響應(yīng)面分析法優(yōu)化吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的超聲提取工藝

謝妍龍，李敏

（江西省醫(yī)藥學(xué)校，江西南昌 330200）

中藥吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸及其變種石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實[1]。其主要成分有生物堿、苦味素、揮發(fā)油、萜類、黃酮、香豆精、甾體和木脂素多糖等，其中生物堿和檸檬苦味素為主要有效成分，而吳茱萸堿（Evodiamine，Evo）和吳茱萸次堿（Rutaecarpine，Rut）是含量較多的生物堿[2]。吳茱萸堿具有抗腫瘤、強心、降壓、舒張血管、抗炎、鎮(zhèn)痛及減肥等藥理作用[3-6]，吳茱萸次堿歸屬于喹唑啉酮咔啉類生物堿，具有廣泛的藥理作用，可以降血壓、松弛血管、抗傷害感染、抗血小板聚集及抗缺氧，還可用于利尿、發(fā)汗、強心、抗炎鎮(zhèn)痛及抗癌等方面[6-10]。

通過試驗比較了傳統(tǒng)和現(xiàn)代輔助提取技術(shù)，對吳茱萸生物堿的提取條件進行了深入考察分析，研究在提取過程中目數(shù)、超聲功率、提取時間、提取溫度和液固比等對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對超聲波提取影響因素進行優(yōu)化，得出吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：藥材吳茱萸，購于江西藥都樟樹天齊堂中藥飲片有限公司。

試劑：蒸餾水（用于分析）、二次蒸餾水（用于色譜分析）為自制；石油醚、乙酸乙酯，95%乙醇、甲醇、甲醇（色譜純）購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯仿、乙腈（色譜純）購于西隴化工股份有限公司；吳茱萸堿標(biāo)準(zhǔn)品、吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品購于陜西森弗生物技術(shù)有限公司。

儀器：FZ102型微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；RES2CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；KW-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器廠）；KDC-160HR高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（Agilent儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

前處理：吳茱萸經(jīng)過干燥、粉碎后分別過20目、40目、60目、80目和100目篩，得到20～40目、40～60目、60～80目、80～100目以及大于100目的5個等級粒度，分別記作20目、40目、60目、80目、100目粒度的吳茱萸。然后用10∶1的石油醚超聲（40 min、40 ℃、420 W功率）脫脂，反復(fù)8次，干燥后備用[11]。

提取流程：取脫脂干燥后的吳茱萸粉末1.0 g置于50 mL的離心管中，加入適量的溶劑，稱重，在一定的條件下超聲提取，補充溶劑至提取前重量，然后離心取上清液，用注射器抽取一定量的上清液，過0.45 μm的濾膜，用高效液相色譜儀檢測含量，計算得出提取率。

1.2.2 吳茱萸堿和吳茱萸次堿HPLC測定的色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶乙腈∶水=20∶38∶42；流速：1.0 mL/min；檢測波長：225 nm；柱溫：25 ℃[12-14]。

采用Agilent 1100 Series高效液相色譜儀測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿標(biāo)準(zhǔn)品時得到兩者的紫外吸收圖譜，如圖1所示。

圖1 吳茱萸堿（a）和吳茱萸次堿（b）標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收圖譜

1.2.3 Evo和Rut標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[15]

精密稱定Evo標(biāo)準(zhǔn)品89.5 mg和Rut標(biāo)準(zhǔn)品7 4.0 mg，加甲醇定容至200 mL的容量瓶中，搖勻，取5 mL稀釋10倍至50 mL容量瓶中，配成Evo濃度為44.75 mg/L、Rut濃度為37.00 mg/L的對照品溶液，分別進樣 1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL 和5.0 μL，每個樣重復(fù)3次，進行HPLC分析。記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Evo回歸曲線y=7 900.3x-13.38，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性范圍為0.044～0.224 μg；Rut回歸曲線y=4 965.7x-8.41，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性范圍為 0.037～0.185 μg。

1.2.4 單因素實驗

分別以不同的溶劑、原料目數(shù)、液固比、超聲波功率、提取時間以及提取溫度為單因素進行試驗，考察各單因素對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取得率的影響，提取次數(shù)均為1次。

1.2.5 Box-Behnken試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，從6個單因素實驗結(jié)果中選取對提取過程影響較大的3個因素，采用經(jīng)典的三水平三因素Box-Behnken試驗設(shè)計來優(yōu)化這3個因素[16-17]，以Evo和Rut提取率之和為指標(biāo)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 溶劑的選擇

