越橘品種‘北陸’各器官發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量變化研究*

劉海楠，谷 雨，孫海悅，李亞東

（吉林省小漿果遺傳育種與創(chuàng)新利用工程研究中心，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長春 130118）

越橘為杜鵑花科越橘屬（Vaccinium）植物，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的小漿果，其果實(shí)中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是多年生的灌木小漿果類果樹。越橘的樹體差異較明顯，果實(shí)大小、形狀、色澤各異。其口感細(xì)膩，甜酸適度，漿汁豐富，果實(shí)可加工可鮮食[1-3]。隨著人們生活水平的提高，市場上對越橘果實(shí)的需求量越來越大，其栽培面積也在逐年增加，同時(shí)人們對果實(shí)的品質(zhì)要求也越來越高。植物內(nèi)源激素是植物正常代謝的產(chǎn)物，是在植物體內(nèi)合成的，并能從產(chǎn)生部位轉(zhuǎn)移到作用部位，在低濃度下就能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的小分子有機(jī)化合物質(zhì)。植物內(nèi)源激素可以通過很多水平來起作用，包括激素合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、感受和傳導(dǎo)[4]，從影響細(xì)胞的分裂、伸長、分化到影響植物發(fā)芽、生根、開花、結(jié)實(shí)、性別的決定、休眠和脫落等[5-7]。

關(guān)于植物激素的研究一直是植物科學(xué)前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[8]。國內(nèi)外關(guān)于植物內(nèi)源激素的研究數(shù)量有很多，在其他果樹上研究得比較廣泛，在越橘上僅在果實(shí)和花芽上有所研究，如李艷芳[9]、方仲相[10]、宋陽[11]及Oh[12]等人研究表明，在越橘果實(shí)中，脫落酸（ABA）能提高越橘果實(shí)果糖和葡萄糖的含量，促進(jìn)果實(shí)軟化、成熟和花色苷的積累并促進(jìn)果實(shí)的顯色，低濃度的ABA 能促進(jìn)越橘花芽萌發(fā)，并且ABA 含量低的品種更容易成花。而生長素（IAA）抑制糖類物質(zhì)和花色苷的合成，并且低濃度的IAA 能夠促進(jìn)越橘的花芽分化。玉米素（ZT）的含量在越橘果實(shí)快速生長期達(dá)到最高，并發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用。赤霉素（GA3）對糖類物質(zhì)及花色苷的合成積累調(diào)控作用不顯著，但是低濃度的赤霉素能夠促進(jìn)越橘芽由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)是對越橘地上部和地下部的器官發(fā)育過程中激素含量的變化進(jìn)行研究，更加全面地分析植物激素對整個(gè)越橘植株的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與來源

試驗(yàn)材料選自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)漿果園，10 年生的越橘品種‘北陸’不同時(shí)期的花、果實(shí)、花芽、新梢、葉片及須根。

1.2 材料的采集

從春季撤防寒土開始取樣直至秋季落葉為止，選取15 株長勢一致的健康樹，每5 株樹為1 個(gè)重復(fù)，取樣時(shí)分東、西2 個(gè)方向進(jìn)行，每次每種樣品取10 g，樣品用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)預(yù)處理后用液氮處理放入-40 ℃冰箱保存。

（1）花。從越橘花芽芽鱗松動開始取樣，每7 d 取1 次樣，取到花冠筒完全膨大開放為止。

（2）果實(shí)。從越橘花后3 d 即幼果期開始采集，每3 d 取1 次樣，取到果實(shí)成熟。

（3）花芽。從果實(shí)落果開始取樣，每7 d 取1次樣，到落葉期為止，取樣部位是選取停長的枝條上花芽，從頂芽往下數(shù)1～5 個(gè)芽位。

（4）新梢。從新梢生長到5 cm 長開始取樣，每7 d 取1 次樣，到落葉期為止，取樣部位是取上部5 cm 長的新梢，去掉葉片及芽。

（5）葉片。從展葉期開始取樣，每7 d 采1 次樣，到落葉期為止，取樣部位從頂端往下數(shù)1～9片葉片，洗凈擦干液氮速凍，-40 ℃保存。

（6）須根。從越橘展葉期開始取樣，每14 d取1 次樣，到落葉期為止，取樣部位為距離樹主干20 cm 的位置向下挖30 cm 深，取0～30 cm 處的須根，用水將須根上的泥土沖洗掉，濾紙吸干水，液氮速凍，-40 ℃保存。

