澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

楊倩 楊子平 周婭麗 陳東泉 劉恒

摘? 要：澳洲堅(jiān)果是重要的熱區(qū)經(jīng)濟(jì)作物，目前國內(nèi)外尚無關(guān)于澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析內(nèi)參基因的報(bào)道。選擇合適的內(nèi)參基因是提高實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析準(zhǔn)確性的先決條件。為篩選澳洲堅(jiān)果實(shí)時(shí)定量PCR最適內(nèi)參基因，以澳洲堅(jiān)果的根、莖、葉、果皮、果仁為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對18S rRNA，Actin，CYP，EF1a，EF1b，GAPDH，MDH，TUBa，TUBb，UBQ，UBC等11個(gè)常用的內(nèi)參基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。geNorm軟件分析的最適內(nèi)參基因數(shù)目為2，最穩(wěn)定內(nèi)參組合為MDH和EF1b，TUBa基因的穩(wěn)定性最差。BestKeeper分析結(jié)果認(rèn)為，MDH基因表達(dá)最穩(wěn)定，EF1b次之，與geNorm結(jié)果一致。NormFinder軟件穩(wěn)定性分析顯示，GAPDH最穩(wěn)定，其次是CYP基因;TUBa基因表達(dá)最不穩(wěn)定。ΔCt算法結(jié)果表明，18S基因表達(dá)最穩(wěn)定，其次是GAPDH基因，MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder綜合排序?yàn)椋篗DH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此，MDH基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定，初步確認(rèn)可以作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的校正內(nèi)參基因，在澳洲堅(jiān)果的基因表達(dá)模式分析中具有重要意義。

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果;內(nèi)參基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;穩(wěn)定性分析

中圖分類號：S664.9? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Macadamia nut is an important economics crop in subtropical areas of China. The selection of a suitable reference gene is an important prerequisite for successful gene expression analysis by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR）. In order to select the appropriate reference genes， we investigated the expression stability of 11 candidate genes （18S rRNA， Actin， CYP， EF1a， EF1b， GAPDH， MDH， TUBa， TUBb， UBQ， UBC） in RT-qPCR experiments in different tissues， including kernel， peel， roots， stem， leaf from Macadamia with geNorm， NormFinder， BestKeeper， ΔCt， RefFinder program software packages. As determined by geNorm， MDH/EF1b were the most stable reference genes， TUBa was the least stable gene. BestKeeper revealed that MDH was the most stables reference gene， and EF1b ranked the second. The rank in BestKeeper was similarly with that in geNorm. The result by NormFinder showed GAPDH was the most stable gene， CYP ranks the second， the least stable gene was TUBa. ΔCt algorithm demonstrated that18S was the most stable gene， GAPDH ranks the second， MDH and EF1b ranked the third and fourth. To obtain a consensus result of the most stable reference genes according to the RefFinder approach， the geometric mean of the four algorithms corresponding rankings for each candidate gene were calculated： MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ>TUBa. The result showed that MDH was the most suitable reference gene for macadamia in different tissues.

Keywords： Macadamia integrifolia; reference genes; real-time fluorescence quantitative PCR; stability analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.001

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia），又稱夏威夷果、澳洲胡桃、昆士蘭栗，屬山龍眼科（Pro teaceae）澳洲堅(jiān)果屬（Macadamia F. Muell）常綠喬木果樹，原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭州東南部和新南威爾士東北部沿岸的亞熱帶雨林地區(qū)[1]。澳洲堅(jiān)果果實(shí)營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，被譽(yù)為“堅(jiān)果之王”，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-3]。近年來，我國云南、廣西、廣東、貴州等南方各?。▍^(qū)）大面積推廣引種試種澳洲堅(jiān)果優(yōu)良品種，種植面積達(dá)16萬hm2，占世界種植面積的61.05%（數(shù)據(jù)來源：中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶作物辦公室）。雖然我國澳洲堅(jiān)果的果仁產(chǎn)量逐漸遞增，但是全球市場的需求量更大，因此澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景[4]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction， qRT-PCR）的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，熒光物質(zhì)能夠與PCR產(chǎn)物反應(yīng)，隨著PCR產(chǎn)物不斷增加，熒光信號也成比例增強(qiáng)，所以PCR每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)的熒光值代表了PCR產(chǎn)物量的變化。利用qRT-PCR對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算時(shí)，需要以管家基因的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正和均一化。理想狀態(tài)下，所選內(nèi)參基因在不同的處理?xiàng)l件下、不同組織器官中、細(xì)胞的不同發(fā)育時(shí)期中都能穩(wěn)定表達(dá)，而且其表達(dá)水平與目的基因表達(dá)水平相近[5]。然而，不斷有研究表明，實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中并不存在任何一種內(nèi)參基因能夠在任何條件、任何細(xì)胞類型和組織都能夠穩(wěn)定表達(dá)[6]，因此直接使用未經(jīng)篩選的內(nèi)參基因，會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，影響目的基因表達(dá)水平結(jié)果的可靠性，所以有必要對內(nèi)參基因進(jìn)行篩選。

