基于測序技術(shù)探究卡介菌生物制劑核酸物質(zhì)基礎(chǔ)

周云喜　胡亞磊　楊勝梅　謝安　趙李劍　黃勝　童春義

〔摘要〕 目的 明確免疫調(diào)節(jié)劑卡介菌多糖核酸注射液中起免疫增強作用的核酸物質(zhì)基礎(chǔ)。方法 （1）核酸提?。涸噭┖蟹ǚ蛛x提取卡介菌及卡介菌多糖核酸注射液的核酸部分;（2）測序：采用第三代測序技術(shù)和第二代宏測序技術(shù)分別對卡介菌基因組和注射液核酸片段序列進行測序，獲得核酸序列;（3）數(shù)據(jù)分析：統(tǒng)計分析核酸序列中免疫功能的含胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine-phosphoric acid-guanine，CpG）的典型CpG基序數(shù)量及分布情況;（4）免疫活性分析：采用酶聯(lián)免疫法分析提取核酸刺激細(xì)胞釋放免疫因子TNF-α效果。結(jié)果 注射液核酸片段中平均每拷貝含有4 000個典型CpG基序，占總基因組的0.5%;富含CpG基序核酸片段刺激細(xì)胞釋放TNF-α濃度顯著強于無CpG基序核酸片段（P<0.01），顯示了較強的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)論 卡介菌多糖核酸注射液核酸物質(zhì)中富含CpG基序而表現(xiàn)較強的免疫活性，為進一步開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)制劑提供理論基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 卡介菌;CpG;生物信息學(xué);測序;物質(zhì)基礎(chǔ)

〔中圖分類號〕R927.11? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.008

Exploration of Nucleic Acid Material Basis of BCG Biological Preparation Based on

Sequencing Technology

ZHOU Yunxi1， HU Yalei2，3， YANG Shengmei1， XIE An2， ZHAO Lijian3*， HUANG Sheng2， TONG Chunyi2，3

（1. Hunan Siqi Biopharmaceutical Co.， Ltd.， Changsha， Hunan 410205， China; 2. Jiuzhitang Co.， Ltd.， Changsha， Hunan 410021， China; 3. College of Biology， Hunan University， Changsha， Hunan 410082， China）

〔Abstract〕 Objective To clarify the nucleic acid material basis of immunomodulator BCG polysaccharide nucleic acid injection for immune enhancement. Methods（1） Nucleic acid extraction： the nucleic acid part of BCG and BCG polysaccharide nucleic acid injection were isolated and extractedby kit method; （2） Sequencing： the third-generation sequencing technology and second-generation macro-sequencing technology were used respectively to sequence the BCG genome and the injection nucleic acid fragment sequences to obtain the nucleic acid sequence; （3） Data analysis： statistical analysis was performed for the typical cytosine-phosphoric acid-guanine （CpG） motif quantity and distribution of CpG containing immune function in nucleic acid sequence; （4） Immunoactivity analysis： Enzyme linked immunoassay was used to analyze the effect of extracted nucleic acid to stimulate cells to release immune factor TNF-α. Results There were about 4000 typical CpG motifs in each copy on average in injection nucleic acid fragments， accounting for 0.5% of the total gene group. Nucleic acid fragments rich in CpG motifs stimulate cells to release TNF-α at a concentration that is significantly stronger than nucleic acid fragments without CpG motifs， showing a stronger immunomodulatory effect. Conclusion The nucleic acid fractions of BCG polysaccharide nucleic acid injection are rich in CpG motif and show strong immune activity， which provides theoretical basis for further development of new immunomodulatory agents.

