缺氧誘導因子-1蛋白在犬乳腺腫瘤中的表達及其臨床意義

伍怡佳，姚 華,范玉華

(北京農(nóng)學院 動物科學技術學院，北京 102206)

隨著動物醫(yī)療的發(fā)展，寵物犬老年疾病的患病率和診斷需求也不斷增加。乳腺腫瘤是母犬最常見的腫瘤，在9至11歲的老齡母犬群體中多發(fā)，其發(fā)病率占母犬腫瘤數(shù)量的50%，犬的惡性乳腺腫瘤較為常見[1]，發(fā)病率與死亡率都非常高。因此，需要有效的檢測手段。

缺氧誘導因子-1(HIF-1)在醫(yī)學臨床上已被公認為重要的癌癥藥物靶標，其最初是作為一種生物O2傳感器被發(fā)現(xiàn)，可使機體適應缺氧狀態(tài)。HIF-1是一個異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基組成，(或其類似物 HIF-2α和 HIF-3α)。其中，HIF-1α是氧敏感亞基，在低氧條件下誘導其發(fā)生表達[2-4]。

本試驗檢測缺氧誘導因子(HIF-1α)在犬乳腺腫瘤組織中的表達，分析其與犬乳腺腫瘤性質(zhì)的關系，探明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

2017—2019年間在北京市多家寵物醫(yī)院收集疑似犬乳腺腫瘤樣本20例，并經(jīng)獸醫(yī)師和寵物主人同意后用于試驗研究。

1.2 主要試劑

DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)、兔二步法檢測試劑盒(PV-9001)、兔抗人缺氧誘導因子-1α單克隆抗體(ZA-0552)、免疫組化抗原修復緩沖液(EDTA抗原修復液pH 8.0)均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。分析純酒精、分析純二甲苯及PBS均購自北京試劑公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病理組織學觀察 將疑似犬乳腺腫瘤樣本在4%多聚甲醛中固定24 h，之后切成1 cm3的小塊放入包埋盒中流水沖洗6～8 h，隨后進行脫水、浸蠟及包埋處理，制成蠟塊。使用病理切片機將蠟塊切成4 μm的薄片后進行病理組織學鑒定和免疫組織化學實驗。通過世界衛(wèi)生組織的標準對其進行分類，判定其腫瘤的性質(zhì)。

1.3.2 免疫組織化學方法 制作石蠟切片，載玻片使用陽離子防脫片。將4 μm的薄片進行脫蠟水化后，用PBS洗3次，每次3 min。在高壓鍋內(nèi)進行抗原修復，冷卻后用PBS洗3次，每次3 min。加入內(nèi)源性過氧化物阻斷酶，避光反應12 min后，用PBS洗3次，每次3 min。加入一抗，4 ℃過夜，復溫后37 ℃烘箱反應1 h。用PBS單獨沖洗一抗，防止污染陰性對照。加入反應增強液，37 ℃烘箱反應20 min，用PBS洗3次，每次3 min。加入增強酶標山羊抗兔IgG聚合物，37 ℃烘箱反應20 min，用PBS洗3次，每次3 min。最后DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明后用中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。HIF-1蛋白的陽性部位在細胞核和細胞質(zhì)，顯微鏡下以清晰的有棕黃色、黃色的顆粒為有HIF-1蛋白的表達。

1.4 統(tǒng)計分析

采用 SPSS20 軟件進行數(shù)據(jù)處理，選用 fisher’s 精確檢驗法、Pearson 相關性分析對 HIF-1α蛋白在良性腫瘤組與惡性腫瘤組之間的表達情況進行差異性檢驗。若P<0.05 表示 HIF-1α在不同性質(zhì)的犬乳腺腫瘤中表達存在顯著差異，并且差異性具有統(tǒng)計學意義；若P>0.05 表示差異不顯著，沒有統(tǒng)計學意義。