近年來，隨著分子生物學(xué)研究手段逐漸被應(yīng)用到各個(gè)研究領(lǐng)域，分子生物學(xué)研究中的基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制研究成為熱點(diǎn)?；虻谋磉_(dá)分析需要內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，而目前關(guān)于澳洲堅(jiān)果內(nèi)參基因的研究還未見報(bào)道。Actin是常見的內(nèi)參基因，是微絲的結(jié)構(gòu)成分，也是細(xì)胞骨架的主要成分。在魚的研究中發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的激素刺激會影響Actin基因的表達(dá)穩(wěn)定性[7]。18S rRNA是真核生物體內(nèi)含量最多的核糖體RNA，常被用來做內(nèi)參基因，但是在楊樹的不同發(fā)育時(shí)期，18S rRNA的表達(dá)穩(wěn)定性最差，并不適合作為內(nèi)參基因[8]。GAPDH是糖酵解、糖異生及光合作用碳固定循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶。但是在豬的不同組織中的表達(dá)水平和穩(wěn)定性表達(dá)變化都很大，是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因[9]。蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase， MDH）是一類廣泛存在動植物中的酶，參與植物體的多個(gè)代謝途徑，研究證實(shí)細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶基因也可作內(nèi)參基因[10]。延伸因子（elongation factor， eEF）是一類多功能調(diào)控蛋白，可以催化氨基酸鏈在核糖體上的延伸，從而調(diào)控相關(guān)蛋白的合成[11-13]。在植物中，真核生物延伸因子1（eEF1）家族包含eEF1A和eEF1B蛋白[14-16]，延伸因子（elongation factor， eEF）家族基因常被選作內(nèi)參基因[14，17]。因此，本研究以澳洲堅(jiān)果根、莖、葉、果皮、果仁為材料，對18S rRNA，Actin，親環(huán)蛋白（CYP），EF1a和EF1b，GADPH，MDH，微管蛋白（TUBa和TUBb），多聚泛素酶（UBQ），泛素連接蛋白（UBC）等11個(gè)常用內(nèi)參基因分別用geNorm[18]、NormFinder[19]、BestKeeper[20]和ΔCt法等不同算法進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析，最后根據(jù)RefFinder[21]綜合分析篩選最適合的內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖呛Y選出澳洲堅(jiān)果不同組織器官中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為澳洲堅(jiān)果的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)研究提供合適的內(nèi)參基因。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料

選取‘南亞1號澳洲堅(jiān)果品種作為實(shí)驗(yàn)材料，分別摘取成熟的果實(shí)、幼嫩葉片、枝條和根，清洗干凈后用液氮速凍，80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計(jì)

在植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究中多采用肌動蛋白（Actin）、18S核糖體RNA（18S rRNA），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）等常用看家基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行定量。本研究擬選擇11個(gè)常用內(nèi)參基因（18S rRNA， Actin， CYP， EF1a， EF1b， GAPDH， MDH， TUBa， TUBb， UBC， UBQ）作為候選內(nèi)參基因。這11個(gè)候選內(nèi)參基因cDNA序列部分已經(jīng)從澳洲堅(jiān)果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得。登錄實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站，在候選內(nèi)參基因的保守區(qū)域，使用在線軟件設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物。網(wǎng)站地址：https：//sg.idtdna.com/pages/products/qpcr-and- pcr/custom-primers，每個(gè)基因設(shè)計(jì)5對引物。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3? 不同組織RNA的提取和cDNA的合成

澳洲堅(jiān)果葉片總RNA的提取按照Plant Total RNA Isolation Kit Plus（FOREGENE Biotech， Chengdu， China）方法進(jìn)行。mRNA使用凝膠電泳檢測，Nanodrop測定濃度。反轉(zhuǎn)錄按照NOVA All-in-one First-Strand Synthesis Master Mix（Yugong Biolabs， Jiangsu， China）操作。反應(yīng)體系20 μL，以1000 ng RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5 ℃ 60 min;85 ℃ 1 min。