〔Keywords〕 BCG; cytosine-phosphoric acid-guanine; bioinformatics; sequencing; substances

卡介菌多糖核酸注射液是在卡介苗素基礎(chǔ)上，通過改進工藝生產(chǎn)得到的一種新型非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，主要由核酸及多糖等多種免疫活性物質(zhì)組成，解決了其它免疫調(diào)節(jié)劑大分子蛋白清除不徹底等問題，更易于吸收，減少了過敏反應(yīng)，副作用更小[1]。20世紀(jì) 70年代我國開始對卡介菌多糖核酸提取物進行免疫活性的研究，80年代末將其用于臨床，現(xiàn)在相關(guān)的注射液產(chǎn)品已經(jīng)暢銷國內(nèi)外30年，是免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品中的明星產(chǎn)品?？ń榫嗵呛怂崮茈p向調(diào)節(jié)機體細(xì)胞免疫和體液免疫功能， 具有抗感染、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤等作用[2-3]。除廣泛應(yīng)用于慢性支氣管炎、哮喘和反復(fù)呼吸道感染的防治外，在腫瘤免疫治療等領(lǐng)域的應(yīng)用也取得了一些新的進展[4-5]。

卡介菌多糖核酸產(chǎn)品的免疫調(diào)節(jié)作用得到眾多臨床醫(yī)生的病例驗證[6-7]，然而，產(chǎn)品作用機制未得到合理的、系統(tǒng)的解釋。針對其中的核酸物質(zhì)，本文通過調(diào)研文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)一類核酸結(jié)構(gòu)，即含未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine-phosphoric acid-guanine，CpG）二核苷酸的核酸片段與卡介菌多糖核酸產(chǎn)品適應(yīng)證——超敏類疾病密切相關(guān)[8-10]。CpG核酸片段在細(xì)菌和病毒基因組含量是人體的20倍，可顯著引起人體做出免疫應(yīng)答，刺激釋放大量免疫細(xì)胞和免疫因子。近年研究表明CpG主要是通過識別和結(jié)合人體的Toll受體TLR9[11-12]，激活DC等多種免疫活性細(xì)胞，刺激多種免疫活性細(xì)胞分泌免疫活性分子（趨化因子、黏附分子和共刺激分子）而發(fā)揮其免疫作用。因此，卡介菌多糖核酸產(chǎn)品的免疫作用可能與該類核酸的免疫效應(yīng)有關(guān)。本文針對核酸物質(zhì)的研究特點，應(yīng)用第三代測序技術(shù)進行全基因組快速測定和第二代宏測序技術(shù)對卡介菌注射液核酸片段進行測序，再利用生物信息學(xué)技術(shù)進行分析探討，結(jié)合文獻(xiàn)報道，分析具有免疫活性的CpG結(jié)構(gòu)在基因組和產(chǎn)品中的存在情況，以闡述產(chǎn)品核酸物質(zhì)基礎(chǔ)，為進一步開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料與試劑

卡介菌菌體以及卡介菌多糖核酸制劑[注射制劑，批號分別為20170601（A），20170642（B），20170661（C），20170682（D），20170691（E）和20180110（a）]由湖南斯奇生物制藥有限公司提供;RAW264.7細(xì)胞購于中南大學(xué)細(xì)胞庫;Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技有限公司;小鼠TNF-α ELISA試劑盒：欣博盛生物科技有限公司;PCR引物：生工生物工程（上海）股份有限公司;2×Power Taq PCR MasterMix：北京百泰克生物技術(shù)有限公司;溶菌酶：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2? 主要儀器

MiSeq二代測序儀（美國illumina公司）;PacBio Sequel三代測序儀（美國PacBio公司）;細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Eppendorf公司）;YP1002N型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;THD-0506型恒溫水槽（寧波天恒儀器廠）;5418R/5702R型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;NanoDrop2000型超微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）;Tanon3500型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）等。

1.3? 樣品核酸提取與純化

核酸提取參照試劑盒說明進行。取注射液樣品溶液加BA緩沖液混合均勻，轉(zhuǎn)移至核酸純化柱高速離心，棄去接液管中液體，然后向核酸純化柱加入G Binding Buffer后高速離心，棄去接液管中液體，之后向核酸純化柱加入Wash Buffer后高速離心，棄去接液管中液體，再次將核酸純化柱高速離心，并將純化柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管，最后向純化柱中加Elution Buffer，室溫溫育2 min，于10 000×g離心2 min并棄去純化柱，1.5 mL離心管中液體即為純化核酸得到的DNA樣品。

