節(jié)旋藻對Pb2+生理響應(yīng)及吸附效應(yīng)研究

劉恒恒 董世瑞 張宏宇

摘要 通過測定不同Pb2+濃度下節(jié)旋藻的生理響應(yīng)，探討Pb2+對節(jié)旋藻生理特性的影響及節(jié)旋藻對重金屬Pb2+的吸附效應(yīng)。結(jié)果表明，Pb2+對節(jié)旋藻形態(tài)與生理特性具有顯著影響;當(dāng)水環(huán)境中Pb2+濃度為50 mg/L時，對節(jié)旋藻的生長具有明顯的抑制作用，此時藻體內(nèi)的藻膽蛋白、葉綠素a和類胡蘿卜素含量都出現(xiàn)最低值，并且藻藍蛋白對Pb2+濃度變化的生理反應(yīng)比別藻藍蛋白更為敏感。節(jié)旋藻對Pb2+的吸附量大致與Pb2+濃度呈正相關(guān)，但在40～50 mg/L時吸附量急劇增加;吸附率大致與Pb2+濃度呈負相關(guān)，但在40 mg/L時吸附率急劇增加?？梢?，節(jié)旋藻作為處理廢水中重金屬Pb2+的生物吸附劑時，其吸附效應(yīng)與節(jié)旋藻的生理狀態(tài)及Pb2+濃度有很大關(guān)系，對節(jié)旋藻吸附重金屬Pb2+的初步研究為節(jié)旋藻作為生物吸附劑的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 節(jié)旋藻;Pb2+;生理響應(yīng);吸附效應(yīng)

Abstract This study explored the effects of Pb2+ on the physiological characteristics of Arthrospira sp. and the adsorption effect of Arthrospira sp. on Pb2+ by measuring the physiological response of Arthrospira sp. under different concentrations of Pb2+.The results showed that Pb2+ had significant effects on the morphological and physiological characteristics of Arthrospira sp..When the concentration of Pb2+ in the water environment was 50 mg/L， it had a significant inhibitory effect on the growth of Arthrospira sp.. The phycobiliprotein， chlorophyll a and carotene content had the lowest value， and the physiological response of phycocyanin to changes in Pb2+ concentration was more sensitive than that of allophycocyanin. The adsorption amount of Arthrospira sp. to Pb2+ was approximately positively correlated with the concentration of Pb2+， but the adsorption amount increased sharply at 30-50 mg/L.The adsorption rate was roughly negatively correlated with the concentration of Pb2+， but the adsorption rate increased sharply at 40 mg/L. It can be seen that when Arthrospira sp. was used as a bioadsorbent for the treatment of heavy metal Pb2+ in wastewater，its adsorption effect had a strong relationship with the physiological state and Pb2+ concentration of Arthrospira sp.. The preliminary study on the adsorption of heavy metal Pb2+ by Arthrospira sp. provide a theoretical basis for the widespread application as bioadsorbent of Arthrospira sp..Key words Arthrospira sp.;Pb2+;Physiological response;Adsorption effect

人類活動對生態(tài)環(huán)境的影響日漸增強，工業(yè)的飛速發(fā)展使得重金屬污染問題愈發(fā)嚴(yán)重。重金屬類污染物生物毒性顯著且難以降解，引入環(huán)境后長時間保留[1-3]，在生物鏈的放大作用下持續(xù)地被富集，積蓄于生物體中，不僅威脅人類的健康，而且嚴(yán)重影響各個生物群體的生長與繁殖[4-5]。

鉛因其抗侵蝕性、高膨脹系數(shù)及良好的延展性等，被廣泛應(yīng)用于采礦、航空和涂料等諸多工業(yè)領(lǐng)域。含Pb2+的工業(yè)廢水持續(xù)大量排放造成了鉛污染范圍不斷地擴大，鉛通過消化道、呼吸道及皮膚進入人體后，主要毒性效應(yīng)是貧血癥、神經(jīng)機能失調(diào)和腎損傷[6]。

傳統(tǒng)處理水體中Pb2+的方法包括化學(xué)和物理法，如化學(xué)沉淀法、離子交換法及活性炭吸附法等，這些方法大部分成本較高或者還存在造成二次污染的風(fēng)險。生物吸附指利用生物本身的特性，通過表面絡(luò)合、靜電吸附或酶促作用等機理來實現(xiàn)分離水體中的重金屬離子[7-8]。生物吸附劑根據(jù)來源主要分為微生物和農(nóng)業(yè)廢棄物。在藍藻中已發(fā)現(xiàn)螺旋藻、魚腥藻、微囊藻和顫藻等可用于富集水環(huán)境中的重金屬離子[9-11]。微藻生長繁殖迅速，對于重金屬的吸附作用明顯且具有選擇吸附性，因此具有良好的應(yīng)用前景。

