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    PRMT5在胃癌中的表達及其對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響

    2020-05-19 09:36:08燕飛虎王一堯王芳芳冉浩男
    中國癌癥雜志 2020年4期
    關鍵詞:細胞系試劑盒胃癌

    燕飛虎,鄒 瑞,王一堯,王芳芳,冉浩男,王 燕

    1.海南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科,海南 ???570100;

    2.海南省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科,海南 ???570100;

    3.海南省腫瘤醫(yī)院放療科,海南 ???570100;

    4.海南省腫瘤醫(yī)院血液腫瘤科,海南 海口 570100

    胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,發(fā)病率位居中國惡性腫瘤前列[1],其早期臨床癥狀非常隱匿,一般確診時已是中晚期。找到有效的生物標志物對胃癌進行早期篩查和檢測,有利于對患者及時治療,提高患者的生存率。胃癌的發(fā)病機制較復雜,可能與環(huán)境、幽門螺桿菌感染、遺傳等多種因素有關[2],其中基因異常表達與腫瘤的關系是近年來的研究熱點。蛋白精氨酸甲基轉移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是一種能調(diào)控細胞周期的酶,其定位于哺乳動物細胞的細胞質(zhì)和細胞核,在多種腫瘤中均有異常表達,并能影響患者的預后[3-5]。目前關于PRMT5在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用的相關研究尚少見。本研究觀察PRMT5在胃癌組織中的表達水平,旨在探討其對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移能力的影響,為臨床診療提供依據(jù)。

    1 資料和方法

    1.1 一般資料

    收集2016年5月—2019年1月在海南省腫瘤醫(yī)院確診為胃癌并進行手術治療的患者的胃癌組織及其癌旁組織(距離癌組織>5 cm)標本88例。其中男性48例,女性40例;年齡45~70歲,平均(54.33±10.47)歲。收集方式:確診患者行胃癌手術時在胃鏡觀察下切下胃癌組織;保存方式:將切下的2~3塊胃癌組織經(jīng)液氮快速冷凍后置-80 ℃保存以備提取基因組DNA。

    1.2 納入標準與排除標準

    納入標準:符合胃癌的臨床診斷標準[6],并經(jīng)病理學檢查確診;年齡>18歲;術前均未進行放化療等相關治療。排除標準:合并其他系統(tǒng)或器官腫瘤者;處于妊娠或哺乳期者;臨床資料不全者。本研究經(jīng)海南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準實施。

    1.3 方法

    1.3.1 主要材料與試劑

    實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)試劑盒、10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、磷脂酰絲氨酸結合蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、細胞轉染試劑盒均購自上海滬震生物科技有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,聚丁二酸丁二醇酯[poly(1,4-butylene succinate),PBS]、苯酚購自北京康普匯維科技有限公司,TRIzol 總RNA提取試劑購自合肥博美生物科技有限公司,PRMT5單克隆抗體、內(nèi)參GAPDH抗體、Transwell小室均購自上海安研商貿(mào)有限公司,人胃癌細胞系SGC-7901由海南省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學與腫瘤研究中心提供。

    1.3.2 主要儀器

    WS-300恒溫培養(yǎng)箱購自上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司,YKDZ-55顯微鏡購自上海永科光學儀器有限公司,DXFLEX流式細胞檢測儀購自美國貝克曼庫爾特公司,酶標儀購自上海纖檢儀器有限公司,DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀購自上虞艾科儀器設備有限公司,DP/ZB紫外線投射儀購自北京亞歐德鵬科技有限公司。

    1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PRMT5在胃癌組織中的表達

    將88例胃癌組織和癌旁正常組織標本放入預冷的研缽中,研磨成粉,加入適量RIPA裂解液,裂解30 min后,離心15 min,取上清液。按照BCA試劑盒說明書上的操作步驟檢測蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液充分混勻,置于沸水中煮沸變性5 min,將變性的蛋白放入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠上樣孔中,每孔加入25 μL,經(jīng)凝膠電泳分離蛋白組分后,將蛋白轉印于聚偏二氟乙烯膜上,加入5%脫脂奶粉封閉2 h;加入PRMT5單克隆抗體(1∶500)于4 ℃低速搖動溫育過夜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)于37 ℃低速搖動溫育45 min,以GAPDH為內(nèi)參,電化學發(fā)光顯色后膠片曝光并分析結果。PRMT5蛋白在胃癌組織中的表達量以胃癌組織PRMT5條帶灰度值與對應的GAPDH條帶灰度值之比表示。

    1.3.4 細胞培養(yǎng)

    從液氮中取出細胞系,于37 ℃溶解后加到含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,離心去除上清液,向細胞沉淀物中加入細胞培養(yǎng)液懸浮細胞,接種到細胞培養(yǎng)瓶中,于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。當細胞融合度達到90%以上時,去除培養(yǎng)液,用胰蛋白酶消化細胞,將對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    1.3.5 細胞轉染