金礦石常采用磨礦—浮選—浮選金精礦細(xì)磨—氰化浸出常規(guī)工藝獲取成品金[1]。而大部分金礦中含有低品位的有色金屬元素，如鉛、銅等，其價(jià)值大約是金價(jià)值的10%或者更高，采用常規(guī)工藝無法有效回收這些共伴生有價(jià)元素[2]。調(diào)研走訪得出企業(yè)不愿綜合回收的主要原因有兩方面：(1)在金價(jià)高位運(yùn)行時(shí)期，企業(yè)重視金產(chǎn)量，忽視鉛、銅等伴生元素的回收研究工作，不愿投入時(shí)間精力研發(fā)、改造；(2)在金價(jià)低迷時(shí)期，企業(yè)又無力進(jìn)行流程優(yōu)化、改進(jìn)，因此造成了資源的極大浪費(fèi)。

1.3 越橘各器官內(nèi)源激素的提取與測定

1.3.1 激素的提取

（1）浸提。稱取2 g 樣品，在冰浴下研磨成漿，加入80%預(yù)冷甲醇20 mL，保鮮膜密封，4 ℃冰箱浸提16 h（注意避光）。

（2）去甲醇。浸提液10 000 r/min（4 ℃）離心10 min，取上清液，向殘?jiān)屑尤?0 mL 80%冷甲醇，10 000 r/min（4 ℃）離心10 min，合并上清液丟棄殘?jiān)?。將上清液?0 ℃下減壓蒸發(fā)至沒有甲醇?xì)堄啵s剩余5 mL）。將剩余水相轉(zhuǎn)移到三角瓶中。

（3）萃取脫色。分別用10 mL 石油醚萃取脫色3 次棄去醚相，加入0.01 g PVPP，超聲波振蕩30 min，抽濾取上清（常溫13 000 r/min離心10 min），再分別用10 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并酯相。將酯相在40 ℃條件下減壓蒸發(fā)至干。

（4）定容。再用甲醇（色譜純）溶液溶解并定容2 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾得到待測液，保存在4 ℃冰箱中。

1.3.2 內(nèi)源激素HPLC 檢測

HPLC 檢測所需的色譜條件與周熒等[13]在高效液相色譜測定藍(lán)莓葉片內(nèi)源激素的方法研究中的條件一致。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與測定

分別稱取0.005 g 的ABA、IAA、GA3和ZT 的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解配制成50 mg/L 的母液，過0.45 μm 的有機(jī)相濾膜。將ABA、IAA、GA3和ZT 在1.3.2 的色譜條件下進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間，以此來定性；將標(biāo)準(zhǔn)母液稀釋并混合進(jìn)樣，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 分析軟件和Microsoft Excel 2010 應(yīng)用程序處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘花生長發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量變化

從圖1 中可以看出，越橘花中ABA 呈先上升后下降的變化趨勢，在5 月4 日即芽鱗分離這一時(shí)期出現(xiàn)峰值，然后先下降后逐漸趨于平穩(wěn)。IAA 的含量變化趨勢與ABA 的含量變化趨勢完全相反，在芽鱗分離這一時(shí)期即5 月4 日出現(xiàn)最小值，隨后又開始上升，在單花完全分離時(shí)出現(xiàn)峰值后又下降。GA3呈先上升后下降再上升的變化趨勢，在花冠筒完全膨大時(shí)期即5 月22 日出現(xiàn)最大值。ZT 含量的變化呈先上升后緩慢下降的趨勢，但ZT 的含量在花的整個(gè)發(fā)育過程中均處于較高水平，在5 月4 日出現(xiàn)峰值。

