上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導轉(zhuǎn)錄因子在肺癌診斷和預后預測中的作用

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

肺癌是全球人群中發(fā)病率最高的腫瘤（占所有腫瘤的11.6%），其死亡率也位居各類腫瘤之首（占18.4%）［1］。目前，手術(shù)治療仍是中早期肺癌治療的首選方法，但仍有許多患者喪失手術(shù)機會或在術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，因而早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療在肺癌的診治中至關(guān)重要。對于部分無法手術(shù)或術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者，分子靶向治療作為新的治療手段取得了良好的效果，正越來越受到重視。與傳統(tǒng)化療相比，靶向藥物具有特異性強、療效明顯、不良反應較少等優(yōu)點［2］。然而，靶向藥物僅適用于目標基因有突變的患者，且治療一段時間后，大多數(shù)患者對靶向藥物產(chǎn)生耐受。這表明，肺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的機制異常復雜，有必要進一步探索肺癌細胞的遷移和侵襲機制，以尋找更好的生物標志物，為腫瘤治療、靶向藥物的研發(fā)提供理論支持。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）介導了腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)和腫瘤耐藥［3］。在EMT過程中，表皮表型的腫瘤細胞失去細胞極性和細胞間的緊密連接，轉(zhuǎn)化為沒有細胞極性且遷移侵襲能力較強的間質(zhì)表型。此外，EMT還受到Twist家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子1（Twist family BHLH transcription factor 1，Twist1）、Twist2、Snail超家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail family zinc finger，SNAI）1、SNAI2、鋅指E盒同源結(jié)合蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）、ZEB2等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，它們常被視作EMT的生物標志物，可統(tǒng)稱為EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子（EMT-inducing transcription factor，EMT-TF）［3］。研究發(fā)現(xiàn)，EMT還可激活腫瘤干細胞，導致耐藥［4］。因此研究EMT-TF在肺癌中的作用有助于肺癌的病理診斷與預后分析。

Twist1和Twist2是堿性的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（basic helix-loop-helix protein，bHLH）家族中的兩個重要轉(zhuǎn)錄因子。在多種腫瘤中，Twist1呈現(xiàn)高度甲基化，且表達明顯增加［5］，它可通過調(diào)控EMT促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［6］。此外，Twist1還可通過誘導EMT、激活腫瘤干細胞，致使多種腫瘤對靶向藥物發(fā)生耐受［7-9］。然而，與Twist1相反，Twist2對腫瘤有明顯的抑制作用，它在多種腫瘤組織中，無論是mRNA水平還是蛋白水平都有明顯的下降［10］。ZEB家族在激活腫瘤干細胞、調(diào)控腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管生成和化療藥耐藥等方面發(fā)揮著重要作用，因而有可能成為腫瘤診斷、預后分析以及治療的靶點［11］。ZEB家族有兩個重要轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2，它們主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用。SNAI是保守的鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，它對果蠅中胚層的形成至關(guān)重要［12］。SNAI在轉(zhuǎn)錄水平受到很多生長因子和信號分子的調(diào)節(jié)，這些因子通過結(jié)合SNAI基因的啟動子區(qū)域發(fā)揮調(diào)控作用［13-14］。SNAI1能夠與組蛋白去乙酰化酶HDAC1/2相互作用，通過改變?nèi)旧|(zhì)的局部結(jié)構(gòu)，抑制E-cadherin的表達，進而調(diào)節(jié)EMT［15］。隨著研究的深入，人們越來越關(guān)注EMT-TF在腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)中的作用，但目前有關(guān)EMT-TF與腫瘤分期、預后預測方面的研究很少，因此我們期望利用腫瘤在線數(shù)據(jù)庫，篩選對肺癌診斷、分期和預后預測方面有一定價值的轉(zhuǎn)錄因子。

1 材料和方法

1.1 Oncomine Database分析、GEPIA和Lung Cancer Explore

Oncomine Database數(shù)據(jù)庫中共有肺癌數(shù)據(jù)集74個，包括6 289個樣本，我們通過Oncomine Database分析EMT TF在不同腫瘤中的表達水平，進而分析EMT TF在肺癌組織和正常組織中的表達差異（cut-off值：P=0.01，fold change of 2）。GEPIA公共在線數(shù)據(jù)庫包含TCGA數(shù)據(jù)庫中9 736例腫瘤標本以及GTEx數(shù)據(jù)庫8 587例正常組織樣本［16］。我們應用GEPIA比較了EMT-TF基因在肺癌（肺腺癌和鱗狀細胞癌）和正常組織中的表達差異，同時還將分析EMT-TF mRNA表達水平與腫瘤臨床病理學分期的相關(guān)性。