該研究以節(jié)旋藻TJSD091藻株為試驗材料，測定節(jié)旋藻在不同濃度Pb2+脅迫時的生理狀態(tài)及對Pb2+的吸附特性，評價不同濃度Pb2+對節(jié)旋藻生理特性的影響及節(jié)旋藻對不同濃度Pb2+的生物吸附和生長耐受能力，以期為應(yīng)用節(jié)旋藻作為水體中重金屬鉛離子的生物吸附劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

節(jié)旋藻（Arthrospira sp.）TJSD091分離自天津濱海濕地。將藻種按10%比例接種于200 mL AB培養(yǎng)基[12]中，光照12 h（32 ℃）、黑暗12 h（28 ℃）、光照強度3 000 lx培養(yǎng)12 d，每日搖勻3次。

1.2 生理指標(biāo)的測定

1.2.1 形態(tài)記錄。

光學(xué)顯微鏡（尼康ECLIPSE Ci-L型）測定節(jié)旋藻的細胞寬度、螺徑和螺距。

1.2.2 濁度測定。

紫外分光光度計（HITACHI U-5100型）測定節(jié)旋藻藻液OD560 nm。

1.2.3 干重測定。

取藻液20 mL在已稱重的0.45 μm濾膜上抽濾，用蒸餾水清洗，濾膜放入稱量瓶中，在70 ℃烘箱中烘至恒重，待冷卻至室溫后用分析天平稱重（SQP型），根據(jù)過濾前后濾膜重量差，計算藻細胞的干重。

1.2.4 藻膽蛋白濃度的測定。

取藻液30 mL過濾，藻泥加入20 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）使其重懸浮，-20 ℃放置1 h，反復(fù)凍融3次，經(jīng)超聲波細胞粉碎機（Scientz-IID型）破碎5 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液測量其OD615 nm和OD652 nm。按公式（1）和（2）計算濃度[13]：

1.2.5 葉綠素a濃度的測定。

取4 mL藻液8 000 r/min離心30 min，棄上清，加入4 mL無水乙醇，4 ℃放置24 h，5 000 r/min離心30 min，取上清，紫外分光光度計測定OD665 nm和OD649 nm。按公式（3）計算濃度 [14]：

1.2.6 類胡蘿卜素濃度的測定。

取藻液30 mL過濾，藻泥加入20 mL蒸餾水懸浮。反復(fù)凍融3次后定容至25 mL并混勻。取2.5 mL節(jié)旋藻藻液于50 mL離心管中，加入22.5 mL無水丙酮，避光放置30 min。濾紙過濾，分光光度計測定其OD440 nm、OD644 nm和OD662 nm。按公式（4）計算濃度[15]：

1.3 Pb2+吸附試驗

設(shè)置10個Pb2+濃度梯度（10～100）mg/L及對照組（0 mg/L），每組3個重復(fù)。Pb2+用蒸餾水配制成100 mg/L的母液，稀硝酸溶液稀釋到20、40、60、80和100 mg/L作為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在Pb2+脅迫24 h后，按步驟“1.2”測定指標(biāo)，將“1.2.3”所得濾液通過原子吸收分光光度計（普析通用AFG型），采用氫化物法（蘇州流量計有限公司 WHG-630A型）測定其中的鉛離子濃度，空白對照溶液為0 mg/L組的濾液。參數(shù)設(shè)置如下：吸收線波長為283.3 nm，燈電流為2 mA，狹縫寬度為0.4 nm，燃燒器高度為11 mm，乙炔流量為1 500 mL/min。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品溶液的吸光度計算Pb2+濃度。按公式（5）、（6）計算[16]：

式中，M表示吸附量（mg/g），C0為溶液初始濃度（mg/L），C1為吸附平衡濃度（mg/L），V為溶液體積（L），ms為藻生物量（g），P為吸附率（%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，通過OriginPro 8.0軟件繪制統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)及干重的變化

表1為不同濃度Pb2+處理的節(jié)旋藻的形態(tài)特征與干重描述。方差分析表明，螺距、螺徑、寬度及干重均差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)Pb2+濃度處于0～50 mg/L時，藻絲體的螺距變化顯著，60～100 mg/L時趨于平緩。螺徑在Pb2+濃度為40 mg/L時出現(xiàn)最小值，100 mg/L時又明顯下降。Pb2+濃度在20～80 mg/L時細胞寬度明顯小于0～10 mg/L時的細胞寬度，但在80～100 mg/L時細胞寬度開始持續(xù)增加。節(jié)旋藻干重在Pb2+濃度為50 mg/L時有最小值。