1.4? 卡介菌基因組和注射液核酸片段測序

1.4.1? 第三代測序技術(shù)對卡介菌基因組測序? 將從卡介菌菌體提取的全基因組核酸進行電泳檢測，合格后上第三代測序儀測序，獲得測序原始數(shù)據(jù)。接著基于測序數(shù)據(jù)進行基因組的從頭組裝，首先使用Falcon軟件進行原始數(shù)據(jù)的自我矯正及基因組初步組裝，基于Overlap-Layout-Consensus算法初步組裝得到一致性序列，之后采用GenomicConsensus軟件基于其中的Arrow算法以原始數(shù)據(jù)為輔助再次對一致性序列進行校正，再使用Sprai程序矯正過的原始序列作為輔助數(shù)據(jù)將組裝出來的一致性序列進行Circulator環(huán)化處理[13-14]，得到最終的基因組序列數(shù)據(jù)。

1.4.2? 第二代宏測序技術(shù)對注射液核酸片段測序? 將注射液分離提取的DNA進行電泳檢測，合格后進行測序建庫。檢測合格的DNA樣品先經(jīng)過 Covaris 隨機打斷成350～500 bp的片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit試劑盒進行建庫，DNA片段經(jīng)過末端修復(fù)、加poly A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟，最終完成文庫構(gòu)建。文庫檢驗合格后利用測序儀進行雙端測序，獲得所有片段的核酸序列信息。測序下機獲得原始測序數(shù)據(jù)后進入生物信息分析，主要通過對測序錯誤率、數(shù)據(jù)量、比對率、覆蓋度等進行統(tǒng)計，評估建庫測序是否達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)[15-17]，符合標(biāo)準(zhǔn)則獲得注射液核酸片段的測序數(shù)據(jù)。

1.5? 測序數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

將獲得的基因序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為excel 格式，應(yīng)用MATLAB軟件分析，撰寫分析函數(shù)程序，提取和尋找數(shù)據(jù)中CpG和CpG基序的位置及出現(xiàn)頻次，構(gòu)建頻次曲線及位置-頻次曲線。

1.6? 免疫因子TNF-α檢測實驗

首先將培養(yǎng)瓶中的巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞800×g離心5 min，棄上清，加新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，之后將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后置37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將細(xì)胞分以下幾組：A組代表從注射液中提取總核酸刺激細(xì)胞組;CpG組代表以注射液核酸為模板，PCR擴增得到富含CpG序列的核酸片段刺激細(xì)胞組;No-CpG組代表以注射液核酸為模板，PCR擴增得到不含CpG序列的核酸片段刺激細(xì)胞組;No-primer組代表擴增時未加引物的PCR體系（為CpG擴增的陰性對照）刺激細(xì)胞組;control：未做任何處理空白組。不同細(xì)胞組分別加入相同體積的核酸樣品，然后將24孔板置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，1 000×g離心20 min，取上清進行檢測。免疫因子TNF-α檢測實驗參照小鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書進行。提前將小鼠TNF-α ELISA試劑盒從4 ℃冰箱取出以平衡至室溫，設(shè)置空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液以減除顯色液的吸光度空白，其余孔中加不同濃度TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品以及上清樣品。封膠板紙封住反應(yīng)孔孵育，洗板之后，空白孔加入生物素化抗體稀釋液，其余孔加生物素化抗體工作液，封板孵育。然后洗板，空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液，封板孵育，洗板5次，加入顯色底物避光孵育，之后再加入終止液，混勻之后即刻使用酶標(biāo)儀測量OD450值。將6批次產(chǎn)品核酸設(shè)置為6個平行孔，以計算平均值。以標(biāo)準(zhǔn)品組測定的OD值與空白孔的OD值差值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出TNF-α濃度。

2 結(jié)果

2.1? 核酸物質(zhì)分離純化

2.1.1? 卡介菌菌體全基因組分離提取? 卡介菌菌絲體提取總核酸，電泳結(jié)果如圖1a，從圖中可以看出，提取的總核酸條帶清晰，無彌散帶，滿足第三代快速測序。