1.2 Kaplan-Meier Plotter

Kaplan-Meier Plotter能夠檢測近54 000個基因?qū)?1種腫瘤生存預后的影響［17］。我們應用Kaplan-Meier Plotter Lung Cancer數(shù)據(jù)庫分析EMT TF mRNA水平對肺癌患者5年生存率的影響，例如總生存期（overall survival，OS）、無進展生存期（progression-free survival，PFS）、進展后生存期（post-progression survival，PPS）。

1.3 STRING和Mentha數(shù)據(jù)庫

STRING數(shù)據(jù)庫收集了目前研究的蛋白質(zhì)間的相互作用，我們通過多基因分析篩選了EMTTF的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡。Mentha數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來自于依附IMEx聯(lián)盟的人工管理的PPI數(shù)據(jù)庫，聚集的數(shù)據(jù)為科研工作提供了一系列工具，在PPI網(wǎng)絡的背景下分析選定的蛋白質(zhì)。通過Mentha數(shù)據(jù)庫，分析EMT-TF相互作用的系數(shù)以及與之作用的分子。

2 結(jié)果

2.1 EMT-TF在肺癌組織中的表達水平

應用ONcomine數(shù)據(jù)庫，我們對比了多種腫瘤組織和正常組織中EMT-TF的轉(zhuǎn)錄水平（圖1），并將肺癌有關(guān)的結(jié)果單獨歸納于表1。在Hou肺癌數(shù)據(jù)庫中，鱗癌、腺癌組織中Twist1 mRNA水平分別是正常組織的7.7倍和2.54倍，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）［18］。在包括Hou等［18］報道的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的4個肺癌數(shù)據(jù)庫中，鱗癌SNAI2轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于正常組織：Yamagata數(shù)據(jù)庫中，SNAI2轉(zhuǎn)錄水平增加2倍［19］；Wachi等［20］和Hou等［18］報道，SNAI2轉(zhuǎn)錄水平增加3倍多；Garber數(shù)據(jù)庫中［21］，SNAI2轉(zhuǎn)錄水平增加4倍多，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 EMT-TF在不同腫瘤中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 Transcription level of EMT-TF in different types of cancer

表1 EMT-TF轉(zhuǎn)錄水平在肺癌和肺組織中的改變Tab.1 The significant changes in transcription level of EMT-TF between different types of lung cancer and normal tissues

2.2 EMT-TF的mRNA表達與肺癌臨床病理學分期的關(guān)系

通過搜索基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫比較了EMT-TF在肺癌組織和正常組織中的表達差異。結(jié)果顯示，與正常組織相比，在肺鱗癌中Twist1和SNAI2 mRNA表達增加，Twist2、ZEB1、ZEB2和SNAI1表達降低；而在腺癌中，Twist2、ZEB1、ZEB2和SNAI1 mRNA表達水平降低，Twist1、SNAI2 mRNA表達無差異（圖2A）。

為探究EMT-TF的表達水平與腫瘤分期的相關(guān)性，我們采用stage plot方法對GEPIA數(shù)據(jù)進行了分析，結(jié)果顯示，Twist1、SNAI1和SNAI2表達水平與肺癌臨床病理分期具有明顯相關(guān)性，而Twist2、ZEB1和ZEB2的表達水平與臨床病理學分期無相關(guān)性（圖2B）。

2.3 Twist1與肺癌患者預后相關(guān)

我們采用Kaplan-Meier Plotter工具分析了EMT-TF mRNA水平與肺癌5年生存率之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Twist1和Twist2的表達增加提示肺癌患者的不良預后（P＜0.05）：例如Twist1、Twist2高表達組患者OS、PFS均較低（P＜0.05），SNAI1高表達組患者PFS、OS和PPS均較低（P＜0.05），ZEB1、ZEB2低表達與肺癌的不良預后相關(guān)，其中ZEB1的表達降低與肺癌OS降低相關(guān)，ZEB2的低表達與肺癌的PFS和OS預后不良顯著相關(guān)（圖3）。

2.4 EMT-TF的相互作用及通路

我們首先采用STRING分析了EMT-TF之間的PPI，結(jié)果顯示，EMT-TF之間存在直接或間接的相互作用，其中Twist1和Twist2在信號網(wǎng)絡中起關(guān)鍵作用（圖4A）。隨后，我們采用Mentha數(shù)據(jù)庫進一步展示了TF之間的相互作用以及與它們相互作用的分子，并且顯示了分子作用的部位（圖4B）。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，EMT-TF受到細胞外界微環(huán)境的變化，如細胞因子等的調(diào)控，發(fā)揮促進腫瘤遷移和侵襲的作用，進而導致轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

