波羅蜜葉綠素缺失突變體嫩莖轉(zhuǎn)錄組分析

鄭李婷 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 吳繁花 董俊娜 曹佩娜

摘? 要：為探究葉綠素合成缺失對(duì)波羅蜜嫩莖發(fā)育的影響，以波羅蜜葉綠素缺失突變體（chlorophyll deficient mutant， CDM）嫩莖為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析;經(jīng)de novo組裝后獲得295 869個(gè)Unigenes，使用NR、NT、Swissprot、KEGG、KOG、Pfam和GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，共注釋了174 291個(gè)Unigenes。過(guò)濾低豐度基因后，篩選出22 988個(gè)差異基因。與對(duì)照（CK）相比，CDM中上調(diào)基因有379個(gè)，下調(diào)基因有22 609個(gè)。GO分類結(jié)果表明，共有3712個(gè)基因獲得注釋，并將其劃分為分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）和生物學(xué)過(guò)程（biological process）三大類，共48個(gè)功能組;此外，有2080個(gè)Unigenes參與到19條KEGG通路上，其中在黃酮類生物合成途徑中有30個(gè)Unigenes。該研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析葉綠素合成缺失對(duì)波羅蜜嫩莖發(fā)育的影響，為木本植物莖發(fā)育的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：波羅蜜;葉綠素缺失突變體;嫩莖;轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號(hào)：S718.43? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To explore the influence of chlorophyll synthesis deficiency on the primary stem development of Artocarpus heterophyllus， the transcriptome of the primary stem of a chlorophyll deficient mutant （CDM） of A. heterophyllus was analyzed. After assembly by de novo， 295 869 Unigenes were obtained. NR， NT， Swissprot， KEGG， KOG， Pfam and GO databases were used for sequence alignment. A total of 174 291 Unigenes were annotated. After filtering the low abundance genes， 22 988 differentially expressed genes were selected. Compared with the control check （CK）， there were 379 genes up-regulated in CDM and 22 609 genes down-regulated. GO classification results showed that 3712 genes were annotated and classified into three categories： molecular function， cellular component and biological process， with a total of 48 functional groups. In addition， 2080 Unigenes were involved in 19 KEGG pathways， 30 of which were involved in flavonoids biosynthesis pathways. Through transcriptome sequencing， this paper analyzed the effect of chlorophyll synthesis deficiency on the primary stem development of A. heterophyllus， which would provide data foundation for the study on the stem development of woody plants.

Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll deficient mutant; primary stem; transcriptome analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.002

莖上承枝葉下接根部，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中主要起運(yùn)輸和支撐的作用。莖的生長(zhǎng)包括初生生長(zhǎng)和次生生長(zhǎng)。初生生長(zhǎng)是頂端分生組織，經(jīng)細(xì)胞分裂分化形成表皮、皮層和維管柱的過(guò)程[1]。國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)毛白楊（Populus tomentosa）各節(jié)間進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其莖主枝伸長(zhǎng)區(qū)含特殊的碳水化合物活性酶（carbohydrate active enzymes， CAZymes）及擴(kuò)展蛋白（expansins）家族成員基因。其中CAZymes中的糖基水解酶（glycoside hydrolases， GHs）小家族基因在莖伸長(zhǎng)區(qū)顯著性表達(dá)，部分成員可能參與初級(jí)細(xì)胞壁代謝（primary cell wall metabolish）、細(xì)胞壁疏松（cell wall loosening）和細(xì)胞伸長(zhǎng)（cell elongation）[2]。Expansins是植物細(xì)胞擴(kuò)張和疏松的關(guān)鍵調(diào)控因子[3-4]。而在毛白楊莖發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)expansins基因在莖伸長(zhǎng)區(qū)表達(dá)，可能參與初級(jí)細(xì)胞壁的合成和修飾[2]。三羧酸循環(huán)在毛白楊莖發(fā)育早期呈下降趨勢(shì)，可能與丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase， PHD）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase， ICDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase， SDH）蛋白豐度的降低有關(guān)[5]。