1.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)采集在羅氏（Roche）Light Cycler 480Ⅱ上完成，熒光試劑盒選用Taq SYBR Green qPCR Premix ROXⅠ（NOVA）。將根、莖、葉、果皮、果仁等5個(gè)不同組織的樣品等體積混合，5倍梯度稀釋，分別以50 、51 、52、53、54 、55作為模板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣品重復(fù)3次。3次生物學(xué)重復(fù)。

RT-PCR擴(kuò)增體系：SYBR Premix ExTaqⅡ（2），10 L;PCR Forward Primer（10 mol/L），1 L;PCR Reverse Primer（10 mol/L），1 L;cDNA，1 L;dH2O，7 L;總體積20 L。標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率（slope）由稀釋倍數(shù)和熒光定量Cp值在Excel中計(jì)算得出。擴(kuò)增效率計(jì)算公式：E=（5[1/slope]1）100%。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;然后94 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán);在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熒光信號的采集，所有循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析（65～95 ℃）。

1.5? 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)值可利用Light Cycler 480Ⅱ（Roche）的分析軟件直接獲得Cp值。分別采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt算法4個(gè)不同的程序，比較分析澳洲堅(jiān)果中候選內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，最后通過RefFinder計(jì)算出較為一致的穩(wěn)定內(nèi)參基因。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 澳洲堅(jiān)果RNA的分離與純化和內(nèi)參引物的篩選

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA結(jié)果顯示，不同器官組織的RNA電泳條帶清晰，28S rRNA帶亮度約為18S rRNA的1.5～2倍（圖1），無拖尾，表明RNA的完整性良好，純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)溶解曲線和熒光定量PCR的Cp值對每個(gè)候選內(nèi)參基因的5對引物進(jìn)行篩選，選取質(zhì)量最好的一對常用內(nèi)參基因引物（表1）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2? 內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線

將澳洲堅(jiān)果根、莖、葉、果皮、果仁等樣品cDNA等量混合，依次連續(xù)5倍稀釋為50，51，52，53，54，55共6個(gè)梯度，隨后以6個(gè)不同濃度的混合樣品為模板分別對11個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR。在Excel數(shù)據(jù)處理軟件中，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)獲得的Cp值為縱坐標(biāo)，5的稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：除18S（R2=0.963）外，其余候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）都在0.99附近（表1），擴(kuò)增效率為91.9%～102.5%，說明引物、模板、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的要求（90%～105%）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物具有熒光信號，隨著溫度升高雙鏈DNA降解，這個(gè)過程的熒光信號被采集生成熔解曲線，可以用來確定PCR的反應(yīng)產(chǎn)物。熔解曲線分析通常是在qRT-PCR擴(kuò)增程序的所有循環(huán)結(jié)束后，設(shè)置一個(gè)由65 ℃上升至95 ℃的反應(yīng)程序，每升溫0.5 ℃測定1次熒光信號，共采集60次。熒光定量熔解曲線數(shù)據(jù)顯示，11個(gè)候選內(nèi)參基因的都為單一銳鋒，不存在非特異擴(kuò)增，Tm值為80～85 ℃（圖2），說明篩選的這些候選內(nèi)參基因的引物特異性強(qiáng)，符合RT-qPCR分析的要求。

2.3? 不同組織內(nèi)參基因的篩選

以澳洲堅(jiān)果根、莖、葉、果仁、果皮不同組織的cDNA為模板，對11個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

2.3.1? geNorm分析澳洲堅(jiān)果不同組織中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? geNorm軟件算法利用M值和標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異V值確定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和適合內(nèi)參的數(shù)量。M值的閾值為1.5，小于1.5說明該基因適合做內(nèi)參，反之則不適合做內(nèi)參;且M值越小則內(nèi)參基因的表達(dá)就越穩(wěn)定。由圖3可見，本實(shí)驗(yàn)中11個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5，說明所有基因的表達(dá)都比較穩(wěn)定。其中EF1b和MDH的M值最低（圖3A），其他基因的表達(dá)穩(wěn)定性依次為18S>GAPDH>UBC> Actin>CYP>EF1a>TUBb>UBQ>TUBa，TUBa的M值最高。因此，geNorm軟件分析認(rèn)為EF1b、MDH的穩(wěn)定性最好，TUBa的穩(wěn)定性最差。geNorm程序還可計(jì)算引入1個(gè)新基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異V值，并根據(jù)Vn/Vn+1值來確定所需最適內(nèi)參基因的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在11個(gè)檢測的候選內(nèi)參基因中，V2/3的比值為0.131，小于推薦值0.15，說明本次實(shí)驗(yàn)供試的澳洲堅(jiān)果不同組織器官中，最適合的內(nèi)參基因數(shù)目是2（圖3B）。因此，根據(jù)geNorm分析認(rèn)為，EF1b和MDH為最穩(wěn)定內(nèi)參基因。

