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    缺氧誘導(dǎo)因子-1蛋白在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義

    2020-05-18 02:21:16伍怡佳范玉華

    伍怡佳,姚 華,范玉華

    (北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

    隨著動(dòng)物醫(yī)療的發(fā)展,寵物犬老年疾病的患病率和診斷需求也不斷增加。乳腺腫瘤是母犬最常見的腫瘤,在9至11歲的老齡母犬群體中多發(fā),其發(fā)病率占母犬腫瘤數(shù)量的50%,犬的惡性乳腺腫瘤較為常見[1],發(fā)病率與死亡率都非常高。因此,需要有效的檢測(cè)手段。

    缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在醫(yī)學(xué)臨床上已被公認(rèn)為重要的癌癥藥物靶標(biāo),其最初是作為一種生物O2傳感器被發(fā)現(xiàn),可使機(jī)體適應(yīng)缺氧狀態(tài)。HIF-1是一個(gè)異二聚體轉(zhuǎn)錄因子,由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成,(或其類似物 HIF-2α和 HIF-3α)。其中,HIF-1α是氧敏感亞基,在低氧條件下誘導(dǎo)其發(fā)生表達(dá)[2-4]。

    本試驗(yàn)檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)在犬乳腺腫瘤組織中的表達(dá),分析其與犬乳腺腫瘤性質(zhì)的關(guān)系,探明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 樣本收集

    2017—2019年間在北京市多家寵物醫(yī)院收集疑似犬乳腺腫瘤樣本20例,并經(jīng)獸醫(yī)師和寵物主人同意后用于試驗(yàn)研究。

    1.2 主要試劑

    DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)、兔二步法檢測(cè)試劑盒(PV-9001)、兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子-1α單克隆抗體(ZA-0552)、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液(EDTA抗原修復(fù)液pH 8.0)均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。分析純酒精、分析純二甲苯及PBS均購(gòu)自北京試劑公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 病理組織學(xué)觀察 將疑似犬乳腺腫瘤樣本在4%多聚甲醛中固定24 h,之后切成1 cm3的小塊放入包埋盒中流水沖洗6~8 h,隨后進(jìn)行脫水、浸蠟及包埋處理,制成蠟塊。使用病理切片機(jī)將蠟塊切成4 μm的薄片后進(jìn)行病理組織學(xué)鑒定和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分類,判定其腫瘤的性質(zhì)。

    1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 制作石蠟切片,載玻片使用陽離子防脫片。將4 μm的薄片進(jìn)行脫蠟水化后,用PBS洗3次,每次3 min。在高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻后用PBS洗3次,每次3 min。加入內(nèi)源性過氧化物阻斷酶,避光反應(yīng)12 min后,用PBS洗3次,每次3 min。加入一抗,4 ℃過夜,復(fù)溫后37 ℃烘箱反應(yīng)1 h。用PBS單獨(dú)沖洗一抗,防止污染陰性對(duì)照。加入反應(yīng)增強(qiáng)液,37 ℃烘箱反應(yīng)20 min,用PBS洗3次,每次3 min。加入增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物,37 ℃烘箱反應(yīng)20 min,用PBS洗3次,每次3 min。最后DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水透明后用中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。HIF-1蛋白的陽性部位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),顯微鏡下以清晰的有棕黃色、黃色的顆粒為有HIF-1蛋白的表達(dá)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    采用 SPSS20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,選用 fisher’s 精確檢驗(yàn)法、Pearson 相關(guān)性分析對(duì) HIF-1α蛋白在良性腫瘤組與惡性腫瘤組之間的表達(dá)情況進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。若P<0.05 表示 HIF-1α在不同性質(zhì)的犬乳腺腫瘤中表達(dá)存在顯著差異,并且差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;若P>0.05 表示差異不顯著,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    選取細(xì)胞計(jì)數(shù)比對(duì)[5-6]。HIF-1α以胞漿和胞核中出現(xiàn)清晰的黃色或黃褐色顆粒為陽性染色。其陽性結(jié)果判斷:陽性細(xì)胞數(shù)<5%為“-”,5%~25%為“+”;陽性細(xì)胞數(shù) 26%~50%為 “++”;陽性細(xì)胞數(shù) 51%~75%為“+++”;陽性細(xì)胞數(shù)>75%為“++++”。

