‘粉蝶’胡枝子主要抗氧化物質(zhì)含量與提取方法

乞心宇 ,楊曉紅,2* ,邵聰敏 ,胡亞梅

(1.北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206；2.北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能 提升協(xié)同創(chuàng)新中心,北京 102206)

‘粉蝶’胡枝子為豆科胡枝子屬新品種，具有花量多、花朵較大、植株粗壯、育性下降，幾乎不結(jié)實(shí)等特性。該品種觀賞性強(qiáng)，抗逆性優(yōu)良，可用于園林觀賞、水土保持、動(dòng)物飼料、醫(yī)療保健等多個(gè)方面。近些年來(lái)，危害人類健康的疾病主要有心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等，這些疾病雖然病因復(fù)雜，但與人體內(nèi)自由基的過(guò)量存在有著一定的關(guān)系，而過(guò)量的自由基能夠引發(fā)機(jī)體過(guò)氧化和脂質(zhì)代謝異常進(jìn)而導(dǎo)致人體各種疾病的發(fā)生[1]。研究表明，一些營(yíng)養(yǎng)元素和抗氧化物質(zhì)可以清除自由基[2-4]。例如，植物中的多酚類、黃酮類化合物、維生素C、維生素E等都具有一定的抗氧化作用，均能有效清除自由基以保護(hù)人體健康[5]。

胡枝子別名行軍茶，以胡枝子為茶在中國(guó)有悠久的歷史。據(jù)《中華本草》[6]中記載，胡枝子的枝葉具有清熱潤(rùn)肺、利尿通淋、止血的功效。經(jīng)研究，胡枝子可分離出4個(gè)黃酮類化合物和3個(gè)酚酸類化合物[7]，從中提取出的黃酮類、多酚類物質(zhì)均是醫(yī)藥保健產(chǎn)品中的重要成分，而這類物質(zhì)的測(cè)定是要在一定的浸提劑種類和浸提方式下完成的[8-9]。鑒于‘粉蝶’胡枝子是從胡枝子中選育出的新品種，具有一定的藥用價(jià)值和開(kāi)發(fā)保健產(chǎn)品的可能。為了了解‘粉蝶’胡枝子的醫(yī)藥保健價(jià)值，本文以‘粉蝶’胡枝子的芽、嫩莖、葉為研究材料，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各組織中的維生素C、總黃酮、總多酚、原花青素這些抗氧化物質(zhì)含量，同時(shí)研究不同的浸提劑和浸提方式下的總黃酮、總多酚的含量，期望為胡枝子保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為北京農(nóng)學(xué)院培育出的胡枝子新品種‘粉蝶’，栽植于北京農(nóng)學(xué)院胡枝子基地。于2019年5至6月采集發(fā)育成熟葉片及枝條頂芽、未木質(zhì)化的嫩莖。除維生素C 測(cè)定用鮮樣外，其他測(cè)定樣品均是將材料置于70 ℃烘干，用粉碎機(jī)打磨成粉，過(guò)0.355 mm細(xì)篩后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 維生素C測(cè)定 采用紫外分光光度法，參照李軍[10]的方法進(jìn)行操作，243 nm 處測(cè)定吸光值。維生素C標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相應(yīng)的吸光值的回歸方程y=25.175x+ 0.6439(R2=0.9991)，其中x為吸光度(A)，y為濃度。

1.2.2 黃酮、多酚含量測(cè)定

1)材料制備。稱取粉碎過(guò)篩的干粉0.5 g左右，倒入試管中，設(shè)置浸提劑為：95～98 ℃的熱水(浸提過(guò)程中自然冷卻)、75%乙醇、100%乙醇、100%甲醇；浸提方法為：①加入20 mL浸提液，超聲提取60 min,離心10 min，分離上清液，殘?jiān)俅渭尤?0 mL浸提液，超聲提取60 min,離心10 min，分離上清液。合并2次上清液，定容到40 mL。②加入40 mL浸提液，靜置14 h，離心10 min，分離上清液，定容到40 mL。③加入40 mL浸提液，120～130 r/min震蕩14 h，離心10 min，分離上清液，定容到40 mL。

2)總黃酮含量采用NaNO2-AlCl3-NaOH方法[11]，以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，510 nm 處測(cè)其吸光度。槲皮素當(dāng)量濃度與吸光值的回歸方程y=591.41x-5.676(R2=0.999 4)，其中x為吸光值，y為濃度。

3)總多酚含量采用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定[12]。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，765 nm下測(cè)吸光值，沒(méi)食子酸當(dāng)量濃度與吸光值的回歸方程y= 1.723 8x-0.028 3(R2=0.999)，其中x為吸光值，y為濃度。

1.2.4 原花青素測(cè)定 采用香草醛鹽酸法[13]，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，500 nm處測(cè)定吸光值。樣品原花青素含量回歸方程y= 0.100 6x-0.005 7(R2=0.999)。其中x為吸光值，y為濃度。樣品粉末先加入正己烷，室溫震蕩脫脂24 h，將濾渣風(fēng)干后再用于原花青素測(cè)定。