圖1 ‘北陸’花中內(nèi)源激素含量的變化

2.2 越橘果實(shí)生長發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量變化

從圖2 可以看出，在果實(shí)的整個(gè)發(fā)育過程中4種內(nèi)源激素含量均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。在坐果期，ZT 和IAA 含量較高，此時(shí)果實(shí)處在第1 個(gè)快速生長期，在坐果后果實(shí)迅速膨大，隨著果實(shí)的增大，ZT、IAA 和GA3的含量都逐漸降低，在6 月9 日降到最低值，果實(shí)進(jìn)入緩慢生長期。在第2 次快速生長前期，果實(shí)內(nèi)的ZT、IAA 和GA3含量迅速上升，在6 月27 日達(dá)第2 個(gè)峰值，隨著果實(shí)的逐漸成熟，3 種內(nèi)源激素的含量總體呈下降趨勢。從圖中可以看出，ABA 一直維持在較高的水平，在果實(shí)發(fā)育過程中，ABA 含量出現(xiàn)2 次峰值，在花后第6 d 即5 月28 日出現(xiàn)1 次峰值，第2 次峰值出現(xiàn)在花后第42 d 即7 月3 日，此時(shí)果實(shí)進(jìn)入粉果期向果實(shí)的成熟期過渡。

圖2 ‘北陸’果實(shí)中內(nèi)源激素含量的變化

2.3 越橘花芽中內(nèi)源激素含量變化

在花芽分化過程中，4 種內(nèi)源激素的含量變化如圖3 所示，IAA 和ABA 的含量整體高于ZT 和GA3含量，IAA 的含量變化趨勢是先下降后上升，ABA的含量呈先下降然后迅速上升后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，ZT的含量在8 月9 日出現(xiàn)1 個(gè)高峰，在其他時(shí)期都處于較平穩(wěn)的一個(gè)趨勢，GA3的含量變化是先上升（在8 月9 日達(dá)到最大值），然后開始下降，后又開始上升，然后保持平穩(wěn)的趨勢。

圖3 ‘北陸’花芽中內(nèi)源激素含量的變化

2.4 越橘新梢中內(nèi)源激素含量變化

從圖4 可以看出，在新梢生長過程中，IAA、GA3、ZT 含量變化趨勢均呈雙S 變化曲線，而ABA的含量則呈先下降后上升之后又逐漸下降的平緩變化趨勢。5 月中旬IAA、GA3、ZT 含量較低，之后隨著新梢逐漸生長，IAA、GA3、ZT 含量逐漸上升，在5 月底達(dá)到較大值，之后又經(jīng)過迅速下降的過程后緩慢上升，在8 月底IAA、GA3、ZT 含量達(dá)到第2 個(gè)峰值，而ABA 的含量一直呈下降趨勢，此時(shí)新梢處于旺盛生長期。之后IAA、GA3、ZT 含量迅速下降后維持在一個(gè)較低水平，而ABA 逐漸上升后又下降，此時(shí)新梢生長速度相對較慢甚至停止生長。

圖4 ‘北陸’新梢中內(nèi)源激素含量的變化

2.5 越橘葉片中內(nèi)源激素含量變化

從圖5 可以看出，4 月下旬展葉時(shí)IAA、GA3、ZT 含量相對較低，之后隨著葉片面積的逐漸增長，IAA、GA3、ZT 含量逐漸上升，在6 月初達(dá)到峰值，此后IAA 含量逐漸下降，而GA3和ZT 含量迅速下降，到6 月底下降速度減慢，7 月底GA3、ZT 又開始迅速回升，到8 月底9 月初達(dá)到第2 個(gè)高峰，后緩慢下降至趨于平穩(wěn)。ABA 含量在展葉初期相對較高，之后隨著葉片的不斷增長，其含量持續(xù)下降，到6 月初降至較低點(diǎn)，后逐漸上升，7 月初達(dá)到峰值后下降，7 月底降至較低后逐漸上升，此時(shí)恰為果實(shí)采收期。