2.2 生長量變化

方差分析表明，不同濃度的Pb2+對節(jié)旋藻的生長具有極顯著的影響（P<0.01）。從圖1可看出，當(dāng)Pb2+濃度為10 mg/L時節(jié)旋藻生長無明顯變化，10～30 mg/L時先下降后上升，超過30 mg/L時受到強烈的抑制作用;50 mg/L時達到最低值，這與節(jié)旋藻的生長活力有關(guān)，同時與節(jié)旋藻干重指標(biāo)的試驗結(jié)果相符合;之后隨著Pb2+濃度的不斷升高，其生長也在不斷回升并趨于平緩，這可能與藻類在重金屬離子脅迫下的保護機制有關(guān)[17]。

2.3 藻膽蛋白含量的變化

方差分析表明，藻藍蛋白和別藻藍蛋白均差異極顯著（P<0.01）。從圖2可以看出，Pb2+的加入使得藻藍蛋白和別藻藍蛋白的濃度顯著降低。當(dāng)Pb2+濃度在10～50 mg/L時，二者的含量在總體上均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的過程，均在50 mg/L時達到最低值，說明此時藻體的生理代謝受到強烈的抑制作用;而超過50 mg/L時，二者的含量基本保持不變。這與藻體生長曲線的變化趨勢相吻合，且藻藍蛋白響應(yīng)Pb2+的脅迫比別藻藍蛋白更為敏感。

2.4 葉綠素a含量的變化

方差分析表明，不同濃度的Pb2+對節(jié)旋藻葉綠素a含量具有極顯著的影響（P<0.01）。從圖3可看出，葉綠素a濃度的變化趨勢呈現(xiàn)“M”形，當(dāng)Pb2+濃度為10 mg/L時，葉綠素a含量明顯上升，達到最大值;10～50 mg/L時持續(xù)下降，于50 mg/L達到最低值;在50～80 mg/L時出現(xiàn)上升，80 mg/L時處于較高值;當(dāng)超過80 mg/L后又出現(xiàn)直線下降的趨勢。

2.5 類胡蘿卜素含量的變化

方差分析表明，不同濃度的Pb2+對節(jié)旋藻類胡蘿卜素含量具有極顯著的影響（P<0.01）。從圖4可看出，當(dāng)Pb2+濃度在0～50 mg/L時，類胡蘿卜素含量基本呈持續(xù)下降趨勢，50 mg/L時處于最小值;超過50 mg/L后明顯上升，在60～70 mg/L時又出現(xiàn)下降;在70～90 mg/L時出現(xiàn)上升，但超過90 mg/L后，類胡蘿卜素含量又明顯下降。

2.6 Pb2+的吸附效應(yīng)

以Pb2+濃度（C）為橫坐標(biāo)、Pb2+濃度所對應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.053 1C-0.013 9（R2=0.995 6）。

從表2可以看出，節(jié)旋藻的吸附量和吸附率均差異極顯著（P<0.01）。節(jié)旋藻對Pb2+的吸附量隨著Pb2+濃度的增大基本呈上升趨勢，在60～70 mg/L時，其吸附量稍有降低，但隨后又上升。而節(jié)旋藻對Pb2+的吸附率隨著Pb2+濃度的增大大致呈減小趨勢，在40 mg/L時，其吸附率突然升高，隨后持續(xù)降低。

3 討論

生物活性細胞吸附重金屬離子包含胞外吸附和胞內(nèi)積累2個過程。胞外吸附主要由位于細胞壁上的基團與金屬離子結(jié)合而吸附金屬[18]，藻類的細胞壁表面皺褶多且多孔，有較大的比表面積，且?guī)в胸撾姾?，可以通過靜電吸引、離子交換和絡(luò)合等方式吸附;胞內(nèi)積累主要是利用生物體新陳代謝作用產(chǎn)生的能量，通過單價或二價離子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)把金屬離子輸送到胞內(nèi)后積累于某些細胞器，然后轉(zhuǎn)化為毒性較小的化合物，這是胞內(nèi)重金屬解毒機制。胞內(nèi)積累為主動吸附，超負荷積累金屬離子會抑制酶活、破壞抗氧化系統(tǒng)、增大細胞膜透性使得藻類停止生長[19]。對于藻類吸附金屬離子的研究大都處于實驗室階段[20-22]。