原花青素含量(mg/g)= 標(biāo)準(zhǔn)線查出的濃度值×定容倍數(shù)÷樣品質(zhì)量。

以上所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Microsoft excel及DPS軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果分析

2.1 浸提劑種類對(duì)‘粉蝶’胡枝子總黃酮和總多酚的影響

4種浸提劑對(duì)‘粉蝶’胡枝子葉、芽、莖中黃酮和多酚測(cè)定有一定的影響(表1)。75%乙醇為浸提劑時(shí)，樣品中的總黃酮、總多酚測(cè)定值最高，100%的甲醇、95～98 ℃熱水也能比較好地浸提出樣品中的黃酮、多酚。以100%乙醇為浸提劑時(shí)，總黃酮、總多酚測(cè)定值最低，且與其他浸提劑的測(cè)定值存在顯著性差異。對(duì)于‘粉蝶’胡枝子葉、芽、莖，當(dāng)以熱水為浸提劑時(shí)，其總黃酮測(cè)定值可達(dá)到最佳浸提劑(75%乙醇)的68.0%～96.4%，其總多酚測(cè)定值能夠達(dá)到最佳浸提劑的57.8%～91.7%。

表1 浸提劑種類對(duì)葉中黃酮和多酚的影響Tab.1 Effect of different extractants on total flavonoid cotent and total polyphenol content of leaves

觀察值均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同列不同字母表示差異顯著 (顯著性水平P<0.05)

The dataare expressed as the mean ± standard deviation. The different letters indicate significant difference among different treaments (P<0.05)

2.2 浸提方式對(duì)‘粉蝶’胡枝子總黃酮和總多酚的影響

2種浸提劑在3種浸提方式下葉中的總黃酮、總多酚含量(表2)結(jié)果顯示，超聲波與震蕩14 h對(duì)總黃酮、總多酚的測(cè)定結(jié)果比較好，而靜置處理方式對(duì)總黃酮、總多酚測(cè)定效果較差。靜置處理與超聲波、震蕩14 h處理之間差異顯著。靜置處理的測(cè)定值可達(dá)到其他處理方式的56%以上，表明即使用熱水浸泡自然冷卻靜置14 h，也能夠溶解出葉片中較多的黃酮、多酚物質(zhì)。在總黃酮測(cè)定值上，震蕩14 h的測(cè)定值最高，比超聲波處理2 h的測(cè)定值高了10.2%～19.7%，但是震蕩14 h處理與超聲波處理之間不存在顯著性差異。在總多酚測(cè)定方面，當(dāng)以95～98 ℃熱水為浸提劑時(shí)，震蕩14 h的測(cè)定值比超聲波處理2 h的測(cè)定值盡管高了12.0%，但是兩種處理之間也不存在顯著性差異；而以75%乙醇為浸提劑時(shí)，震蕩14 h的測(cè)定值比超聲波處理2 h的測(cè)定值則低了32.5%，且這2種處理方式之間存在顯著性差異。

表2 浸提方式對(duì)葉中的黃酮、多酚測(cè)定影響Tab.2 The effects of different extraction methods on total flavonoid content and total polyphenol content of leaves

2.3 材料處理方式對(duì)原花青素含量測(cè)定影響

從表3可見(jiàn)，芽、葉、嫩莖脫脂后再進(jìn)行測(cè)定，其測(cè)定值顯著高于材料未脫脂直接測(cè)定數(shù)值。對(duì)2種處理方式下測(cè)得的原花青素含量進(jìn)行配對(duì)2個(gè)處理t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果表明兩者之間存在顯著性差異。在2種處理方式下，芽、葉、嫩莖中的原花青素含量均表現(xiàn)為葉中最高，其次為芽，嫩莖中最低，且不同器官中的原花青素含量存在顯著性差異。

表3 材料處理對(duì)原花青素含量測(cè)定影響Tab.3 Effect of material treatment methods on the procyanidin content

2.4 ‘粉蝶’胡枝子不同組織的主要抗氧化物質(zhì)含量

由測(cè)定結(jié)果(表3、表4)可見(jiàn)，‘粉蝶’胡枝子的葉、芽、嫩莖中的維生素C、總黃酮、總酚、原花青素含量存在顯著性差異。在維生素C、總黃酮、總酚、原花青素含量方面，均表現(xiàn)為葉中最高，其次為芽，嫩莖中最低。從表4的測(cè)定值可見(jiàn)，每100 g新鮮葉片中的維生素C含量平均為136.97 mg，嫩莖中也有約63 mg，表明‘粉蝶’胡枝子富含維生素C。這些結(jié)果也顯示出‘粉蝶’胡枝子每克干物質(zhì)中含有豐富的黃酮、多酚、原花青素這些抗氧化物質(zhì)。

表4 ‘粉蝶’胡枝子不同器官中的抗氧化物質(zhì)含量Tab.4 The contents antioxidants in different organs of L.bicolor ‘Fendie’