分別選取氯仿、乙醇、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑，取20目脫脂后的吳茱萸在液固比30∶1，溫度40 ℃、功率420 W條件下超聲提取30 min，然后用高效液相色譜儀檢測含量，計算出得率，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出吳茱萸堿在乙醇溶劑中的提取率最高；吳茱萸次堿在甲醇溶劑中的提取率最高。對吳茱萸堿而言，乙醇提取率比甲醇提取率高0.48%，對吳茱萸次堿而言，甲醇提取率比乙醇提取率高1.00%；若以吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率總和作為指標(biāo)，甲醇的提取率最高。這與筆者以前測定的溶解度數(shù)據(jù)[18-19]不相符，可能有兩個原因：（1）超聲波能夠降解氯仿[20-21]；（2）在提取過程中，吳茱萸中的其他成分也會被提取出來，并且與氯仿和乙酸乙酯發(fā)生相互作用，從而使其溶解吳茱萸堿和吳茱萸次堿的量減少，導(dǎo)致提取得率低。故選擇甲醇作為提取溶劑，提取效果好。

圖2 溶劑對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

2.1.2 原料目數(shù)的影響

分別選取脫脂后20目、40目、60目、80目和100目的吳茱萸，以甲醇為溶劑在液固比30∶1、溫度40 ℃、功率420 W條件下超聲提取30 min，然后用高效液相色譜儀檢測含量，計算出得率，結(jié)果如圖3所示。不同目數(shù)對Evo和Rut提取率影響規(guī)律不同。Evo呈U型變化，兩頭高中間低，較高提取率的目數(shù)為20和100目；Rut的變化規(guī)律呈波浪形變化，即波峰波谷交替，最高提取率為60目；兩者提取率之和為斜下的波浪形，最高提取率是20目。猜想造成此結(jié)果的原因是脫脂過程反復(fù)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿長時間超聲過程中呈游離狀態(tài)損失，粒度越小，損失量就越多。為驗證猜想的正確性，增設(shè)脫脂前目數(shù)對生物堿提取率影響實驗，結(jié)果如圖4所示，目數(shù)越大提取率越高，脫脂過程影響提取率，與上述分析吻合。故選取20目為單因素的最佳提取目數(shù)。

圖3 目數(shù)對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

圖4 脫脂前目數(shù)對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

2.1.3 液固比的影響

選取脫脂后20目的吳茱萸，分別以液固比為20∶ 1、30∶ 1、40∶1、50∶1、60∶1，以甲醇為溶劑在溫度40 ℃、功率420 W條件下超聲提取30 min，然后用高效液相色譜儀檢測含量，計算出得率，結(jié)果如圖5所示。Evo和Rut提取率總和變化趨勢為：隨著液固比增大，提取率逐漸升高，在50∶1的液固比條件下達到最高，隨后60∶1的液固比提取率略有下降。這是由于溶劑的用量越大，有效成分在植物組織與溶液本體之間的濃度差就越大，越有利于傳質(zhì)的進行，但當(dāng)溶劑用量達到一定程度后，提取率增加緩慢或略有減少，可能的原因是溶劑過多吸收大量的超聲波能量，使得超聲波到達固體基質(zhì)時衰減至很弱。根據(jù)實驗結(jié)果，50∶1（mL/g）為單因素的最佳液固比。

圖5 液固比對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

2.1.4 提取溫度的影響

選取脫脂后20目的吳茱萸0.5 g，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃溫度下，以甲醇為溶劑、液固比50∶1、功率420 W的條件超聲提取30 min，然后用高效液相色譜儀檢測含量，計算出得率，結(jié)果如圖6所示。由圖可知，隨溫度的提高，Evo和Rut的提取率升高，但升高至50 ℃后，隨著溫度的升高，提取率下降。這是由于兩者在溫度高于60 ℃時不穩(wěn)定，溫度大于60 ℃，Evo和Rut的提取率下降。故選取50 ℃為單因素的最佳提取溫度。

圖6 提取溫度對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

2.1.5 超聲功率的影響

選取脫脂后20目的吳茱萸0.5 g，分別在超聲功率為300 W、360 W、420 W、480 W、540 W，以甲醇為溶劑、液固比50∶1、50 ℃為條件提取30 min，然后用高效液相色譜儀檢測含量，計算出得率，結(jié)果如圖7所示。隨著功率的增大，Evo和Rut的提取率逐漸增大，在功率達到420 W時，兩者的提取率達到最大，隨后減小。圖8為吳茱萸脫脂后及超聲提取后的掃描電鏡圖，由圖可知，超聲后吳茱萸細胞均被破壞，故超聲功率太大導(dǎo)致提取率反而降低的原因可能是超聲波空化作用和機械作用有利于吳茱萸堿和吳茱萸次堿的溶出，但若功率太大，Evo和Rut很快達到溶解平衡點，其他雜質(zhì)成分溶出也越多，阻礙了Evo和Rut的溶出。故選擇功率420 W為單因素的最佳超聲功率。

