濁度法在金黃色葡萄球菌體外藥物敏感性試驗(yàn)及耐藥性分析中的應(yīng)用

高鐸，孔繁雪，韓鐫竹，武鳳嬌，郭玉翠，李欣南*

（1.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧沈陽(yáng)110000；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)117004）

抗生素是目前治療細(xì)菌感染的主要藥物，其出現(xiàn)和使用為人類健康做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)，對(duì)動(dòng)物疾病的預(yù)防與控制作用同樣功不可沒(méi)。但不規(guī)范用藥則會(huì)引發(fā)畜禽的群體性危害，造成獸藥殘留超標(biāo)、產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全等問(wèn)題。為了滿足人類對(duì)動(dòng)物性食品不斷增長(zhǎng)的需求，人們?cè)谛笄蒺B(yǎng)殖過(guò)程中常常大量使用抗生素類藥物來(lái)預(yù)防動(dòng)物性疾病并促進(jìn)生長(zhǎng)?？股氐臍埩羰沟靡恍﹦?dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌常暴露在抗生素環(huán)境中，體內(nèi)的耐藥菌株將會(huì)得到選擇性增殖，使得抗生素的治療效果下降[1-2]。

金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染，是臨床上重要的致病菌，特別是超級(jí)細(xì)菌-耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)及其耐藥性的快速增長(zhǎng)，使其成為全球內(nèi)感染的首要病原菌。金黃色葡萄球菌常引起兩類疾?。海?）化膿性疾病，主要引起動(dòng)物的乳房炎、關(guān)節(jié)炎等，可通過(guò)動(dòng)物傳遞給人類；（2）毒素性疾病，會(huì)引起人和動(dòng)物的中毒性嘔吐等，嚴(yán)重威脅人類的食品安全和公共衛(wèi)生[3-6]。

微生物比濁法能直觀地反應(yīng)抗生素總的抗菌能力[7-8]，因此利用該原理，本文選擇了慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星3種不同類型的藥物，實(shí)時(shí)測(cè)定并繪制時(shí)間-吸光度抑菌生長(zhǎng)曲線，以此分析3種藥物在不同濃度下、不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上與細(xì)菌相互作用的關(guān)系，旨在為藥效學(xué)的研究、解決細(xì)菌耐藥性及指導(dǎo)臨床合理使用抗生素提供數(shù)據(jù)和試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)菌株DX1、XNC22于養(yǎng)殖場(chǎng)中分離獲得。

1.2 儀器

CLASS Ⅱ生物安全柜，購(gòu)自美國(guó)NUAIRE公司；全自動(dòng)高壓滅菌器，購(gòu)自日本三洋電器集團(tuán)；恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自德國(guó)BINDER公司；VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，購(gòu)自BIOMERIEUX公司；WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀，購(gòu)自北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 培養(yǎng)基與材料

抗生素檢定培養(yǎng)基3號(hào)，購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡（GP鑒定卡），購(gòu)自BIOMERIEUX公司；標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI，Clinical and Laboratory Standards Institute ）對(duì)菌懸液濃度的要求[9]，來(lái)稀釋菌懸液。將保存的菌種接種于配制好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出待用，在生物安全柜中，用棉簽取單菌落于裝有0.85%滅菌生理鹽水的安瓿瓶中，用麥?zhǔn)媳葷醿x將試驗(yàn)菌液濃度調(diào)節(jié)為0.5麥?zhǔn)希?.5麥?zhǔn)暇鷳乙旱臐舛燃s為1.5×108cfu/mL），后進(jìn)一步稀釋至5×105cfu/mL，備用。

1.4.2 儲(chǔ)備藥液的制備

將慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解并稀釋成2048μg/mL的抗生素貯存液。配制的藥液以質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC?29213進(jìn)行質(zhì)控，其最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）值在CLSI允許的范圍內(nèi)。

1.4.3 微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)

采用CLSI指定的微量稀釋法，進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)[9]。取稀釋至5×105cfu/mL濃度的菌液0.1mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻使試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的50%，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。將加有菌液和抗菌藥物的板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。觀察記錄結(jié)果，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物溶液的濃度為MIC值。判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，具體見表1，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性為敏感（S），中度敏感（I）或耐藥（R）。

1.4.4 濁度法-體外藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)質(zhì)控菌和試驗(yàn)菌的微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)獲得的MIC值，分別用水稀釋成4個(gè)不同的藥物濃度，備用。向比濁管中按拉丁方排列加入配制好的系列濃度藥物1.00mL，再加入9.00mL適宜濃度的菌懸液，使菌液終濃度為5×105cfu/mL，藥物終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。