3 結(jié)論與討論

研究‘粉蝶’胡枝子中的一些抗氧化物質(zhì)的含量，對(duì)促進(jìn)其生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。維生素C是高效抗氧化劑，可減輕維生素C過(guò)氧化物酶的氧化反應(yīng)[14]。黃酮是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物，也是許多中草藥的有效藥用成分，具有十分顯著的抗氧化活性[15-16]。多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜多元酚類化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗過(guò)敏等多種作用[17-18]。原花青素是被公認(rèn)為清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑，其抗氧化和清除自由基的能力是維生素E的50倍,維生素C的20倍[19-20]。本次對(duì)‘粉蝶’胡枝子葉、芽、嫩莖的新鮮材料進(jìn)行維生素C測(cè)定，對(duì)其烘干粉末進(jìn)行總黃酮、總多酚、原花青素測(cè)定，結(jié)果表明不同器官中這4類抗氧化物質(zhì)含量存在顯著性差異，且以葉中的含量最高。在嫩莖中，這些物質(zhì)的含量則是3種組織中最低的，其維生素C、總黃酮、總多酚、原花青素含量不足葉中的一半。通過(guò)本次測(cè)定，得出其葉中維生素C含量為136.97 mg/100 g，芽中維生素C含量為88.105 mg/100 g，這些測(cè)定值高于臍橙的53.01 mg/100 g，甜椒的62.1～63.2 mg/100 g[21]。最優(yōu)方式下的總黃酮的測(cè)定值在葉片中為49.3 mg/g，這與吳洪新等[22]對(duì)二色胡枝子葉片總黃酮提取研究中得到的最優(yōu)狀態(tài)下提取率為4%的研究結(jié)果比較接近，表明測(cè)定結(jié)果比較可靠。從這4種物質(zhì)含量上看，‘粉蝶’胡枝子的葉、芽具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

在植物體內(nèi)，黃酮類化合物主要形態(tài)為苷類，少部分為苷元。黃酮苷元易溶于甲醇、乙醇、乙醚和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑或稀堿液，但通常不溶于水。而黃酮苷則與水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯等溶劑有著較好的親和性[23]。絕大多數(shù)的多酚物質(zhì)為水溶性物質(zhì)，存在于細(xì)胞的液泡中。已知的茶多酚、葡萄多酚、蘋果多酚可用水、乙醇、甲醇作為溶劑。在多酚的有機(jī)萃取中，常用的溶劑有乙醇、甲醇、石油醚、丙酮等[16]。在黃酮、多酚的提取中，廣泛使用的方法除了有機(jī)劑萃取法外，還有超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、生物酶解萃取法，等等[16，23]。本研究以100%乙醇、100%甲醇、75%乙醇、95～98 ℃熱水(熱水浸泡后自然冷卻)為浸提劑，研究不同提取劑對(duì)芽、葉、莖總黃酮、總多酚測(cè)定的影響，結(jié)果顯示出75%的乙醇有良好的浸提效果，而100%乙醇的浸提效果反而不如甲醇與熱水。表明黃酮、多酚測(cè)定中提取劑種類影響測(cè)定結(jié)果，這與春花胡枝子的研究結(jié)論相同[24]。本次研究采用超聲波處理2 h，震蕩14 h，靜置14 h這3種浸提方式，結(jié)果顯示出使用75%乙醇或熱水作為溶劑時(shí)，超聲波處理2 h與震蕩14 h對(duì)葉中總黃酮、總多酚的測(cè)定結(jié)果基本不存在顯著性差異(以75%乙醇為溶劑的總多酚測(cè)定結(jié)果例外)；而采用靜置處14 h，其總黃酮、總多酚的測(cè)定值最低。表明 ‘粉蝶’胡枝子總黃酮、總多酚測(cè)定受試驗(yàn)中使用的溶劑類型及浸提方式的影響。

原花青素溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等溶劑，有很強(qiáng)的生物活性，如抗氧化活性、防治心血管疾病、抗癌、抗高血壓、降血脂、降血糖等[25-26]。原花青素的提取和測(cè)定要對(duì)原材料進(jìn)行脫脂處理，常用正己烷、石油醚等進(jìn)行脫脂處理[27-28]。為了了解材料是否脫脂對(duì)原花青素測(cè)定的影響，本研究對(duì)‘粉蝶’胡枝子的葉、芽、嫩莖的烘干粉末進(jìn)行了正己烷脫脂處理和未脫脂處理，再采用香草醛法測(cè)定材料中的原花青素含量，結(jié)果顯示出3種材料脫脂后的原花青素含量測(cè)定值顯著高于未脫脂材料的測(cè)定值，表明材料是否脫脂確實(shí)影響原花青素測(cè)定結(jié)果。對(duì)于‘粉蝶’胡枝子葉、芽、莖的原花青素含量，表現(xiàn)為葉>芽>嫩莖。

總之，本項(xiàng)研究表明在抗氧化物質(zhì)測(cè)定中，原材料處理方式影響測(cè)定結(jié)果，植物器官不同，抗氧化物質(zhì)含量不同，‘粉蝶’胡枝子的葉、芽具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值。