圖7 超聲功率對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

圖8 吳茱萸的掃面電鏡圖（SEM）

2.1.6 提取時間的影響

選取脫脂后20目的吳茱萸0.5 g，以液固比為50∶1（mL/g），提取溫度50 ℃，超聲功率為420 W為條件，分別用超聲波提取20 min、30 min、40 min、50 min和60 min。然后用高效液相色譜儀檢測含量，計算出得率，結(jié)果如圖9所示。隨著提取時間的增加，Evo和Rut的提取率逐漸增大，在50 min達到最高，60 min提取率略有下降。這是因為隨著時間的增長，Evo和Rut溶解出越多，直到提取時間為50 min左右，溶劑內(nèi)生物堿有效成分基本達到平衡，隨著提取時間的增加，吳茱萸其他黏性雜質(zhì)（如多糖成分）溶出，將Evo和Rut粘在吳茱萸固體基質(zhì)上，從而提取率略有下降。故選取50 min為單因素的最佳提取溫度。

圖9 提取時間對吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率的影響

2.2 響應(yīng)面法實驗設(shè)計和實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

從5個單因素實驗結(jié)果中選取對提取過程影響較大的3個因素：提取溫度、提取時間、液固比。采用經(jīng)典的三水平三因素Box-Behnken試驗設(shè)計來優(yōu)化這三個因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，精密稱取20目脫脂后的吳茱萸粉末0.5 g置于50 mL離心管中，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、液固比（C）在超聲功率420 W條件下對吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取工藝進行優(yōu)化，以Evo和Rut提取率之和為指標(biāo)進行分析。具體實驗方案見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

利用Design-Expert軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為：

模型方差分析結(jié)果和各項系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果列于表2。

表2 回歸模型各項方差分析

由表2可知，模型的F=8.19、P=0.0161＜0.05，說明實驗所采用的二次模型是很顯著的?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。PA、PB、PA2、PB2、PC2均小于0.05，說明提取溫度、提取時間以及3個因素的二次項都具有顯著影響；而液固比和他們的交互項及缺失項顯著性較差，也說明三者的交互作用不大。決定因素R2=0.936 5，也說明模型能夠很好地反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。由各P值可見，提取溫度和提取時間影響高度顯著，而液固比較不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序，其順序為提取溫度＞提取時間＞液固比。

2.2.2 響應(yīng)面分析及最優(yōu)提取工藝參數(shù)的確定

運用Design-Expert軟件分析處理實驗所得數(shù)據(jù)，對提取率有交互影響的響應(yīng)面分析立體曲面圖見圖10。由圖可知，當(dāng)提取時間和液固比都固定時，提取率隨提取溫度的變化幅度較大；當(dāng)提取溫度和液固比固定時，而提取率隨著提取時間變化幅度也比較大；當(dāng)提取時間和提取溫度固定時，提取率隨著液固比變化幅度較小，所以，提取溫度和提取時間對提取率的影響都較為顯著。通過最優(yōu)化分析，最佳的提取條件為提取溫度50.77 ℃、提取時間52.19 min、液固比50.73∶1（mL/g），預(yù)測提取率為2.529 mg/L。但考慮到實際操作的局限性，將吳茱萸生物堿的提取工藝修正為提取溫度51 ℃、提取時間52 min、液固比51∶1（mL/g）。

3 驗證試驗

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳提取條件：提取溫度51 ℃、提取時間52 min、液固比51∶1（mL/g）下提取，實驗得出Evo和Rut的最大提取率之和為2.456 mg/g，與理論值2.529 mg/g相比相對誤差為2.88%，相差不顯著。這說明模擬方程與實際情況符合得很好，響應(yīng)面法能較好地對影響吳茱萸生物堿的超聲提取工藝進行回歸分析和條件優(yōu)化。

4 結(jié)論

Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面（RSM）分析法建立吳茱萸中Evo和Rut提取工藝中提取溫度、提取時間和液料比與總得率之間的回歸模型，通過檢驗?zāi)Ｐ惋@著，可用于生產(chǎn)預(yù)測。實驗得到的吳茱萸中Evo和Rut的提取最佳工藝參數(shù)為：溶劑為甲醇、目數(shù)為20目、超聲功率為420 W、提取溫度為51 ℃、提取時間為52 min、液固比為51∶1（mL/g），提取率預(yù)測值為2.529 mg/g，驗證值為2.456 mg/g，與預(yù)測值的相對誤差為2.88%。