表1 金黃色葡萄球菌藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍

表2 不同藥物濃度拉丁方排列方式

將添加有不同濃度藥物、菌液混懸液的比濁管放入到WBS-100微生物比濁法測(cè)定儀中，培養(yǎng)溫度為37℃，監(jiān)測(cè)間隔時(shí)間為30min，監(jiān)測(cè)時(shí)長(zhǎng)為16h，測(cè)定實(shí)時(shí)吸光度。試驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的吸光度值使用Excel繪制其時(shí)間-吸光度抑菌生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

如表3所示，微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)得的MIC結(jié)果與濁度法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著差異，但濁度法試驗(yàn)為實(shí)時(shí)吸光值信號(hào)采集，獲得的結(jié)果可能更接近實(shí)際的MIC值，而通過(guò)時(shí)間-吸光度曲線進(jìn)行MIC終點(diǎn)判讀則更直觀和準(zhǔn)確。

如圖1所示，3種藥物的分離菌株生長(zhǎng)曲線都是前期呈不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，到后期明顯逐漸下降，而質(zhì)控菌株呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，下降趨勢(shì)不明顯；不論是分離菌株還是質(zhì)控菌株，呈現(xiàn)的生長(zhǎng)曲線的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC曲線下面積不同；1/8MIC先于1/4MIC進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，1/4MIC先于1/2MIC進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；紅霉素、慶大霉素的分離菌1/2MIC先于質(zhì)控菌1/2MIC進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；氧氟沙星為快速殺菌劑，其1/2MIC進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較紅霉素和慶大霉素早。紅霉素為時(shí)間依賴型抗生素，其抑菌時(shí)間比慶大霉素和氧氟沙星都要長(zhǎng)。。

通過(guò)紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時(shí)間-抑菌生長(zhǎng)曲線分析，可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，其生長(zhǎng)趨勢(shì)呈現(xiàn)了不同于理論設(shè)想的情況，可能并非是細(xì)菌抑制或殺死其生長(zhǎng)量絕對(duì)值的一半。

表3 3種抗菌藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC

圖1 金黃色葡萄球菌在3種抗菌藥物作用下的時(shí)間-吸光度曲線

圖2 質(zhì)控菌株ATCC29213在3種抗菌藥物作用下的時(shí)間-吸光度曲線

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，亞抑菌濃度下細(xì)菌耐藥基因的水平傳播可能性增加，突變株數(shù)量大于野生株數(shù)量，還會(huì)形成生物膜，這些都可導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，而亞抑菌濃度的藥物壓力下，耐藥菌株還會(huì)被選擇性富集，因此亞抑菌濃度下細(xì)菌與藥物的作用關(guān)系很有研究?jī)r(jià)值[10-12]。不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較低濃度藥物有一定的延遲，目前還不明確金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度下是否會(huì)蓄積不同耐藥機(jī)制的耐藥菌株，即藥物壓力下快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期的細(xì)菌可能為獲得耐藥性的細(xì)菌。但也有研究證實(shí)，發(fā)生突變的高水平耐藥菌的適應(yīng)性與其親本株相比大多數(shù)出現(xiàn)適應(yīng)性下降[13]；耐藥金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后減小的趨勢(shì)；濁度法下的時(shí)間-抑菌生長(zhǎng)曲線可清楚地對(duì)不同依賴型藥物的抑菌殺菌時(shí)間進(jìn)行可視化判定，慶大霉素、氧氟沙星為濃度依賴型，可見不同藥物濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖影響較大，而紅霉素為時(shí)間依賴型，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同藥物濃度的抑菌時(shí)間均比慶大霉素、氧氟沙星長(zhǎng)，提示時(shí)間依賴型藥物的抑菌時(shí)間均比濃度依賴型藥物長(zhǎng)。

濁度法較微量稀釋法比較具有5點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：（1）濁度法可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，測(cè)定其實(shí)時(shí)吸光值，反映金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)，微量稀釋法只能在第2 d觀察結(jié)果；（2）濁度法可以使用現(xiàn)有的濁度分析儀，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集；（3）濁度法結(jié)合振搖培養(yǎng)，保證了藥物與細(xì)菌的充分作用；（4）濁度法終點(diǎn)判讀時(shí)更直觀；（5）濁度法可清楚地對(duì)不同依賴型藥物的抑菌殺菌時(shí)間進(jìn)行可視化判定。

通過(guò)紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時(shí)間-抑菌生長(zhǎng)曲線分析，金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，可能并非是細(xì)菌抑制或殺死其生長(zhǎng)量絕對(duì)值的一半；不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較低濃度藥物有一定的延遲；耐藥金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后減小的趨勢(shì)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同藥物濃度的紅霉素抑菌時(shí)間均比慶大霉素、氧氟沙星長(zhǎng)。