    將對數(shù)生長期的SGC-7901細胞以105個細胞/mL接種至6孔細胞培養(yǎng)板中,每孔2 mL,培養(yǎng)過夜。按照LipofectaminTM2000轉染說明書進行轉染,轉染分3組:PRMT5小干擾RNA(PRMT5-siRNA)組加入12 μL PRMT5-siRNA轉染SGC-7901細胞;陰性對照無意義siRNA序列(siRNANC)組加入12 μL siRNA空載對照轉染SGC-7901細胞;對照組為未轉染的SGC-7901細胞。

    靶向PRMT 5 的siRNA 序列順義鏈為5’-GGGACUGGAAUACGCUAAUTT-3’,反義鏈為5’-AUUAGCGUAUUCCAGUCCCTT-3’;陰性對照(si)序列順義鏈為5’-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3’,反義鏈為5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’。

    1.3.6 轉染后細胞中PRMT5 mRNA表達和蛋白水平檢測

    轉染24 h后,將1.3.5中的3組細胞用TRIzol法提取總RNA,用RTFQ-PCR試劑盒進行反轉錄反應,將cDNA,產(chǎn)物進行PCR擴增:95 ℃預變性5 min,94 ℃ 30 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,72 ℃ 10 min,35個循環(huán),分別取5 μL RTFQ-PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下拍照,采用Image Pro Plus圖像分析軟件比較電泳條帶相對光密度值,以GAPDH為內(nèi)參基因,分析PRMT5 mRNA相對表達量。取轉染48 h后1.3.5中3組細胞,轉移細胞至新的離心管,離心5 min,加入TRIzol并進行裂解反應30 min,離心取上清液,BCA蛋白定量試劑檢測蛋白濃度,按照1.3.3方法檢測各組細胞PRMT5蛋白表達水平。

    1.3.7 細胞增殖檢測

    將轉染24 h的上述3組細胞以3×105個/mL分別接種于96孔板細胞培養(yǎng)板中,每孔加入150 μL細胞懸液,置于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中分別培養(yǎng)12、24和48 h后,每孔加入細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑10 μL,37 ℃培養(yǎng)4 h,用酶標儀測定各組450 nm處的光密度(D)值,計算細胞增殖率。細胞增殖率=(D轉染組細胞/D對照組細胞)×100%。

    1.3.8 細胞凋亡檢測

    取培養(yǎng)24 h的1.3.5中各組細胞,將細胞分別重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中,將重懸后的各組細胞接種于96孔板中,4×103個/孔,于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中分別培養(yǎng)12、24和48 h后,胰蛋白酶消化重懸,轉移至離心管,調(diào)整每管細胞數(shù)約為1×105個,預冷PBS洗滌2次,按照凋亡試劑盒說明,向細胞中加入AnnexinⅤ10 μL,避光溫育10 min,預冷PBS洗滌2次,向每管中加入PI溶液4 μL,立即采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/(正常細胞數(shù)+凋亡細胞數(shù))×100%。

    1.3.9 細胞遷移能力檢測

    取培養(yǎng)24 h的1.3.5中各組細胞,將其接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng),待細胞長滿單層后,用滅菌200 μL吸嘴在細胞單層上劃痕,用倒置顯微鏡觀察劃痕區(qū)域寬度并拍照,然后置于培養(yǎng)箱中溫育24 h后在倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)域寬度變化,用Image軟件測量劃痕區(qū)域寬度,計算各組細胞對應細胞的劃痕愈合率,每組細胞設置3個復孔,取平均值為最終結果。

    1.3.10 細胞侵襲能力檢測

    將Transwell小室進行包被Matrigel基底膠處理。在24孔中加入含10%無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL,將小室放在其中進行水化預處理,小室上孔加入含10%血清培養(yǎng)基,于37 ℃、濕度95%、CO2體積分數(shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)24 h,取出小室,多聚甲醛固定30 min,結晶紫染色液染色15 min。隨機選取5個視野拍照計數(shù)。

    1.3.11 Western blot檢測蛋白水平

    取轉染后培養(yǎng)48 h的1.3.5中各組細胞,按照1.3.3 中方法提取細胞蛋白并檢測培養(yǎng)48 h時cleaved caspase 3、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和磷酸化AKT(phosphorylated-AKT,p-AKT)蛋白水平。

    1.4 統(tǒng)計學處理

    以Bioimagining System灰度測量系統(tǒng)測量條帶灰度值;采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理,計數(shù)資料用頻數(shù)表示,比較用χ2檢驗,計量資料用()表示,比較用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 PRMT5在胃癌組織中高表達