選取細胞計數(shù)比對[5-6]。HIF-1α以胞漿和胞核中出現(xiàn)清晰的黃色或黃褐色顆粒為陽性染色。其陽性結果判斷：陽性細胞數(shù)<5%為“-”，5%～25%為“+”；陽性細胞數(shù) 26%～50%為 “++”；陽性細胞數(shù) 51%～75%為“+++”；陽性細胞數(shù)>75%為“++++”。

2 結 果

2.1 腫瘤性質(zhì)的病理組織學分析

收集到疑似犬乳腺腫瘤病例20 例，經(jīng)病理組織學觀察得出良性乳腺腫瘤6 例，占犬乳腺腫瘤病例的30%；惡性乳腺腫瘤14例，占全部病例數(shù)的70%?？梢姡瑦盒阅[瘤的發(fā)病率超過良性乳腺腫瘤，應引起臨床獸醫(yī)的高度關注。

本試驗將所收集病例進行組織學分型，結果見表1。

表1 不同乳腺腫瘤組織學特點Tab.1 Histological characteristics of different breast tumors

圖1為犬浸潤性導管癌組織切片分別為 HE 染色在 4 倍鏡、40 倍鏡下的圖像。圖 1組織結構紊亂，伴有部分出血壞死的特征，乳腺導管結構不完整，間質(zhì)內(nèi)存在大量同質(zhì)細胞。其中可清晰地看到腫瘤細胞胞質(zhì)嗜酸，胞核部分有分裂象。而良性腫瘤組織分化好、異型性小，基本無或者很少可見病理核分裂象。

圖1 浸潤性導管癌病理切片F(xiàn)ig.1 Pathological section of invasive ductal carcinoma

2.2 HIF-1蛋白在犬乳腺腫瘤中的表達

如表 2 所示，對 HIF-1α蛋白在良性腫瘤組與惡性腫瘤組之間的表達情況進行差異性檢驗，檢驗結果P<0.05，表示 HIF-1α在不同性質(zhì)的犬乳腺腫瘤中表達存在顯著差異，且差異性具有統(tǒng)計學意義。因此，犬惡性乳腺腫瘤中 HIF-1α的表達顯著高于良性乳腺腫瘤，陽性表達率為85.7%。

表2 犬乳腺腫瘤組織中 HIF-1α蛋白的表達

Tab.2 Expression of HIF-1α protein in canine mammary tumor tissues

將本試驗的20例犬乳腺腫瘤樣本進行定量分析，結果見表3。圖2分別從4倍鏡、10倍鏡、40倍鏡下展示了 HIF-1α在浸潤性導管癌組織中陰性和陽性的表達。從圖中可以看出，HIF-1α的陽性表達在腫瘤細胞的胞核和胞漿中，呈現(xiàn)典型的黃色甚至黃褐色。

表3 HIF-1α在犬乳腺腫瘤中的定量分析統(tǒng)計

Tab.3 Quantitative analysis and statistics of HIF-1α in canine breast tumors

圖2 不同倍鏡下的浸潤性犬乳腺癌免疫組織化學切片F(xiàn)ig.2 Immunohistochemical section of invasive canine breast cancerunder different magnifications

3 討論和結論

3.1 HIF-1蛋白對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響

缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下細胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子,是體內(nèi)維持細胞內(nèi)氧平衡的主要調(diào)控因子[7]。在正常條件下，HIF 的 a 亞基被蛋白酶體快速降解，但在低氧條件下穩(wěn)定下來。在低氧條件下，氧成為限制前體羥基化的速率，并且HIF-1a 的周轉(zhuǎn)率相應地降低，使 HIF-1a 在細胞內(nèi)積累[8]。缺氧從而引起基因上調(diào)，調(diào)節(jié)細胞適應低氧狀態(tài)下的能量代謝和氧的運輸[9]。

腫瘤發(fā)生過程中，實體病變首先經(jīng)歷一個無血管的生長階段，細胞迅速生長增殖，直到氧氣的擴散和廢物和營養(yǎng)物質(zhì)的交換成為速率限制。而腫瘤組織細胞的生長和存活依賴于它們促進血管生成和適應缺氧條件的能力。盡管微血管密度會增加，即使是大腫瘤，其血管結構和功能也會異常，導致局部缺氧[8]。