    2 結(jié) 果

    2.1 腫瘤性質(zhì)的病理組織學(xué)分析

    收集到疑似犬乳腺腫瘤病例20 例,經(jīng)病理組織學(xué)觀察得出良性乳腺腫瘤6 例,占犬乳腺腫瘤病例的30%;惡性乳腺腫瘤14例,占全部病例數(shù)的70%??梢姡瑦盒阅[瘤的發(fā)病率超過良性乳腺腫瘤,應(yīng)引起臨床獸醫(yī)的高度關(guān)注。

    本試驗(yàn)將所收集病例進(jìn)行組織學(xué)分型,結(jié)果見表1。

    表1 不同乳腺腫瘤組織學(xué)特點(diǎn)Tab.1 Histological characteristics of different breast tumors

    圖1為犬浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織切片分別為 HE 染色在 4 倍鏡、40 倍鏡下的圖像。圖 1組織結(jié)構(gòu)紊亂,伴有部分出血壞死的特征,乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)不完整,間質(zhì)內(nèi)存在大量同質(zhì)細(xì)胞。其中可清晰地看到腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸,胞核部分有分裂象。而良性腫瘤組織分化好、異型性小,基本無或者很少可見病理核分裂象。

    圖1 浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理切片F(xiàn)ig.1 Pathological section of invasive ductal carcinoma

    2.2 HIF-1蛋白在犬乳腺腫瘤中的表達(dá)

    如表 2 所示,對(duì) HIF-1α蛋白在良性腫瘤組與惡性腫瘤組之間的表達(dá)情況進(jìn)行差異性檢驗(yàn),檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05,表示 HIF-1α在不同性質(zhì)的犬乳腺腫瘤中表達(dá)存在顯著差異,且差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,犬惡性乳腺腫瘤中 HIF-1α的表達(dá)顯著高于良性乳腺腫瘤,陽性表達(dá)率為85.7%。

    表2 犬乳腺腫瘤組織中 HIF-1α蛋白的表達(dá)

    Tab.2 Expression of HIF-1α protein in canine mammary tumor tissues

    將本試驗(yàn)的20例犬乳腺腫瘤樣本進(jìn)行定量分析,結(jié)果見表3。圖2分別從4倍鏡、10倍鏡、40倍鏡下展示了 HIF-1α在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中陰性和陽性的表達(dá)。從圖中可以看出,HIF-1α的陽性表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞核和胞漿中,呈現(xiàn)典型的黃色甚至黃褐色。

    表3 HIF-1α在犬乳腺腫瘤中的定量分析統(tǒng)計(jì)

    Tab.3 Quantitative analysis and statistics of HIF-1α in canine breast tumors

    圖2 不同倍鏡下的浸潤(rùn)性犬乳腺癌免疫組織化學(xué)切片F(xiàn)ig.2 Immunohistochemical section of invasive canine breast cancerunder different magnifications

    3 討論和結(jié)論

    3.1 HIF-1蛋白對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響

    缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下細(xì)胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子,是體內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)氧平衡的主要調(diào)控因子[7]。在正常條件下,HIF 的 a 亞基被蛋白酶體快速降解,但在低氧條件下穩(wěn)定下來。在低氧條件下,氧成為限制前體羥基化的速率,并且HIF-1a 的周轉(zhuǎn)率相應(yīng)地降低,使 HIF-1a 在細(xì)胞內(nèi)積累[8]。缺氧從而引起基因上調(diào),調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)下的能量代謝和氧的運(yùn)輸[9]。