    Western blot檢測結果顯示,胃癌組織中PRMT5的蛋白相對表達量(0.54±0.64)高于癌旁組織(0.24±0.05)(P<0.01,圖1)。

    圖1 PRMT5在胃癌組織中的表達Fig.1 Expression of PRMT5 in gastric cancer tissues

    2.2 胃組織中PRMT5蛋白表達水平與病理學分級及淋巴結轉移呈正相關

    經(jīng)統(tǒng)計分析可知,PRMT5蛋白表達量在不同胃癌病理分級、TNM分期及是否有淋巴結轉移患者中差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),而在不同性別、年齡患者中差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05,表1)。

    2.3 siRNA能沉默人胃癌細胞系SGC-7901 PRMT5基因的表達

    空脂質(zhì)體、siRNA-NC、PRMT5-siRNA轉染人胃癌細胞系SGC-7901 48 h后,RTFQ-PCR和Western blot檢測各組織中PRMT5 mRNA表達和蛋白水平。結果顯示,siRNA-NC組細胞中PRMT5 mRNA和蛋白相對表達量(0.83±0.32)與對照組(0.81±0.40)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),PRMT5-siRNA組細胞中PRMT5 mRNA(0.21±0.31)和蛋白相對表達量(0.39±0.30)低于對照組和siRNA-NC組(0.41±0.29、0.83±0.32)(P<0.05,圖2)。

    表1 PRMT5表達水平與胃癌臨床特征的關系Tab.1 Relationship between expression level of PRMT5 and clinical features of gastric cancer

    圖2 PRMT5在轉染后細胞中的表達Fig.2 Expression of PRMT5 in cells after transfection

    2.4 沉默PRMT5能抑制人胃癌細胞系SGC-7901增殖

    在12 h時,PRMT5-siRNA組細胞增殖率為(8.01±1.00)%,顯著低于siRNA-NC組的(21.10±2.14)%和對照組的(22.21±2.00)%(圖3)。

    圖3 沉默PRMT5對人胃癌細胞系SGC-7901增殖的影響Fig.3 Effects of silencing PRMT5 on proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901

    2.5 沉默PRMT5能促進胃癌細胞系SGC-7901凋亡

    PRMT5-siRNA組Cleaved caspase 3蛋白相對表達量為0.75±0.04,顯著高于對照組的0.21±0.02和siRNA-NC組的0.22±0.02。12 h時PRMT5-siRNA組細胞凋亡率為(12.21±1.01)%,顯著高于對照組的(2.10±0.10)%和siRNA-NC組的(2.30±0.12)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);24 h時PRMT5-siRNA組細胞凋亡率為(17.25±3.01)%,顯著高于對照組的(4.25±0.89)%和siRNA-NC組的(4.15±0.98)%;48 h時PRMT5-siRNA組細胞凋亡率為(20.89±5.21)%,顯著高于對照組的(5.21±1.02)%和siRNA-NC組的(5.20±1.11)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。

    圖4 沉默PRMT5對人胃癌細胞系SGC-7901凋亡的影響Fig.4 Effects of silencing PRMT5 on apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901

    2.6 PRMT5能抑制人胃癌細胞系SGC-7901遷移和侵襲能力

    PRMT5-siRNA組劃痕愈合率為(42.52±5.32)%,顯著低于對照組的(84.88±7.65)%和siRNA-NC組的(84.25±7.52)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);PRMT5-siRNA組細胞侵襲數(shù)(22.21±1.36)個,顯著低于對照組的(240.69±16.98)個和siRNA-NC組的(241.31±17.52)個,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖5)。

    圖5 沉默PRMT5對人胃癌細胞系SGC-7901遷移能力和侵襲能力的影響Fig.5 Effects of silencing PRMT5 on migration and invasion abilities of human gastric cancer cell line SGC-7901

    2.7 抑制PRMT5的表達對P13K、AKT、p-AKT蛋白水平的影響

    各組細胞轉染后培養(yǎng)48 h,Western blot檢測結果顯示,PRMT 5-siRNA 組P13K、AKT、p-AKT蛋白相對表達分別為0.11±0.02、0.2 1±0.01、0.2 3±0.02,顯著低于對照組(0.22±0.02、0.58±0.06、0.57±0.08)和siRNA-NC 組(0.2 3±0.03、0.58±0.05、0.57±0.07),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖6)。

    圖6 抑制PRMT5的表達對P13K、AKT、p-AKT蛋白水平的影響Fig.6 Effects of PRMT5 inhibition on level of P13K,AKT and p-AKT

    3 討 論

    胃癌惡性程度高,生存率低,預后較差[7]。探討胃癌細胞增殖轉移的病理生理機制對胃癌的預防和治療具有重要意義。PRMT5是一種Ⅱ型蛋白精氨酸甲基轉移酶,它可改變生物的遺傳表觀特性,能阻礙抑癌基因的轉錄,還能調(diào)控細胞周期,促進多種腫瘤細胞異常增殖,與腫瘤的浸潤、轉移密切相關[8-10]。目前國內(nèi)外關于PRMT5與胃癌細胞增殖、凋亡、遷移關系的研究較少。

