shè)計出2對特異性引物，然后通過NCBI BLAST對其特異性進(jìn)行在線驗證，引物設(shè)計的序列見表1。引物由賽默飛廣州分公司合成。

1.2.2 病毒RNA/DNA的提取與RNA的反轉(zhuǎn)錄。

參照 DNA/RNA 抽提試劑盒使用說明書對AIV、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV的DNA/RNA進(jìn)行抽提，抽提后的DNA/RNA用33 μLDEPC水溶解。RNA病毒的抽提產(chǎn)物參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有產(chǎn)物置-30 ℃冰箱保存。

1.2.3 二重RT-PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化。

該方法運用25 μL PCR反應(yīng)體系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5 μL，ChPV DNA和H9亞型AIV cDNA共2 μL作為模板，引物ChPV-F、ChPV-R、H9-F和H9-R（25 pmol/μL）各加入0.1～1.0 μL，10個梯度進(jìn)行引物濃度的優(yōu)化，最后用超純水補足至25 μL。根據(jù)試驗效果對退火溫度及時間進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系及條件。

1.2.4 特異性試驗。

運用所建立的二重RT-PCR檢測方法按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件對H3N2、H5N1、H6N2、H7N2、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV的RNA/DNA進(jìn)行檢測，驗證該方法的特異性。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備。

參考文獻(xiàn)[12]的方法，用ChPV NS基因和H9N2 HA全長基因的引物，分別以H9N2與ChPV為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到其HA和NS基因的全長目的片段，并將這3個基因片段分別鏈接到pMD18-T的載體上。將含有H9 亞型AIV的HA基因和ChPV NS基因片段的正確序列重組載體分別命名為H9-T和NS-T。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取H9-T和NS-T的質(zhì)粒，并用微量核酸檢測儀對其進(jìn)行核酸濃度的測定，根據(jù)分子質(zhì)量和核酸濃度計算對應(yīng)的拷貝數(shù)，將H9-T和NS-T等拷貝數(shù)混合，并進(jìn)行10倍倍比稀釋，以得到H9-T和NS-T質(zhì)粒DNA濃度均為5×101～5×109拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6 敏感性試驗。

運用所建立的ChPV和H9亞型禽流感病毒二重RT-PCR的檢測方法對H9-T和NS-T質(zhì)粒濃度為5×102～5×107拷貝/μL的樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，檢測該方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測。

運用建立的二重PCR檢測方法對活禽市場采集的140份雞咽喉及泄殖腔拭子進(jìn)行檢測鑒定，同時將病料處理后接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離鑒定，并進(jìn)行HA基因全長擴(kuò)增。同時經(jīng)ChPV NS基因陽性PCR產(chǎn)物和HA基因全長克隆送測序公司進(jìn)行測序，然后將上述結(jié)果進(jìn)行比較，驗證二重RT-PCR的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.2 二重RT-PCR條件的優(yōu)化

通過對H9亞型AIV HA基因和ChPV NS基因 2種引物濃度的測定及擴(kuò)增溫度時間等的優(yōu)化，最終確定二重PCR最佳反應(yīng)體系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5 μL，H9亞型AIV cDNA和ChPV DNA 各1μL作為模板，引物H9-F和H9-R（25 pmol/μL）各加入0.5 μL，引物ChPV-F 和ChPV-R（25 pmol/μL）則分別加入0.8 μL，最后用超純水補足至25 μL。最終優(yōu)化的反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;進(jìn)入95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 min，共35個循環(huán);然后再72 ℃延伸10 min。

2.2 特異性試驗

該法對H9及ChPV混合感染樣品檢測出2條特異性的條帶，分別為558（ChPV）及367 bp（H9亞型）;對ChPV檢測結(jié)果僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為558 bp;對H9N2亞型AIV進(jìn)行擴(kuò)增檢測出1條特異性條帶，片段大小為367 bp;對其他亞型AIV未出現(xiàn)特異性條帶，其他常見的禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶，結(jié)果表明該方法具有良好的特異性（圖1）。

48卷9期 李 丹等 雞細(xì)小病毒與H9亞型禽流感病毒二重PCR檢測方法的建立

2.3 敏感性試驗

由圖2可見，運用該方法針對5×103～5×107拷貝/μL的H9亞型AIV HA基因和ChPV NS基因質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，對濃度為5×104～5×107拷貝/μL的H9亞型AIV HA基因和ChPV NS基因質(zhì)粒均有2條明顯的特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為367和558 bp;對濃度小于或等于5×103拷貝/μL的H9亞型AIV HA基因和ChPV NS基因質(zhì)粒均無擴(kuò)增條帶。由此可見，該法最低能檢測到5×104拷貝/μL的H9亞型AIV HA基因和ChPV NS基因質(zhì)粒。