    腫瘤發(fā)生過程中,實(shí)體病變首先經(jīng)歷一個(gè)無血管的生長(zhǎng)階段,細(xì)胞迅速生長(zhǎng)增殖,直到氧氣的擴(kuò)散和廢物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換成為速率限制。而腫瘤組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活依賴于它們促進(jìn)血管生成和適應(yīng)缺氧條件的能力。盡管微血管密度會(huì)增加,即使是大腫瘤,其血管結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)異常,導(dǎo)致局部缺氧[8]。

    HIF-1α不僅是重要的調(diào)控氧平衡的轉(zhuǎn)錄因子,還可以通過激活其他因子,影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,如激活血管的轉(zhuǎn)錄內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),反過來促進(jìn)血管生成通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲形成新的血管,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[10]。在大多數(shù)腫瘤中 HIF-1α過量產(chǎn)生,并與不同目的基因缺氧反應(yīng)原件中的一段共有序列結(jié)合,增加了腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下的存活,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[11]。此外,還有研究表明中止缺氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄,在體內(nèi)和體外均抑制腫瘤生長(zhǎng)。與腫瘤密切相關(guān)的原癌基因、抑癌基因和生長(zhǎng)因子均與 HIF-1α有密切的聯(lián)系[12]。因此,腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程與 HIF-1α密不可分。

    3.2 HIF-1蛋白的過表達(dá)對(duì)犬乳腺腫瘤良惡性變化的作用

    本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了 HIF-1α在 20 例犬乳腺腫瘤中的表達(dá)情況。其中有 6 例良性乳腺腫瘤,均未有陽性結(jié)果出現(xiàn),而在惡性腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)率很高,14 例惡性腫瘤組織中有 12 例出現(xiàn)陽性結(jié)果,陽性率達(dá)到85.7%。且其中有 4 例呈現(xiàn)出強(qiáng)陽性,組織片呈現(xiàn)深染黃色甚至黃褐色。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,HIF-1α在惡性乳腺腫瘤中的表達(dá)率顯著高于良性組織中(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示,HIF-1α與犬惡性乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。

    研究提示,HIF-1α在乳腺癌中可能扮演著重要的角色。如腫瘤微環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧是影響臨床預(yù)后的重要因素,可促進(jìn)腫瘤的遺傳不穩(wěn)定性、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲性[13]。腫瘤啟動(dòng)缺氧是發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)子。缺氧會(huì)改變癌細(xì)胞的新陳代謝,通過誘導(dǎo)細(xì)胞靜止增加對(duì)治療的抵抗力[14]。因此,腫瘤組織微環(huán)境缺氧也是腫瘤治療效果差,易產(chǎn)生放化療耐受的原因之一。

    據(jù)報(bào)道,在醫(yī)學(xué)臨床上90%的乳腺腫瘤的死亡是由于轉(zhuǎn)移所致,轉(zhuǎn)移常與血管生成有關(guān)[15]。HIF-1α可以激活血管的轉(zhuǎn)錄內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),促進(jìn)血管生成通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲形成新的血管,促進(jìn)腫瘤不斷發(fā)生發(fā)展,HIF-1α還可以通過與其他因子相互作用,影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[10]。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α與MTDH相互作用共同作用于乳腺癌轉(zhuǎn)移過程,除此之外,HIF-1α也與E-cadherin 相互作用,共同促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移作用[16-17]。因此,HIF-1α在腫瘤惡性癌變中有重要意義。

    在免疫組化染色中,HIF-1α在犬惡性乳腺腫瘤組織中高表達(dá)、結(jié)果對(duì)比清晰明白(黃色和藍(lán)色對(duì)比)易于統(tǒng)計(jì)分析。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子,且作為癌癥指標(biāo) HIF-1α容易測(cè)量、可對(duì)腫瘤發(fā)病過程及預(yù)后進(jìn)行判斷,而且隨著免疫組化技術(shù)的不斷發(fā)展,可以便捷簡(jiǎn)單快速的測(cè)量 HIF-1α轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。因此,HIF-1α可以作為乳腺癌敏感指標(biāo)來進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。

    HIF-1α在犬惡性乳腺腫瘤中的表達(dá)顯著高于良性乳腺腫瘤,對(duì)腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)有重要的臨床參考價(jià)值。

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