2.3.2? ΔCt算法分析澳洲堅(jiān)果不同組織內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? ΔCt算法根據(jù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值（STDEV）確定基因表達(dá)的穩(wěn)定性[22]，標(biāo)準(zhǔn)偏差越小則基因越穩(wěn)定。使用ΔCt分析結(jié)果顯示（表2），18S為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，其次為GAPDH基因，MDH和EF1b基因排在中間，TUBa為最不穩(wěn)定基因。

2.3.3? NormFinder分析澳洲堅(jiān)果不同組織中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? NormFinder程序的穩(wěn)定性分析同geNorm分析一樣，也是基于候選內(nèi)參基因的相對定量表達(dá)數(shù)據(jù)，穩(wěn)定性數(shù)值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定[23]。NormFinder算法不但可以估計(jì)候選內(nèi)參基因的整體表達(dá)差異，還可以計(jì)算樣品組間的變異，但是只能篩選出一個(gè)最合適的內(nèi)參基因[24]。本研究使用NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排序見表2。分析認(rèn)為，GAPDH為最穩(wěn)定基因，其次是CYP、EF1a和18S，然后才是MDH和EF1b，TUBa為最不穩(wěn)定基因。

2.3.4? BestKeeper分析澳洲堅(jiān)果不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性? BestKeeper程序是以每個(gè)樣品的原始Cp值進(jìn)行配對相關(guān)分析。計(jì)算Cp值得到標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、變異系數(shù)（CV）、配對相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient），如果SD和CV越小，該內(nèi)參基因越穩(wěn)定，反之穩(wěn)定性越差。一般認(rèn)為，候選內(nèi)參基因SD小于1的被認(rèn)為是最穩(wěn)定表達(dá)，由表3可見，除TUBa（2.38）和UBQ（1.108）基因外，本研究中其他的9個(gè)候選內(nèi)參基因SD值都小于1，說明這些基因的表達(dá)都比較穩(wěn)定。MDH和EF1b的SD分別為0.361和0.411，這個(gè)結(jié)果與geNorm的分析結(jié)果一致。

2.3.5? RefFinder綜合排序分析? 由于各個(gè)算法原理不同，得到最穩(wěn)定基因的結(jié)果差異較大。本實(shí)驗(yàn)使用RefFinder程序?qū)ι鲜?種算法的排序結(jié)果進(jìn)行綜合分析[21]，數(shù)值越小，則基因越穩(wěn)定;反之穩(wěn)定性越差。結(jié)果見表3，MDH表達(dá)最穩(wěn)定，其次為18S rRNA，TUBa基因的穩(wěn)定性最差。

2.4? 澳洲堅(jiān)果SAD基因的表達(dá)分析和內(nèi)參基因的驗(yàn)證

植物硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶（SAD）是一種質(zhì)體中存在的催化硬脂酸烴鏈脫飽和合成油酸的可溶性酶，是植物中形成不飽和脂肪酸的前提。已有研究表明，澳洲堅(jiān)果SAD能以18∶0-ACP和16∶0-ACP為底物催化生成單不飽和脂肪酸——油酸和棕櫚油酸，并且對底物18∶0- ACP的酶反應(yīng)速率高于底物16∶0-ACP[25]。為了分析SAD基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中的表達(dá)情況，分別用MDH和18S rRNA（最穩(wěn)定內(nèi)參）、TUBa基因（最不穩(wěn)定內(nèi)參）作為參照基因歸一化定量。結(jié)果顯示，以MDH和18S rRNA為參照時(shí)，基因在各個(gè)組中的表達(dá)量呈下降的趨勢;以TUBa基因作為參照時(shí)莖和葉片中基因表達(dá)上調(diào)，果皮和果仁中基因上調(diào)表達(dá)，而UBQ則相反;因此，如果采用UBQ和TUBa作為內(nèi)參基因，那么則會得到完全相反的定量結(jié)果（圖4）。結(jié)果表明，選擇合適的內(nèi)參基因直接影響基因的表達(dá)準(zhǔn)確性，在本實(shí)驗(yàn)中，MDH基因最適合作為澳洲堅(jiān)果不同組織中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因。