圖2 EMT-TF的mRNA水平以及與肺癌臨床病理分期的關(guān)系Fig.2 The association of EMT-TF mRNA transcription level and tumor stage in lung cancer patients

圖3 EMT-TF與肺癌預后的相關(guān)性Fig.3 The correlation of EMT-TF expression level and prognosis of lung cancer patients

圖4 PPI和EMT-TF相互作用的分子Fig.4 PPI network of EMT-TF and the cofunction molecules

3 討 論

EMT是肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，非小細胞肺癌患者可通過EMT機制對腫瘤治療藥物產(chǎn)生耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可通過下列途徑介導EMT：①通過Smad途徑介導EMT；② 通過誘導Smad復合體浸入細胞核進而調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因和因子的表達；③可增加SNAI1、SNAI2和ZEB1/2等EMT-TF的表達［22］。LncRNA也能通過影響EMT的進程和腫瘤干細胞特性，發(fā)揮調(diào)節(jié)非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的作用［23-24］。研究表明，miRNA也能調(diào)控EMT，如抑癌因子miR-451a的過表達可破壞肺癌細胞的EMT，顯著增強肺癌細胞對多柔比星治療的敏感性［25］。在肺癌中，很多促癌基因也能促進EMT，比如FAM83D［26］、FOXK1［27］、KLK4［28］等。因此識別并阻斷EMT進程，對降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移非常重要，同時也可降低進展期肺癌患者的負荷，進而提高對手術(shù)的耐受和預后，這對肺癌乃至所有腫瘤患者都很重要。

研究發(fā)現(xiàn)Twist1在肺癌中受很多因素的調(diào)節(jié)，如LncRNA JPX上調(diào)Twist1后通過Wnt/β-catenin信號通路誘導EMT和肺癌細胞侵襲［29］；HR23A與Twist1相互作用促進了Twist1的泛素介導的蛋白酶體降解，從而抑制了EMT、癌細胞遷移和干細胞特性［30］；此外還包括表觀遺傳相關(guān)分子和miRNA。目前對Twist2的研究寥寥無幾，并且對其在肺癌中的作用并無明確一致的觀點［31-32］。本研究發(fā)現(xiàn)Twist1在肺癌中的表達增加，并且與肺癌的臨床病理學分期相關(guān)，Twist1表達增加提示肺癌患者的不良預后，以上皆提示Twist1在肺癌診斷和研究中的重要性和作為肺癌潛在標志物的可能。

SNAI1是一種重要的EMT-TF，可以促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，從機制上講，SNAI1向其目標啟動子招募多個參與組蛋白去乙?；?、甲基化和泛素化的抑制蛋白復合物，并發(fā)揮其抑制功能［33］。臨床上發(fā)現(xiàn)，SNAI1的表達和化療耐藥、生存率降低、復發(fā)率較高和預后較差相關(guān)［15，33-34］。然而SNAI1是不穩(wěn)定的，通過泛素化介導的蛋白酶體途徑很快被降解，通過穩(wěn)定SNAI1能夠促進肺癌細胞的遷移［33］。腫瘤在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SNAI1在肺癌組織中的表達低于正常組織，并且與分期密切相關(guān)，但其預后和在腫瘤中的表達存在分歧。目前對于SNAI1的研究甚少，SNAI1在肺癌中降低的機制，以及它調(diào)控的基因仍有待進一步探討；同時我們分析不同的研究存在樣本的差異，以及臨床數(shù)據(jù)收集樣本的特異性等，使得無法對其原因進行深入分析。

ZEB1/2的作用相似，在肺癌中，各種調(diào)節(jié)因子通過作用于ZEB1/2的啟動子，調(diào)節(jié)它們的表達，進而調(diào)節(jié)EMT和肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［35-37］。ZEB1/2通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)其表達水平在肺癌中降低，但和臨床病理學分期無相關(guān)性，ZEB1/2表達降低與患者的不良預后相關(guān)。同時EMT-TF在肺癌中的作用逐漸明了，本研究也發(fā)現(xiàn)了其與肺癌分期和預后的相關(guān)性，這可能輔助于臨床診斷、分期和預后預測，同時未來的研究需要進一步探索外界及腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)EMT-TF的因子，為腫瘤的預防和治療提供理論依據(jù)。

Twist1、SNAI2、ZEB1和ZEB2在肺癌中的表達量和正常組織不同，Twist1和SNAI2的表達量與腫瘤的分期與預后相關(guān)，ZEB1和ZEB2在肺癌中表達量降低與肺癌患者的預后不良相關(guān)。因此，Twist1和SNAI2可能是肺癌診斷和研究的潛在的生物標志物，ZEB1和ZEB2可作為肺癌預后的預測分子。