節(jié)旋藻的生長由生長素誘導(dǎo)，其對節(jié)旋藻的促生長作用存在最適濃度，較小時效果不明顯，較大時出現(xiàn)抑制作用，而Pb2+的存在則會破壞生長素的結(jié)構(gòu)。周長芳等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pb2+濃度小于50 mg/L時促進螺旋藻生長，大于60 mg/L時出現(xiàn)抑制作用。胡一兵等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pb2+濃度超過50 mg/L時對鈍頂螺旋藻生長的毒害作用明顯。該試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pb2+濃度小于30 mg/L時節(jié)旋藻的生長仍然呈上升趨勢，達到50 mg/L時，藻體生長到抑制。

藻膽蛋白主要包括藻藍蛋白（PC）和別藻藍蛋白（APC），作為藍藻中普遍存在的2種捕光色素蛋白是重要的活性物質(zhì)，并且在光的傳遞過程中起著橋梁的作用[25]。Pb2+可透過細胞壁作用于細胞膜，嚴(yán)重破壞細胞膜的透性。節(jié)旋藻在Pb2+長時間脅迫條件下細胞膜受到傷害，影響選擇透過性，大量的細胞內(nèi)容物外滲，藻膽蛋白解離溶出[26]。葉綠素含量的降低可能由于Pb2+直接干擾葉綠素的合成，一方面，高濃度的鉛離子可以抑制葉綠素合成過程中葉綠素酸酯還原酶的活性，并影響氨基-γ-酮戊酸的合成，二者均為葉綠素合成所必需的前體物質(zhì)[27-28];另一方面，Pb2+會取代葉綠素分子中的Mg2+或與葉綠體中可溶性蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合，破壞葉綠素的結(jié)構(gòu)和功能[29]。另外，細胞受到Pb2+脅迫后活性氧自由基和葉綠素酶都可能引起光合色素的降解[30]。類胡蘿卜素能夠清除活性氧自由基，防止脂質(zhì)過氧化。當(dāng)藻體細胞遭受Pb2+脅迫時，細胞內(nèi)的電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁虼藢?dǎo)致代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基發(fā)生累積。類胡蘿卜素主要發(fā)揮抗氧化作用，因此含量不斷下降。試驗中當(dāng)Pb2+濃度超過50 mg/L時，類胡蘿卜素的含量變化較明顯，可能細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，超出了細胞抵御逆境脅迫的能力，說明高濃度的Pb2+對節(jié)旋藻的傷害程度較嚴(yán)重。

4 結(jié)論

當(dāng)水環(huán)境中Pb2+在低濃度（30 mg/L以下）時，Pb2+對節(jié)旋藻沒有明顯的抑制作用，對生長具有微弱的促進作用，但葉綠素a含量起伏較大，類胡蘿卜素含量持續(xù)下降直至30 mg/L時略有回升。當(dāng)Pb2+濃度在50 mg/L時，藻膽蛋白、葉綠素a和類胡蘿卜素均出現(xiàn)最低值，但吸附量突然升高，吸附率卻小于40 mg/L時的吸附率，此時節(jié)旋藻生長受到強烈抑制。由于活性微生物吸附劑存在抗性范圍[31]，因此這很可能是由于節(jié)旋藻對金屬離子吸附與吸收超負荷而影響了細胞自身的生理活動，表明其對Pb2+的吸附效應(yīng)與生理代謝和細胞活動關(guān)系密切。當(dāng)Pb2+濃度在50 mg/L以上時，藻膽蛋白、葉綠素a和類胡蘿卜素稍有回升但隨著Pb2+濃度增大而低于低濃度Pb2+時的含量，這也表明金屬離子對細胞損害的嚴(yán)重性。

參考文獻

[1] LI J N，HASHIMOTO Y，RIYA S，et al.Removal and immobilization of heavy metals in contaminated soils by chlorination and thermal treatment on an industrialscale[J].Chemical engineering journal，2019，359：385-392.

[2] WANG J，WANG P Y，WANG H H，et al.Preparation of molybdenum disulfide coated Mg/Al layered double hydroxide composites for efficient removal of chromium（VI）[J].ACS Sustainable Chemistry & Engineering，2017，5（8）：7165-7174.

[3] WANG Q W，DONG S Y，ZHANG D，et al.Magnetically recyclable visiblelightresponsive MoS2@Fe3O4 photocatalysts targeting efficient wastewater treatment[J].Journal of materials science，2017，53（2）：1135-1147.

[4] SCOTT G R，SLOMAN K A.The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour：Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity[J].Aquatic toxicology，2004，68（4）：369-392.

[5] 許思思，宋金明，袁華茂，等.鎘、汞、鉛和石油烴復(fù)合污染對渤海灣常見漁業(yè)資源生物的影響初探[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2010，5（6）：793-802.

