巴爾吡爾對常見病原菌體外殺菌作用

徐 珺,董 恒,劉星云,宣秋希,侯曉林

(北京農(nóng)學院 動物科學技術(shù)學院，北京100026)

巴爾吡爾( Ionized Alkali Mineral Complex，IAMC)是一種復合堿性負離子群，是巴爾麥氏的核心成分[1,2]。巴爾麥氏是一種具有活化增效生理作用的復合堿性負離子群及微生態(tài)制劑，具有活化組織細胞、促進生長、調(diào)節(jié)胃腸道、提高免疫性能的功效，臨床上常用作為生物飼料添加劑使用[3-5]。作者通過研究巴爾吡爾對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的殺菌效果，探索巴爾吡爾體外殺菌作用，為該產(chǎn)品的推廣使用提供科學依據(jù)。巴爾麥氏是采用美國專利和細胞代謝技術(shù)而生產(chǎn)的一種多功能堿性陽離子免疫增強劑，于2013年在中國獲得發(fā)明專利[6]。其核心物質(zhì)巴爾吡爾是一種國際上普遍應用的飼料添加劑，其主要成分是活性礦物質(zhì)、強效電解質(zhì)、復合還原糖以及益生素等，可以維持動物體內(nèi)環(huán)境的弱堿性、增強動物細胞代謝、促進動物消化吸收、增強免疫細胞的吞噬功能、提高機體非特異性免疫功能[7,8]。研究表明，巴爾吡爾對畜禽體外細菌具有良好的抑制作用，可以改善畜禽生長性能，提高畜禽的經(jīng)濟效益[1]；在飼料中添加巴爾吡爾可以提高奶牛的采食量和產(chǎn)奶量，有助于緩解奶牛熱應激[9]；在仔豬飼料中添加巴爾麥氏可以提高保育仔豬的消化能力，改善免疫功能，提高仔豬育成率[10]。目前，大部分文獻主要研究巴爾吡爾作為飼料添加劑使用，在其抗菌方面的研究尚有空白，因此，巴爾吡爾的抗菌作用有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

巴爾吡爾溶液(批號為20180603)，由北京金娜爾生物技術(shù)有限公司提供。新潔爾滅消毒劑(批號為20180102)，由山東安捷高科消毒科技有限公司提供。滅菌生理鹽水(批號為20180211)，由石家莊四藥有限公司提供。

金黃色葡萄球菌ATCC 29213和大腸桿菌ATCC 25922由北京農(nóng)學院動物醫(yī)學系實驗室保存提供。

MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、平板計數(shù)PCA培養(yǎng)基，均由北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

復蘇凍存管中保存的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。用接種環(huán)蘸取適量菌液，采用三線畫法涂布在MH和LB瓊脂板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行過夜培養(yǎng)。從平板上挑選出一株形狀圓潤、邊緣規(guī)整的菌落，用潔凈的接種環(huán)進行挑菌并分別接種到MH肉湯和LB 肉湯中，振蕩試管，使金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均勻地分散在培養(yǎng)基中[11]。將試管放置在37 ℃的搖床上培養(yǎng)16～18 h，4 ℃保存，作為試驗菌種以待備用。

試驗前對菌液進行細菌計數(shù)。從試管中吸取1 mL菌液放到1.5 mL的EP管中3 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，保留菌體。向EP管中加入1 mL生理鹽水并用移液槍進行混懸，使細菌均勻分布。采用倍比稀釋法，將菌液稀釋106倍，從稀釋過的菌液中吸取20 μL滴在瓊脂板上，每個瓊脂板滴4滴，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，8 h左右進行細菌計數(shù)[12]，公式：含菌數(shù)CFU/mL=兩滴菌液含菌量的平均數(shù)×5×稀釋倍數(shù)。

菌懸液濃度為(107～108) CFU/mL。實驗前用無菌生理鹽水將菌液稀釋至該濃度，4 ℃保存，作為驗菌液以備待用。

殺菌試驗共使用3個濃度梯度的巴爾吡爾藥液。按照巴爾吡爾藥液說明書，用無菌生理鹽水按1∶2、1∶3和1∶4的比例進行稀釋得到3倍、4倍和5倍稀釋液。空白對照使用生理鹽水，陰性對照選用新潔爾滅,按照說明書進行稀釋使用。

向無菌試管內(nèi)分別加入0.5 mL菌懸液、0.5 mL不同濃度的巴爾吡爾溶液(空白對照為生理鹽水，陰性對照為新潔爾滅)，立即混勻。在藥物分別作用5 min和10 min時，取 0.1 mL樣液用生理鹽水稀釋106倍，吸取稀釋的菌液20 μL涂布MH瓊脂培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20～24 h進行活菌計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