2.4 臨床樣品檢測

運用該方法對廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室從南寧活禽市場采集的140份雞口腔及泄殖腔的棉拭子樣品進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果顯示有2份樣品能同時擴(kuò)增出367和558 bp的目的條帶，為H9亞型AIV和ChPV混合感染陽性，有3份樣品能擴(kuò)增出367 bp的目的條帶，為單一H9亞型AIV陽性，15份樣品僅能擴(kuò)增出558 bp的目的條帶，為ChPV單一感染陽性，部分臨床樣品檢測結(jié)果見圖3。上述結(jié)果與病毒分離鑒定和HA基因測序結(jié)果100%相符，說明該方法有一定的實用性。

3 小結(jié)與討論

AIV基因組由8個獨立節(jié)段組成，分別為HA、NA、M、PB1、PB2、PA、NP和NS[13]。H9亞型AIV屬于LPAIV，該病毒主要引起雞群呼吸道、消化道和生殖系統(tǒng)的疾病，進(jìn)而造成雞的生長緩慢和產(chǎn)蛋率下降等不良影響，是目前影響我國養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV亞型。大部分野禽、水禽和家禽攜帶該病毒時均不表現(xiàn)出任何明顯的臨床癥狀，但該病毒會對其機(jī)體造成一定的損傷[14]。AIV抗原在自然條件下容易發(fā)生變異，臨床上易導(dǎo)致新亞型AI的出現(xiàn)，而且會發(fā)生多種亞型AIV的混合感染，其引起的癥狀又極其相似，給精確鑒別診斷造成了巨大困擾。在AIV的各種基因片段中，HA基因的變異最大，同時也變異最頻繁，因此HA基因的分型鑒定引物需要不斷的根據(jù)其變異進(jìn)行更新。目前，雞的腸道疾病也是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要問題之一，其中由ChPV等病毒引起的雞腸炎及腹瀉等癥狀在臨床上也十分常見[15]。ChPV感染會造成雞群發(fā)生腹瀉，也可能是隱性感染或者與其他病毒及細(xì)菌混合感染，進(jìn)而引起雞生長發(fā)育受阻，出現(xiàn)“僵雞”及飼料料肉比下降等，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[16 ]。另外由于ChPV引起的臨床癥狀與其他病毒較相似，且在臨床上極易呈現(xiàn)混合感染的病例，給臨床鑒別診斷帶來困難。目前尚無有效的疫苗防治ChPV感染。研究還發(fā)現(xiàn)，ChPV具有垂直傳播的潛在可能，可能造成種蛋的孵化率下降及雞胚發(fā)育不良增加。目前，國內(nèi)雖沒有關(guān)于ChPV暴發(fā)和流行的相關(guān)報道，但該試驗對不同品種和日齡雞群監(jiān)測的結(jié)果表明，ChPV在某些品種和日齡雞群的感染率依然很高。因此，對于ChPV的監(jiān)測及防控也十分迫切和必要，建立一種快速鑒別診斷方法可以為該病混合感染的監(jiān)測、鑒別及防控提供有力的技術(shù)支撐。

HA和HI方法也是目前世界衛(wèi)生組織（WHO）和世界動物衛(wèi)生組織（OIE）監(jiān)測流感采用的一般方法，但是由于該方法需要對抗原和血清進(jìn)行分型和標(biāo)準(zhǔn)化處理，而且其前期制備繁瑣，成本高，加之禽流感病毒變異性強(qiáng)，血清的廣譜性效果差，因此該方法的特異性和準(zhǔn)確性有所欠缺[17]。目前利用RT-PCR方法對AIV進(jìn)行鑒定與分型，也是WHO與OIE推薦的方法之一[18]。該方法快速準(zhǔn)確、操作簡便、平均樣品檢測成本相對較低，得到了廣泛的認(rèn)可與應(yīng)用推廣。近年來，國內(nèi)外已有檢測ChPV 的PCR診斷技術(shù)和方法的研究，而且同時檢測多種病原體混合感染的多重PCR技術(shù)也有不少報道[19-20]。該研究建立H9亞型AIV與ChPV二重PCR檢測方法，不僅可以快速診斷和鑒別上述2種疾病混合感染，也可快速診斷H9亞型AIV亞型或者ChPV單獨感染。該方法的特異性試驗結(jié)果顯示，多種病毒混合感染時依然能特異擴(kuò)增出目的基因條帶;同時敏感性試驗結(jié)果表明，當(dāng)2種病毒混合感染的含量很低時，該方法還能清晰擴(kuò)增出目的片段，說明建立的H9亞型AIV和ChPV二重PCR檢測方法能夠直接檢測臨床樣品，可為臨床上2種病毒性疾病的快速鑒別診斷提供技術(shù)支撐。

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