    基因在癌組織或鄰近正常組織中異常表達,則認為該基因可能具有潛在的調(diào)控癌細胞增殖及凋亡的作用[11-12]。Kanda等[11]研究發(fā)現(xiàn),PRMT5在胃癌組織中高表達,與胃癌的惡性轉移有關。Kong等[13]實驗指出,使用PRMT5抑制劑可抑制胃癌細胞生長。本研究結果顯示,胃癌組織的PRMT5蛋白相對表達量顯著高于癌旁組織。本研究結果與上述研究結果一致,說明PRMT5高表達是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素,可能是潛在調(diào)控胃癌細胞增殖的致癌基因。

    腫瘤分化程度的高低、對周圍組織或器官的侵犯與否、侵犯的程度及淋巴結轉移是評估腫瘤患者病情嚴重程度及預后的重要指標。Kong等[13]研究表明,PRMT5蛋白相對表達量與胃癌患者的TNM分期、遠處轉移、淋巴結轉移密切相關。本研究結果顯示,PRMT5蛋白相對表達量在病理分級、TNM分期更高、有淋巴結轉移的患者中更高。本研究觀點與上述研究觀點一致,提示PRMT5高表達與胃癌的轉移惡化密切相關。

    RNA干擾是指由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA的基因沉默,該技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達,可用于基因功能的探索及惡性腫瘤的基因治療[14-15]。如沉默P27RF-Rho基因可降低肝癌細胞的增殖和侵襲能力[16]。胃癌細胞的增殖分化可通過沉默長鏈非編碼RNAUCA1基因實現(xiàn),可作為腫瘤基因靶向治療的依據(jù)[17]。目前關于沉默PRMT5基因對胃癌增殖、凋亡和遷移影響的研究較少,為進一步研究PRMT5基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,本研究將PRMT5質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉染至胃癌細胞SGC-7901中,結果顯示,通過沉默PRMT5基因表達,可抑制胃癌細胞系SGC-7901的增殖、遷移并促進其凋亡,說明PRMT5促進胃癌的進展,這可能是因為,一方面PRMT5可能通過上調(diào)細胞周期蛋白和相關調(diào)節(jié)因子,加速癌細胞增殖分裂;另一方面,PRMT5可干擾組蛋白精氨酸甲基轉移酶1甲基化轉錄因子E2F1[18],而甲基化的E2F1是細胞凋亡的促進因子。

    細胞凋亡也稱為“固縮壞死”、“程序性細胞死亡”或“細胞自殺”,是由基因介導的一系列的細胞學變化,是存在于細胞中的自毀機制[19]。正常情況下,通過這個過程,機體能清除衰老及異常細胞,并在維持很多細胞功能方面有重要作用,如該過程發(fā)生病理性干擾,腫瘤細胞則會因為存在凋亡缺陷而不斷增殖[20]。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,也是細胞毒性T淋巴細胞殺傷機制的重要組成部分,其主要底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶與DNA修復、基因完整性監(jiān)護有關,能負調(diào)控使Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高,裂解核小體間的DNA,引起細胞凋亡[21-22]。本研究中沉默PRMT5基因后檢測cleaved caspase 3蛋白表達結果顯示,沉默PRMT5能上調(diào)cleaved caspase 3的表達,說明沉默PRMT5的表達導致胃癌細胞系SGC-7901的凋亡率增加可能通過上調(diào)cleaved caspase 3的表達實現(xiàn)。

    PI3K/AKT信號通路是腫瘤形成中至關重要的信號通路。該通路主導細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程,一旦紊亂會導致癌癥、神經(jīng)病變等[23]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,與V-SRC和V-RAS等癌基因的產(chǎn)物相關,且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性,當接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號后,PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基即被募集到臨近質(zhì)膜的部位,使AKT從細胞質(zhì)轉移到細胞膜上,并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2的輔助下,分別使AKT蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點和絲氨酸磷酸化位點磷酸化而使其激活,刺激腫瘤細胞的增殖[24-25]。有研究顯示,胃癌細胞的凋亡可通過抑制PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)[26]。也有文獻指出,胃癌細胞的遷移、侵襲能力降低與影響PI3K/AKT信號通路有關[27]。本研究結果顯示,沉默PRMT5能下調(diào)PI3K、p-AKT蛋白水平,且能降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力,說明PRMT5促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲,抑制其細胞凋亡是通過激活PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)的。

    綜上所述,PRMT5在胃癌組織中表達明顯升高,其表達水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、惡化密切相關,下調(diào)PRMT5的表達可明顯減弱胃癌細胞的增殖、遷移能力,同時促進胃癌細胞的凋亡。

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