2.1.2? 注射液核酸物質(zhì)分離提取? 產(chǎn)品中核酸物質(zhì)分離純化后，DNA濃度得到進一步富集，使用超微量紫外分光光度計檢測核酸，可發(fā)現(xiàn)260/280值也得到顯著提高（從1.6提高到1.9），證明DNA得到純化，蛋白質(zhì)和多糖雜質(zhì)降低。電泳結(jié)果（圖1b）顯示，經(jīng)過過濾提純后，不同批次注射液核酸物質(zhì)條帶亮度增加，表明核酸物質(zhì)經(jīng)過離心過濾之后得到顯著富集，但條帶呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，不適用于第三代測序，而適用于第二代宏測序。故注射液中核酸物質(zhì)采用第二代宏測序技術(shù)進行序列測定。

2.2? 卡介菌基因組測序及注射液核酸宏測序

2.2.1? 卡介菌基因組測序情況? 測序獲得卡介菌完整基因組總長為4 326 779 bp，CpG含量為65.64%，與美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中卡介菌基因組數(shù)據(jù)基本一致。

2.2.2? 注射液核酸序列宏測序情況? 核酸序列測序獲得9 311 544個讀數(shù)片段，解讀出1 350 520 724 bases，有效解讀率達(dá)92%以上，與測序基因組比對發(fā)現(xiàn)，覆蓋率達(dá)99.22%，說明注射液核酸中99.22%以上來自卡介菌菌體基因組，其他部分為未解讀部分（片段太小未讀出）或來源不明。

2.3? 卡介菌全基因組免疫核酸序列分布和定位分析

2.3.1? 卡介菌基因組中CpG含量及分布分析? 以測序獲得的基因組序列為數(shù)據(jù)源，分析了基因組中“CpG”出現(xiàn)的頻次、分布圖（見圖2）和分布情況（見表1）。采用400 bp、1 000 bp、1×104 bp和1×105 bp 4種分析間隔分析基因組中CpG的出現(xiàn)頻次，由表1、圖2可知，卡介菌基因組中CpG出現(xiàn)總次數(shù)達(dá)5.5×105余次（不同分析間隔出現(xiàn)次數(shù)差異為分段引起），CpG占總基因組比例達(dá)25.5%左右，結(jié)果表明卡介菌基因組中富含CpG基元，容易形成大量滿足要求的CpG片段，起到免疫作用。進一步對CpG組在基因組位置分布進行分析，結(jié)果顯示CpG在整個基因組中每個區(qū)段均有分布，整體較平均，但也有部分區(qū)域比例偏高。

2.3.2? 基因組中CpG 基序頻次及分布分析? CpG分析可知卡介菌基因組中含有大量的CpG組，但核酸免疫往往以基序（6～20個核酸堿基組成的功能序列）的形式展現(xiàn)其免疫功能，因此對基序的分析更為重要。以對人特異免疫的4種CpG基序（GACGTT、AACGTT、GTCGTT、TTCGTT）為研究對象，分析了卡介菌基因組中這4種基序的頻次分布情況，結(jié)果如圖3，CpG基序在基因組中非常豐富，出現(xiàn)頻次也非常多，4種基序在整個基因組中出現(xiàn)總頻次為3 631次，占整個基因組的0.5%，其中GACGTT和GTCGTT分布出現(xiàn)1 337和1 336次，各占總頻次的37%，是4種基序的主要形式。對基序在基因組中的分布和定位發(fā)現(xiàn)，基序在基因組分布較為均勻，也有部分集中的區(qū)域。

2.4? 注射液核酸物質(zhì)與基因組比對及CpG基序分析

2.4.1? 注射液核酸片段序列與基因組比對結(jié)果

注射液核酸物質(zhì)測序共得到9 311 544個大小片段為300～500 bp的測量數(shù)，測量得到總堿基數(shù)為1 350 520 724 bases，按照卡介菌全基因組含4.32×106 bases，則測量結(jié)果可大致為282個拷貝（基因組）的堿基信息結(jié)果。

將注射液核酸測序結(jié)果與卡介菌基因組測序結(jié)果進行比對發(fā)現(xiàn)，注射液核酸序列有99.22%以上均能在基因組中找到，而基因組中每個堿基覆蓋1次和10次的概率均為100%，說明注射液中的核酸均來自卡介菌基因組。進一步對基因組各區(qū)域堿基的覆蓋次數(shù)進行比對，如圖4所示，注射液核酸片段在整個基因組中都出現(xiàn)較高程度的覆蓋和重復(fù)，平均重復(fù)次數(shù)在280次左右，與測序基因組拷貝數(shù)282個一致，說明注射液中核酸片段均來源于卡介菌基因組，且各片段的保留程度差異不大。同時從頻次數(shù)據(jù)可以看出，核酸片段在部分區(qū)段（第4.0×105～4.5×105、第3.6×106～3.8×106堿基處）顯著增多，說明這些區(qū)段核酸保留地較為豐富，但也有部分區(qū)域（第1.4×106～1.45×106堿基處）顯著低于平均值，說明可能有部分核酸的缺失。