2.6 須根中內(nèi)源激素含量變化

須根的生長發(fā)育直接影響地上部器官的生長發(fā)育，由圖6 可以看出，須根生長發(fā)育過程中IAA、GA3、ZT 含量均呈雙S 形變化曲線，ABA 含量變化與其相反。5 月10 日地上部展葉開始隨著地上部分逐漸增長，須根中IAA、GA3、ZT 的含量也逐漸上升，在6 月7 日出現(xiàn)第1 個(gè)峰值，隨后又開始下降，在7 月19 日出現(xiàn)較低值，而ABA 的含量出現(xiàn)較高的峰值，此時(shí)地上部分的果實(shí)已進(jìn)入成熟期，之后IAA、GA3、ZT 3 種激素含量又逐漸上升后開始緩慢下降，在8 月底出現(xiàn)第2 次峰值，此時(shí)地上部分生長緩慢甚至停止生長。

圖5 ‘北陸’葉片中內(nèi)源激素含量的變化

圖6 ‘北陸’須根中內(nèi)源激素含量的變化

3 結(jié)論與討論

3.1 越橘各器官內(nèi)4 大內(nèi)源激素含量的變化趨勢

有關(guān)植物內(nèi)源激素的研究很早就有很多報(bào)道，在越橘上也有一定的研究，但是對整株越橘各個(gè)器官中的激素變化尚未有人研究。前人研究表明，植物的生長發(fā)育離不開植物內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)[14]，本試驗(yàn)通過運(yùn)用HPLC 法對越橘品種‘北陸’的花、果實(shí)、花芽、新梢、葉片及須根中ABA、IAA、GA3、ZT 等植物激素進(jìn)行檢測。

本試驗(yàn)研究的花中4 種激素的含量變化趨勢與郭辰等[15]在東興金花茶花果期內(nèi)源激素動態(tài)變化研究結(jié)果的相同之處是：IAA 和GA3整體都處于上升趨勢，ABA 呈先上升后下降的趨勢，而ZT 的含量變化趨勢完全不同，本試驗(yàn)中ZT 的含量整體處在一個(gè)平穩(wěn)的較高水平，而郭的研究中ZR 含量整體呈下降趨勢，可能是樹種不同所導(dǎo)致，雖然ZT和ZR 都屬于細(xì)胞分裂素，但是屬于2 種化合物，這可能是導(dǎo)致結(jié)果不同的根本原因。在越橘果實(shí)中的4種激素含量變化趨勢是ABA呈先下降再上升然后緩慢下降后趨于平穩(wěn)，GA3和IAA 在果實(shí)發(fā)育整個(gè)過程中均呈下降趨勢，并且GA3一直處于較低水平，ZT 含量變化是呈先下降再上升再下降的趨勢，GA3和ZT 的含量在果實(shí)發(fā)育中期較高，IAA 含量僅在早期較高，這一試驗(yàn)結(jié)果與李艷芳[16]在研究越橘品種‘日出’和‘喜來’果實(shí)中的內(nèi)源激素含量變化研究結(jié)果一致。與趙利娟等[17]研究的藍(lán)靛果忍冬果實(shí)中GA3、IAA、ZT 和ABA 的含量變化趨勢也一致。本試驗(yàn)研究的花芽中的GA3、IAA 和ABA 含量變化趨勢與宋楊等[11]在藍(lán)莓不同品種花芽形成過程中內(nèi)源激素變化的研究中5 種不同品種的藍(lán)莓果實(shí)生長發(fā)育過程中的內(nèi)源激素含量變化趨勢基本一致，GA3的含量變化呈上升—下降—上升的趨勢，IAA 的含量變化是呈先下降后又上升的趨勢，ABA的含量變化是呈先下降再上升的趨勢，而檢測的細(xì)胞分裂素雖然與宋楊等研究結(jié)果不同，但是變化趨勢基本相同。