巴爾吡爾對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌結(jié)果，見表1。由表1可知巴爾吡爾對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有殺滅作用，其中原液和稀釋3倍的巴爾吡爾的殺菌效果最好。由表2可知，不同濃度的巴爾吡爾作用不同時間對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌殺菌作用不同，巴爾吡爾對金黃色葡萄球菌均有殺菌作用，原液和稀釋3倍的巴爾吡爾液體對大腸桿菌有較好的殺菌作用，在藥物作用10 min時，無細菌生長，巴爾吡爾對金黃色葡萄球菌的殺滅效果達到99%。

表1 活菌計數(shù)法體外殺菌試驗結(jié)果

Tab.1 Results of bactericidal test in vitro by viable organism counting method

試驗藥物Drug菌株Strain金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus大腸桿菌Escherichia col原液stock solution--藥物稀釋3倍drug dilution 3 times--藥物稀釋4倍drug dilution 4 times-+藥物稀釋5倍drug dilution 5 times-+空白對照Blank control++陰性對照Negative control--

注：+號表示細菌生長，-號表示細菌不生長

不同稀釋倍數(shù)的巴爾吡爾對同一株菌的殺菌作用不同。由平板計數(shù)法測得隨著稀釋倍數(shù)增加，巴爾吡爾殺菌作用下降。其中原液的殺菌效果最好，殺菌率為100%，另外稀釋3倍的巴爾吡爾與原液殺菌作用相差不大，殺菌率高達99.9%。分析原因，巴爾吡爾稀釋倍數(shù)增加殺菌率降低可能因為稀釋后原液的pH值下降、堿性離子濃度降低。同一稀釋倍數(shù)的巴爾吡爾作用不同時間對同一株菌的殺菌作用不同。巴爾吡爾對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有殺菌作用，但作用時間長比作用時間短的殺菌作用明顯，表現(xiàn)為作用10 min的殺菌率高達100%，作用5 min的殺菌率低至86%。分析原因，可能和巴爾吡爾釋放與細菌或病毒結(jié)合的電子的穩(wěn)定性有一定關(guān)系。

表2 不同濃度巴爾吡爾作用不同時間體外殺菌率Tab.2 In vitro bactericidal rate of different concentrations of balpil at different time

3 討 論

大量臨床試驗表明，將巴爾麥氏( 巴爾吡爾) 作為飼料添加劑使用，對畜禽具有很好的降低腹瀉率、減少死胎率、提高飼料的利用率、促進生長、增加經(jīng)濟效益的作用，具備廣泛應用的臨床價值[13,14]。有資料表明，巴爾吡爾是一種堿性復合物，可以與氫離子結(jié)合，從而使各種營養(yǎng)物質(zhì)溶解，同時也可以促進底物與消化酶結(jié)合，促進飼料吸收，增加營養(yǎng)的利用率；巴爾吡爾進入體內(nèi)后通過釋放電子與細菌和病毒結(jié)合，改變其DNA、RNA的結(jié)構(gòu)，使機體免受細菌和病毒的侵襲，提高畜禽對病原菌的抵抗力。因此，巴爾吡爾常備用作消毒藥物[15]；另外，巴爾吡爾含有多種元素和益生菌，這些元素在堿性溶液環(huán)境中保持離子狀態(tài)和水溶性，從而維持動物內(nèi)環(huán)境的弱堿性，堿性離子可以增加骨髓細胞的數(shù)量，增加細胞的吞噬功能，提高機體的非特異性免疫功能，而益生菌可以改變畜禽胃腸道內(nèi)的微生物菌群，減少致病菌數(shù)量，增強胃腸道消化、吸收功能，能夠作為抗生素有效替代的微生態(tài)制劑使用[14,16]。巴爾吡爾對常見病原菌是殺菌機制是：巴爾吡爾富含Si、Ag、Ti、Au、Zn、Fe等堿性離子，可以釋放大量電子與細菌結(jié)合，從而減弱細菌的活性，實現(xiàn)殺菌的效果。張哲[1]等采用杯碟法和二倍稀釋法研究巴爾吡爾對8種畜禽常見病原菌均有較好的抑制和殺滅作用，發(fā)現(xiàn)巴爾吡爾對馬腺疫鏈球菌和無乳鏈球菌抑菌效果最好，其最小抑菌濃度(MIC)為 1∶20，對對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬傷寒沙門氏菌、魏氏梭菌和停乳鏈球菌也有很好的抑制效果，其最小抑菌濃度均為1∶10。