HIF-1α不僅是重要的調(diào)控氧平衡的轉(zhuǎn)錄因子，還可以通過激活其他因子，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，如激活血管的轉(zhuǎn)錄內(nèi)皮生長因子(VEGF)，反過來促進血管生成通過刺激內(nèi)皮細胞的生長、遷移和侵襲形成新的血管，促進腫瘤進展[10]。在大多數(shù)腫瘤中 HIF-1α過量產(chǎn)生，并與不同目的基因缺氧反應原件中的一段共有序列結合，增加了腫瘤細胞在缺氧條件下的存活，促進腫瘤生長[11]。此外，還有研究表明中止缺氧誘導基因的轉(zhuǎn)錄，在體內(nèi)和體外均抑制腫瘤生長。與腫瘤密切相關的原癌基因、抑癌基因和生長因子均與 HIF-1α有密切的聯(lián)系[12]。因此，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程與 HIF-1α密不可分。

3.2 HIF-1蛋白的過表達對犬乳腺腫瘤良惡性變化的作用

本試驗統(tǒng)計了 HIF-1α在 20 例犬乳腺腫瘤中的表達情況。其中有 6 例良性乳腺腫瘤，均未有陽性結果出現(xiàn)，而在惡性腫瘤組織中HIF-1α的表達率很高，14 例惡性腫瘤組織中有 12 例出現(xiàn)陽性結果，陽性率達到85.7%。且其中有 4 例呈現(xiàn)出強陽性，組織片呈現(xiàn)深染黃色甚至黃褐色。統(tǒng)計結果顯示，HIF-1α在惡性乳腺腫瘤中的表達率顯著高于良性組織中(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。提示，HIF-1α與犬惡性乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系。

研究提示，HIF-1α在乳腺癌中可能扮演著重要的角色。如腫瘤微環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧是影響臨床預后的重要因素，可促進腫瘤的遺傳不穩(wěn)定性、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲性[13]。腫瘤啟動缺氧是發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的啟動子。缺氧會改變癌細胞的新陳代謝，通過誘導細胞靜止增加對治療的抵抗力[14]。因此，腫瘤組織微環(huán)境缺氧也是腫瘤治療效果差，易產(chǎn)生放化療耐受的原因之一。

據(jù)報道，在醫(yī)學臨床上90%的乳腺腫瘤的死亡是由于轉(zhuǎn)移所致，轉(zhuǎn)移常與血管生成有關[15]。HIF-1α可以激活血管的轉(zhuǎn)錄內(nèi)皮生長因子(VEGF)，促進血管生成通過刺激內(nèi)皮細胞的生長、遷移和侵襲形成新的血管，促進腫瘤不斷發(fā)生發(fā)展，HIF-1α還可以通過與其他因子相互作用，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與MTDH相互作用共同作用于乳腺癌轉(zhuǎn)移過程，除此之外，HIF-1α也與E-cadherin 相互作用，共同促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移作用[16-17]。因此，HIF-1α在腫瘤惡性癌變中有重要意義。

在免疫組化染色中，HIF-1α在犬惡性乳腺腫瘤組織中高表達、結果對比清晰明白(黃色和藍色對比)易于統(tǒng)計分析。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下腫瘤細胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，且作為癌癥指標 HIF-1α容易測量、可對腫瘤發(fā)病過程及預后進行判斷，而且隨著免疫組化技術的不斷發(fā)展，可以便捷簡單快速的測量 HIF-1α轉(zhuǎn)錄表達情況。因此，HIF-1α可以作為乳腺癌敏感指標來進行臨床評價。

HIF-1α在犬惡性乳腺腫瘤中的表達顯著高于良性乳腺腫瘤，對腫瘤診斷和預后評價有重要的臨床參考價值。