3? 討論與結(jié)論

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)情況是理解生物學(xué)調(diào)控機(jī)制研究中常用的重要手段。但實(shí)際情況是，常用內(nèi)參基因的表達(dá)在不同組織器官中、不同處理?xiàng)l件下、不同類型細(xì)胞中和不同發(fā)育階段中并不是恒定表達(dá)，也會隨著條件改變[26]。因此，為了獲得更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常會選擇一個(gè)或多個(gè)持家基因作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化，故選擇合適的內(nèi)參基因是獲得準(zhǔn)確定量結(jié)果的關(guān)鍵[27]。

在本研究中，選擇了傳統(tǒng)的11個(gè)常用看家基因，包括18S rRNA，Actin，CYP，EF1a，EF1b，GAPDH，MDH，TUBa，TUBb，UBQ，UBC等基因，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法分析這些候選內(nèi)參基因在不同組織器官中的表達(dá)穩(wěn)定性。由于各個(gè)程序的計(jì)算方法原理不同，各軟件得出的穩(wěn)定性結(jié)果基本一致，但仍舊有些差異。geNorm分析程序根據(jù)各個(gè)候選內(nèi)參基因在每個(gè)樣品中表達(dá)情況的相似度進(jìn)行排序，不考慮其他內(nèi)參基因，故不適于區(qū)分表達(dá)模式類似的基因。而NormFinder是以組內(nèi)方差與組間方差進(jìn)行排序，綜合考慮其他基因之后，對候選內(nèi)參基因進(jìn)行打分。本試驗(yàn)對4種算法數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)：geNorm和BestKeeper軟件得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序基本一致，MDH和EF1b表達(dá)最穩(wěn)定，TUBa表達(dá)最不穩(wěn)定。而NormFinder的分析認(rèn)為：GAPDH的表達(dá)最穩(wěn)定，TUBa表達(dá)最不穩(wěn)定，MDH和EF1b的穩(wěn)定性排第5和第6，與geNorm和BestKeeper分析結(jié)果差異較大。ΔCt算法分析結(jié)果表明，18S rRNA基因表達(dá)最穩(wěn)定，其次是GAPDH，MDH和EF1b的穩(wěn)定性排第3和第4。最后，我們通過幾何平均算法對上述4種結(jié)果綜合排序：MDH>18S rRNA>GADPH> EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ>TUBa。因此，在本研究中，可以初步選擇MDH作為澳洲堅(jiān)果實(shí)根、莖、葉、果皮、果仁不同組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

魏永贊等[28]認(rèn)為，β-Actin在荔枝果實(shí)發(fā)育不同階段和外源生長調(diào)節(jié)劑處理下表達(dá)穩(wěn)定性較好，但是，在114份香蕉品種中比較發(fā)現(xiàn)Actin表達(dá)最不穩(wěn)定，在本實(shí)驗(yàn)中，Actin基因的表達(dá)沒有MDH基因穩(wěn)定。蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase， MDH）是一類廣泛存在動植物中的酶，參與植物體的多個(gè)代謝途徑，根據(jù)輔酶專一性、亞細(xì)胞定位和生理功能。在小麥的研究中發(fā)現(xiàn)：TaMDH基因在不同物種間高度保守，推測cyMDH可能由一個(gè)共同的祖先進(jìn)化而來，并且可能屬于管家基因[29-30]。在黃花大苞姜花粉母細(xì)胞不同的發(fā)育時(shí)期進(jìn)行qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)：MDH的表達(dá)最穩(wěn)定，可以作為內(nèi)參基因[31]。本研究結(jié)果表明：MDH基因在澳洲堅(jiān)果不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性最好，適合做內(nèi)參基因?qū)Π闹迗?jiān)果不同組織中的基因進(jìn)行歸一化分析。

MiSAD基因是澳洲堅(jiān)果的合成和積累不飽和脂肪酸的關(guān)鍵基因，本研究分別以最穩(wěn)定基因MDH和最不穩(wěn)定基因TUBa分別作為內(nèi)參對MiSAD基因進(jìn)行歸一化分析。研究結(jié)果表明：MDH和18S rRNA為參照時(shí)，基因在各個(gè)組中的表達(dá)量呈下降的趨勢;以TUBa基因作為參照時(shí)，在莖葉中呈上調(diào)表達(dá)，果皮和果仁中則表達(dá)量降低，而UBQ則相反;如果采用UBQ和TUBa作為內(nèi)參基因，那么則會得到完全相反的定量結(jié)果。因此，如果在進(jìn)行基因表達(dá)分析前，沒有對候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析，盲目使用內(nèi)參基因，會導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。由于不同的環(huán)境條件，如生物脅迫和非生物脅迫都會影響內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，接下來將進(jìn)一步對不同處理?xiàng)l件下，澳洲堅(jiān)果中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究。

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