本試驗(yàn)研究的越橘新梢中的GA3、IAA 和ABA的含量變化趨勢與馬海燕[18]在葡萄生長過程中內(nèi)源激素含量變化研究中的趨勢相同，二者研究的GA3和IAA的含量變化趨勢均是上升—下降—上升—下降，ABA 含量變化是呈先下降再上升的趨勢。在葉片中的GA3、IAA 和ABA 的含量變化趨勢與高慶玉等[14]在樹莓葉片生長過程中內(nèi)源激素含量變化初步研究中相一致，二者GA3含量變化呈先上升再下降然后上升最后再下降的趨勢，IAA 含量變化呈先上升后又下降的趨勢，ABA 含量變化呈下降—上升—緩慢下降—緩慢上升后趨于一個(gè)平穩(wěn)的趨勢。本試驗(yàn)所研究的新梢和葉片中的細(xì)胞分裂素在其他樹種上很少有研究，并且前人很少有對植物根系中的GA3、IAA、ZT 和ABA 含量的動態(tài)變化進(jìn)行研究，在越橘上更是未見報(bào)道。本試驗(yàn)的這些研究可為未來在這方面的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

3.2 越橘各器官內(nèi)4 大內(nèi)源激素的變化與品種發(fā)育的關(guān)系

本試驗(yàn)中花分為5 個(gè)時(shí)期分別是芽鱗松動期（4月28 日）、芽鱗分開期（5 月4 日）、花分開芽鱗脫落期（5 月10 日）、單花完全分離期（5 月16 日）和花冠筒完全膨大開放期（5 月22 日）。從芽鱗松動起開始到芽鱗分開期這段時(shí)期，ABA、ZT 和GA3的含量變化都是上升的趨勢；IAA 則與其相反，從芽鱗分開到花分開芽鱗脫落這段時(shí)期，ABA、ZT 和GA3的含量呈下降狀態(tài)，相反IAA 含量開始升高直至花冠筒完全膨大開放為止。從花分開芽鱗脫落開始，ZT 和ABA 的含量緩慢下降至花冠筒完全開放，而GA3含量從花分開芽鱗脫落時(shí)期開始升高至花冠筒完全膨大開放時(shí)達(dá)到最大值。IAA 和GA3對越橘花的開放可能有較大的促進(jìn)作用。

根據(jù)前人研究[19]，越橘果實(shí)在生長發(fā)育階段大致可分為3 個(gè)階段，分別為幼果期（第1 次快速生長期）、緩慢生長期、轉(zhuǎn)色期和成熟期（第2 次快速生長期）。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在幼果期4 大內(nèi)源激素的含量逐漸減少，而ABA 含量持續(xù)下降到果實(shí)緩慢生長期，在緩慢生長期之后，ABA 含量迅速上升，其他3 種激素含量在緩慢生長期呈上升趨勢，在轉(zhuǎn)色期，4 種激素含量又開始緩慢下降，在7 月15 日之后進(jìn)入完全成熟期。在果實(shí)發(fā)育初期，4 種激素含量都較高，GA3和ZT 的含量較高有利于果實(shí)的細(xì)胞分裂和生長，IAA 的含量較高有利于果實(shí)坐果，ABA 含量出現(xiàn)1 個(gè)小高峰可能與花的脫落有關(guān)，在第2 次快速生長階段前期，GA3、IAA 和ZT 含量處于較高水平，有利于果實(shí)的快速生長，在進(jìn)入成熟期之前，高含量的ABA 有利于果實(shí)的成熟，這一研究結(jié)果與高慶玉等[20]在樹莓果實(shí)激素研究和趙利娟等[17]在藍(lán)靛果忍冬果實(shí)中激素研究的結(jié)果相一致。