2.2? 差異基因的篩選與分析

在CK和CDM中，平均表達(dá)量分別≤0.5的基因有70 218和94 226個(gè)，0.5～1的有59 403和23 361個(gè)，1～2的有77 073和20 733個(gè)，>2的有76 495和41 680個(gè)（圖3A）。過(guò)濾平均表達(dá)量≤0.5的基因后，篩選出22 988個(gè)差異基因（圖3B）。將其分為Ⅰ（CK中特有基因）、Ⅱ（CK與CDM共有基因在CDM中下調(diào)）、Ⅲ（CK與CDM共有基因在CDM中上調(diào)）和Ⅳ（CDM中特有基因）（圖3C）4部分，每個(gè)部分轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）各有41、163、7和3個(gè)，抗性基因（plant resistance genes，PRGs）各有87、193、20和3個(gè)（圖3D）。通過(guò)WGCNA分析CK與CDM間差異基因的關(guān)聯(lián)模式，結(jié)果顯示所有差異基因?qū)儆谝粋€(gè)共表達(dá)模塊（圖3E），且同組樣品間特征向量基因表達(dá)趨于一致（圖3F）。

2.3? 差異基因GO、KEGG功能注釋

2.3.1? GO功能注釋? 將22 988個(gè)差異基因進(jìn)行GO功能注釋和分析，可確定其重要的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，共有3712個(gè)基因獲得注釋，并劃分為48個(gè)功能組（圖4）。因功能組的不同又可進(jìn)一步分為三大主類：分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）和生物學(xué)過(guò)程（biological process）。三類注釋分別占79.85%、56.17%和46.82%，表示大部分差異基因與分子功能相關(guān)。分子功能注釋的基因大部分集中在催化活性（catalytic activity），且與CK相比，CDM中120個(gè)基因上調(diào)，1787個(gè)基因下調(diào)，其中CDM特有的有16個(gè)。在生物學(xué)過(guò)程中，以細(xì)胞過(guò)程（cellular process）的基因數(shù)最多，且與CK相比，CDM中大部分差異基因下調(diào)，少數(shù)上調(diào)，其中CDM特有的有8個(gè);在細(xì)胞組分中，膜（membrane）功能組擁有的基因數(shù)最多，且CDM相對(duì)于CK發(fā)生大量下調(diào)，少數(shù)上調(diào)，其中CDM特有的有6個(gè)。

2.3.2? KEGG功能注釋? 對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG途徑分析，根據(jù)對(duì)結(jié)果中的代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information process）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、細(xì)胞過(guò)程（cellular processes）以及生物系統(tǒng)（organismal systems）5組類目進(jìn)行歸類，有助于深入了解CK與CDM間差異基因所在的通路情況（圖5）。結(jié)果表明，2 080個(gè)Unigenes被注釋到19個(gè)條目，其中10個(gè)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4部分中均有出現(xiàn)。代謝類目注釋的Unigenes最多，有1152個(gè)（55.38%），且以糖代謝（carbohydrate metabolism）注釋的Unigenes最多，其中CK和CDM特有的分別有109和2個(gè)。而在遺傳信息處理中，有698個(gè)（33.56%）Unigenes得到注釋，翻譯（translation）所含的Unigenes最多，且CDM相比于CK發(fā)生大量下調(diào)，少量上調(diào)，CDM特有的有2個(gè)。環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程及組織系統(tǒng)所注釋的Pathway較其他分類少，分別為2、1、1條。

2.4? GO富集分析

為進(jìn)一步研究波羅蜜CDM嫩莖發(fā)育過(guò)程中基因的生物學(xué)功能，將差異基因進(jìn)行GO富集分析（圖6）。與CK相比，CDM有379個(gè)基因上調(diào)，22 609個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)Q-value值分別篩選出20條最顯著的條目。結(jié)果表明，在上調(diào)基因中，20個(gè)GO條目富集顯著程度相同，而翻譯（translation）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）是富集基因數(shù)較多的GO條目。在下調(diào)基因中，單加氧酶活性（monooxygenase activity）、多細(xì)胞生物發(fā)育（multicellular organism development）和作用于成對(duì)供體上的氧化還原酶活性，并結(jié)合或還原氧分子（oxidoreductase activity， acting on paired donors， with incorporation or reduction of molecular oxygen）3個(gè)GO條目最顯著富集，而膜的組成成分（interal component of membrane）是富集基因最多的GO條目。