[6] GRACIA R C，SNODGRASS W R.Lead toxicity and chelation therapy[J].American journal of healthsystem pharmacy，2007，64（1）：45-53.

[7] 楊倩.生物吸附法處理水體中重金屬離子的研究進展[J].云南化工，2018，45（7）：76-78，81.

[8] 段楊慧.生物吸附法處理重金屬離子廢水研究進展[J].中國錳業(yè)，2016，34（5）：100-102.

[9] 周旭東，李彩云，高鵬程，等.活體微藻吸附水體中Cd2+的性能特征[J].微生物學(xué)通報，2017，44（5）：1182-1188.

[10] 胡琴，曹艷，張喆倩，等.不同微藻吸附重金屬離子Cd2+的實驗研究[J].上海環(huán)境科學(xué)，2017，36（4）：179-184.

[11] AVERY S V，CODD G A，GADD G M.Caesium accumulation and interactions with other monovalent cations in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803[J].Journal of general microbiology，1991，137（2）：405-413.

[12] OGAWA T，TERUI G.Studies on the growth of Spirulina platensis.（I）On the pure culture of Spirulina platensis[J].Journal of fermentation technology，1970，48（6）：361-367.

[13] BENNETT A，BOGORAD L.Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga[J].The journal of cell biology，1973，58（2）：419-435.

[14] LOBBAN C S，CHAPMAN D J，KREMER B P，et al.Experimental phycology：A laboratory manual[M].Cambridge：Cambridge University Press，1988：563-589.

[15] 王業(yè)勤，李勤生.天然類胡蘿卜素：研究進展、生產(chǎn)、應(yīng)用[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1991：25-132.

[16] MARQUES P A S S，ROSA M F，PINHEIRO H M.pH effects on the removal of Cu2+，Cd2+ and Pb2+ from aqueous solution by waste brewery biomass[J].Bioprocess engineering，2000，23（2）：135-141.

[17] DAO L H T，BEARDALL J.Effects of lead on growth，photosynthetic characteristics and production of reactive oxygen species of two freshwater green algae[J].Chemosphere，2016，147：420-429.

[18] 李愷，耿存珍，張陽，等.活性和非活性海藻吸附重金屬的研究[J].環(huán)境工程，2013，31（1）：51-55，34.

[19] 鄭玉建，張杰，依不拉音.微生物在水體重金屬污染治理中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)（醫(yī)學(xué)地理分冊），2006，27（1）：39-42.

[20] 陳必鏈，吳松剛.鈍頂螺旋藻對7種重金屬的富集作用[J].福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1999，15（1）：81-85.

[21] 駱巧琦，陳長平，梁君榮，等.利用藻類去除電鍍廢水中重金屬的實驗研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，45（S1）：277-280.

[22] 劉慧君，龔仁敏，張小平，等.極大螺旋藻（Spirulina maxima）對六種重金屬離子的生物吸附作用[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，27（1）：68-70.

[23] 周長芳，吳國榮，陸長梅，等.鉛污染對鈍頂螺旋藻生長及某些生理性狀的影響[J].湖泊科學(xué)，1999，11（2）：135-140.

[24] 胡一兵，劉輝平，胡軍.幾種水體污染因子對鈍頂螺旋藻生長的影響[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2001，19（4）：16-18.

[25] 韓博平，韓志國，付翔.藻類光合作用機理與模型[M].北京：科學(xué)出版社，2003.

[26] ANEJA R K，CHAUDHARY G，AHLUWALIA S S，et al.Biosorption of Pb2+ and Zn2+ by nonliving biomass of Spirulina sp.[J].Indian journal of microbiology，2010，50（4）：438-442.

[27] 楊剛，伍鈞，唐亞.鉛脅迫下植物抗性機制的研究進展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2005，24（12）：1507-1512.

[28] PRASAD D D K，PRASAD A R K.Effect of lead and mercury on chlorophyll synthesis in mung bean seedlings[J].Phytochemistry，1987，26（4）：881-883.

[29] KPPER H，KPPER F，SPILLER M.Environmental relevance of heavy metalsubstituted chlorophylls using the example of water plants[J].Journal of experimental botany，1996，47（2）：259-266.

[30] FOYER C H，NOCTOR G.Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts，peroxisomes and mitochondria[J].Physiologia plantarum，2003，119（3）：355-364.

[31] GUO H J，LUO S L，CHEN L，et al.Bioremediation of heavy metals by growing hyperaccumulaor endophytic bacterium Bacillus sp.L14[J].Bioresource technology，2010，101（22）：8599-8605.