根據(jù)周強(qiáng)[21]的試驗(yàn)結(jié)果，可以把越橘品種‘北陸’的花芽分化分為7 個(gè)時(shí)期，分別為未分化期（7月24 日）、分化初期（8 月1 日）、花序原基分化期（8 月9 日）、萼片原基分化期（8 月17 日）、花瓣原基分化期（8 月25 日）、雄蕊原基分化期（9 月2日）以及雌蕊原基分化期（9 月18—26 日）。在花芽不同的分化時(shí)期，激素含量的變化也有所不同，花芽中的IAA 和ABA 的含量變化趨勢一致，均呈先下降后上升的趨勢，從7 月26 日花芽未分化期開始到8 月30 日花瓣原基分化期，IAA 和ABA 的含量持續(xù)下降，之后迅速上升，從9 月6 日雄蕊原基分化期到花芽分化完成時(shí)，IAA 和ABA 的含量趨于平緩。ZT 含量的變化是從未分化期開始上升，在8 月9 日花序原基分化期出現(xiàn)峰值后再下降到8 月16 日萼片原基分化期，隨后上升到8 月30 日花瓣原基分化期后再繼續(xù)緩慢上升并保持在一個(gè)相對較低水平上。GA3含量從未分化期開始升高，在8月9 日花原基分化期達(dá)到峰值后下降到8 月30 日花瓣原基分化期，隨后略有上升，在雄蕊原基分化期后一直保持在較低水平，推測較低含量的GA3有利于花芽的發(fā)育，這一試驗(yàn)結(jié)果與吳曼等[22]在‘紅麗’海棠芽的研究中的結(jié)果相似。

據(jù)前人研究結(jié)果可知，越橘新梢在整個(gè)生長周期有2 次生長高峰[23-24]，即春季生長高峰期和秋季生長高峰期。本試驗(yàn)所用的試材第1 次快速生長期是5 月中旬到6 月上旬，6 月末出現(xiàn)黑點(diǎn)期新梢停止生長，約2 周之后新梢開始第2 次快速生長，時(shí)間是7 月中旬到8 月末，9 月之后新梢開始緩慢生長直至10 月停止生長。新梢中的IAA、GA3和ZT的含量在2 次快速生長階段都呈上升趨勢，而ABA的含量在新梢生長階段一直呈下降趨勢，直到9 月初開始升高并一直處在較高水平直至停止生長?？赏茰y高含量的ABA 加速了新梢的衰老。而葉片的生長趨勢和新梢的生長是分不開的，在新梢旺長期葉片也迅速生長，在生長季達(dá)到高峰，夏末至秋季逐漸下降，葉片內(nèi)的激素含量隨著葉片的生長而有所變化，從葉片展葉期開始，整個(gè)旺長期GA3、IAA和ZT 的含量不斷升高。在第2 個(gè)新梢旺長期，GA3和ZT 含量呈上升趨勢，IAA 的含量變化在第1 次旺長期后一直處于下降趨勢，而ABA 含量變化與IAA 完全相反。由此可見，高含量的GA3、IAA 和ZT 有利于葉片面積的擴(kuò)大，促進(jìn)葉片的生長，延緩葉片的衰老，高濃度的ABA 能夠促進(jìn)葉片的脫落。

前人研究結(jié)果[25]表明，越橘根系在生長周期內(nèi)出現(xiàn)2 次生長高峰，分別在6 月和9 月，在第1 次根系快速生長階段，ABA 含量變化呈先下降后又升高趨勢；在根系第2 次快速生長階段，GA3的含量是先升高到一個(gè)峰值后又開始下降，IAA 和ZT 的含量變化呈下降趨勢，ABA 則與其相反，呈上升趨勢。前人研究表明，植物根系中合成的激素向地上部運(yùn)輸，供地上部的生長發(fā)育，在根系的2 次旺盛生長發(fā)育階段，地上的新梢也是旺長期，推測根系高含量的GA3、IAA 和ZT 對地上部有一定的影響，而且在地上部果實(shí)進(jìn)入成熟期時(shí)須根中的ABA 含量也是升高的。