2.5? KEGG富集分析

通過(guò)KEGG Pathway富集分析，確定差異基因參與的最主要途徑，在差異基因中找出顯著富集的pathway（圖7）。KEGG富集分析結(jié)果顯示，脂肪酸降解（fatty acid degradation）、光合作用（photosynthesis）、苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）和色氨酸代謝（tryptophan metabolism）是上調(diào)基因和下調(diào)基因共有的富集代謝通路。在上調(diào)基因中，獲得了5個(gè)氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）途徑的Unigenes，是富集基因最多的代謝通路。而在下調(diào)基因中，油菜素甾醇生物合成（brassinosteroid biosynthesis）和苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）是最為顯著富集的代謝通路。其次，二萜類生物合成（diterpenoid biosynthesis）、角質(zhì)，琥珀和蠟的生物合成（cutin， suberine and wax biosynthesis）、黃酮類生物合成（flavonoid biosynthesis）和玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）等是較為顯著富集的通路，苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）是富集基因最多的代謝通路。

3? 討論

近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為波羅蜜分子生物學(xué)方面研究提供極大便利。學(xué)者通過(guò)對(duì)波羅蜜花被進(jìn)行RNA-seq分析，探究其糖代謝相關(guān)基因差異表達(dá)的特點(diǎn)[24]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了葉綠素合成缺失對(duì)波羅蜜嫩莖發(fā)育的影響。

波羅蜜是一種具有較高藥用價(jià)值的熱帶水果，一直深受人們喜愛(ài)，也獲得了眾多學(xué)者青睞[25]。張福平等[26]研究了波羅蜜種子中黃酮類化合物的抗氧化性;國(guó)外學(xué)者測(cè)定了新鮮波羅蜜果實(shí)球莖中總黃酮類化合物及自由基清除活性在氣調(diào)貯藏過(guò)程中的變化[27]。黃酮類化合物能清除大量自由基，此生理生化屏障在植物防御中發(fā)揮著重要作用[28]。本研究通過(guò)KEGG富集分析，獲得了30個(gè)黃酮類生物合成途徑的Unigenes，且均下調(diào)表達(dá)。后續(xù)可進(jìn)一步研究這些基因的表達(dá)及相應(yīng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化，揭示黃酮類物質(zhì)在波羅蜜CDM嫩莖抗病過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制。

糖代謝在一定程度上能反映植株的生長(zhǎng)狀態(tài)[29-30]。謝柳青等[17]研究發(fā)現(xiàn)糖代謝對(duì)波羅蜜CDM莖次生生長(zhǎng)有影響，且相比CK，CDM發(fā)生大量下調(diào)，少量上調(diào)。本研究通過(guò)KEGG功能注釋及GO富集分析，也發(fā)現(xiàn)糖代謝相關(guān)基因大部分下調(diào)，且部分下調(diào)基因在光合作用途徑較顯著富集。據(jù)結(jié)果推測(cè)，糖代謝途徑中關(guān)鍵酶的合成可能受到了抑制，而進(jìn)一步影響莖的發(fā)育。后續(xù)可篩選出調(diào)節(jié)糖代謝的候選基因，鑒定與光合作用信號(hào)通路之間是否存在相互作用，以期為調(diào)控木本植物莖發(fā)育關(guān)鍵基因的研究提供參考。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，翻譯是執(zhí)行其生物合成的重要步驟[31]。在非生物脅迫因子下，植物的生長(zhǎng)發(fā)育受到不同的影響，還可能影響其基因的表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫能抑制正常蛋白質(zhì)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)逆境蛋白產(chǎn)生[32]。而付影等[16]研究發(fā)現(xiàn)突變體受環(huán)境脅迫程度較深。本研究通過(guò)KEGG分類及GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)27個(gè)和9個(gè)差異上調(diào)基因分別注釋和顯著富集在翻譯途徑，說(shuō)明在波羅蜜CDM嫩莖中依然有蛋白質(zhì)生成。推測(cè)在波羅蜜CDM嫩莖中產(chǎn)生了部分逆境蛋白，使其抵御逆境傷害。而關(guān)于波羅蜜CDM嫩莖的生長(zhǎng)發(fā)育與逆境蛋白之間的調(diào)控關(guān)系，這是后續(xù)研究可繼續(xù)探討的問(wèn)題。

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