2.4.2? 注射液核酸CpG基序保留情況及分布分析? 進一步對注射液核酸中保留的4種CpG基序進行分析，分別以10 000和100 000為間距進行統(tǒng)計分析，如圖5，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品核酸中保留了大量的CpG基序，除少數(shù)幾個顯著升高的區(qū)域，在全基因組中分布也較為平均。從出現(xiàn)頻次可以看出，在282個全基因組數(shù)據(jù)中保留了1 085 216次，相當(dāng)于每個卡介菌中保留了3 848次，該數(shù)據(jù)略高于從全基因組分析得到的3 631次，說明注射液產(chǎn)品中核酸物質(zhì)活性基序得到一定程度的富集。

進一步對4種CpG基序出現(xiàn)頻次比較，四種基序出現(xiàn)概率分別為GACGTT和GTCGTT各占37%、AACGTT占12%、TTCGTT占14%，與從全基因組分析得到的結(jié)果幾乎一致。其中，CpG基序中的GACGTT基序在整個產(chǎn)品核酸中出現(xiàn)頻次最高，且在部分區(qū)域表現(xiàn)出顯著升高，最高可達(dá)到4 247/1.0×105次堿基，表現(xiàn)出極高的比例。通過對CpG基序分布定位，有望找到富含CpG基序區(qū)域，為挖掘CpG免疫核酸制劑提供基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)資源。

2.5? 注射液中核酸物質(zhì)刺激細(xì)胞釋放免疫因子能力初探

為進一步考察卡介菌多糖核酸注射液中核酸物質(zhì)是否具有免疫刺激活性，以免疫細(xì)胞因子TNF-α為檢測細(xì)胞因子，研究了提取核酸及以提取核酸為模板克隆得到的含CpG和不含CpG核酸片段刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的能力。結(jié)果如圖6所示，從卡介菌注射液提取核酸物質(zhì)（A）能夠提高TNF-a釋放，證明了卡介菌注射液中核酸物質(zhì)能夠增強細(xì)胞因子釋放。使用GraphPad Prism 5軟件通過T檢驗分析方法發(fā)現(xiàn)，相對于無CpG的核酸片段和克隆緩沖液，克隆得到的富含CpG的核酸片段顯著刺激了細(xì)胞因子釋放，證明細(xì)胞因子釋放能力主要通過CpG起作用，而通過對卡介菌基因組測序有望篩選得到強免疫刺激能力核酸基序組合，為開發(fā)新產(chǎn)品提供依據(jù)。

3 結(jié)論

卡介菌多糖核酸注射液核酸物質(zhì)中豐富的CpG基序序列和片段，通過對核酸進行宏測序，獲得了詳細(xì)的核酸序列情況，與卡介菌基因組比對發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品核酸絕大部分來自卡介菌基因組，基因組覆蓋率達(dá)100%。注射液在制備過程中，基因組發(fā)生斷裂形成核酸片段，但具有免疫刺激作用的CpG基序在注射液核酸中保留完整，還呈現(xiàn)略有富集增加的趨勢，免疫因子刺激實驗也證明了注射液中豐富的CpG基序保證了產(chǎn)品的免疫刺激能力。實驗結(jié)果為闡述產(chǎn)品免疫功能及進一步建立產(chǎn)品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供了理論基礎(chǔ)。

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〔收稿日期〕2019-11-14

〔基金項目〕湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項目[湘財企指（2015）96號2015GK1024]。

〔作者簡介〕周云喜，男，執(zhí)業(yè)藥師，研究方向：生物制劑研制與生產(chǎn)。

〔通訊作者〕*趙李劍，女，高級實驗師，E-mail：zhaolj6926648@163.com。