發(fā)酵菌種對(duì)薏米乳品質(zhì)及代謝產(chǎn)物的影響

尚 英，杜曉宏，熊榮園

（南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 南充 637131）

薏米是我國(guó)傳統(tǒng)的滋養(yǎng)食品，其中不僅富含豐富的薏苡酸、薏仁素三萜類(lèi)化合物、甾醇類(lèi)化合物和生物堿等功能性成分[4-5]，還含有豐富的氨基酸、粗纖維以及眾多微量元素[6-7]。近年的研究表明，薏米具有抗氧化、延緩衰老等功能，薏仁酯也具有抗癌防癌的功效[8-12]。因薏米具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以薏米功能性食品也日益增多，其中很早就有研究將薏米粉與脫脂牛乳進(jìn)行混合后發(fā)酵得到新型發(fā)酵薏米乳飲品[13]，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化[14]。所用的發(fā)酵菌種常為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的混合菌以及從酸菜等其他發(fā)酵食品中分離的乳酸菌[15]，但是關(guān)于不同菌種發(fā)酵對(duì)薏米乳產(chǎn)品的影響缺少詳細(xì)的研究。

代謝組學(xué)技術(shù)是檢測(cè)生物體整體代謝特征的技術(shù)，隨著技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)代謝組學(xué)技術(shù)已被大量地應(yīng)用于食品的研究中[16-17]，代謝組學(xué)技術(shù)可以探索特定食物、食物成分或食物組合的代謝效應(yīng)，也就是說(shuō)，了解食物與生物體生物化學(xué)反應(yīng)方面的相互作用。對(duì)于國(guó)內(nèi)的研究主要關(guān)注某種條件的改變對(duì)食品中代謝物質(zhì)的影響，從而探索某些代謝途徑的變化，相關(guān)結(jié)論為開(kāi)發(fā)新型功能性食品提供理論依據(jù)[18-19]。本研究在對(duì)不同菌種發(fā)酵薏米乳營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及感官品質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，又利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同菌種發(fā)酵薏米乳產(chǎn)品的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行更深一步分析，為充分發(fā)揮發(fā)酵薏米乳產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米粉：普江市煥榮堂貿(mào)易有限公司；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：法國(guó)DANISCO公司；電子舌內(nèi)部溶液、參比溶液、陰、陽(yáng)離子溶液：日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；YR-8 超微粉碎機(jī)：濟(jì)南銀潤(rùn)包裝機(jī)械有限公司；手持式阿貝折光儀：上海西光實(shí)業(yè)有限公司；NDJ-1黏度儀：上海天平儀器廠；SOX 406 脂肪測(cè)定儀：蘇州貝銳儀器科技有限公司；RE52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：沈陽(yáng)凱威爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KDN-04C消化爐：浙江托普儀器有限公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀：美國(guó)TA儀器公司；SA402B電子舌：日本Insent公司；SHP8200 LC/TOFMS液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀：ABSCIEX公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵薏米乳的制備

薏米磨粉過(guò)篩→超微粉碎→加水?dāng)嚢琛犹恰鷼⒕臃N發(fā)酵→成品

取適量薏米粉過(guò)60目篩，室溫下經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎至粒徑約0.05 mm備用。取薏米粉20 g分別加入300 mL蒸餾水中，70 ℃水浴條件下攪拌5 min，取白糖40 g溶于200 mL蒸餾水中攪拌均勻，并與薏米粉溶液混合攪拌均勻。將混合好的薏米乳于90 ℃條件下殺菌5 min，降溫至40 ℃準(zhǔn)備接種發(fā)酵。

準(zhǔn)備上述薏米乳3份，分別加入0.005%的保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌，攪拌均勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 h，得到發(fā)酵薏米乳樣品。樣品制備重復(fù)3次，并將3次制備的樣品進(jìn)行混合后用于后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定。

1.3.2 不同菌種發(fā)酵薏米乳中營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定

可溶性固形物的含量通過(guò)手持式折光儀進(jìn)行測(cè)定[20]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法[21]；脂肪含量測(cè)定按照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》中索氏提取法[22]；三萜含量測(cè)定參照香草醛-硫酸比色法[23]；多糖含量采用硫酸-苯酚法[24]。

1.3.3 不同菌種發(fā)酵薏米乳電子舌味感的測(cè)定

取50 mL的發(fā)酵薏米乳樣品于6 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL加入5倍體積的蒸餾水，于室溫條件下靜置2 h，待液體穩(wěn)定后利用電子舌儀器測(cè)定其酸、苦、澀、咸、鮮五種味感的豐富度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 不同菌種發(fā)酵薏米乳樣品的物性及黏度的測(cè)定

通過(guò)TA質(zhì)構(gòu)分析儀分析不同菌種發(fā)酵薏米乳樣品的質(zhì)構(gòu)特性。采用直徑為2.5 cm的錐底圓柱形探針進(jìn)行分析，測(cè)試前的速率為4.0 mm/s，測(cè)試速率1.0 mm/s 進(jìn)入樣品20 mm的深度，測(cè)試樣品被壓縮兩次，間隔時(shí)間為4 s[25]。記錄待測(cè)樣品的硬度、粘力、膠著性、咀嚼性指數(shù)。不同菌種發(fā)酵薏米乳樣品的黏度通過(guò)NDJ-1黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.5 不同菌種發(fā)酵薏米乳代謝組學(xué)分析

（1）樣品預(yù)處理

精確移取100 μL待測(cè)樣品；加入800 μL預(yù)冷提取溶液（甲醇∶乙腈=1∶1，V/V）于樣品中，高通量組織破碎儀破碎；渦旋混勻后，冰上超聲萃取10 min，重復(fù)3次；將樣品-20 ℃靜置30 min；12 000 r/min、4 ℃離心15 min，離心后取上清液，氮?dú)獯蹈?00 μL復(fù)溶液（乙腈∶水=1∶1，V/V）復(fù)溶備用。試驗(yàn)重復(fù)6次。

（2）檢測(cè)條件

色譜條件為：BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈∶異丙醇（1∶1）（含0.1%甲酸），流速為0.45 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為40 ℃，洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵薏米乳樣品的流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 Mobile phase elution gradient of fermented coix beverage

質(zhì)譜條件：樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式，電噴霧毛細(xì)管電壓，進(jìn)樣電壓和碰撞能量分別為20～40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為100 ℃和350 ℃，載氣流量：800 L/h，質(zhì)譜掃描范圍：50～1 000m/z[26]。

（3）質(zhì)控

質(zhì)控（quality control，QC）樣品由所有檢測(cè)樣品混合而成，在儀器分析的過(guò)程中，每10個(gè)分析樣品插入一個(gè)QC樣品。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均值，誤差采用標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較法分析，圖表采用Excel 2013繪制。

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理：原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）進(jìn)行處理，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，保留非零值50%以上的峰；并對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriimination analysis，OPLS-DA）分析；采用HMDB、METLIN等代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.hmdb.ca/;https：//metlin.scripps.edu）進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

由表2可知，不同菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳的蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性固形物含量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。說(shuō)明發(fā)酵菌種的改變不會(huì)引起薏米乳產(chǎn)品蛋白組、脂肪、可溶性固形物含量的總體變化。而對(duì)薏米乳樣品中的多糖、三萜類(lèi)化合物含量有一定的影響。其中經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳中三萜類(lèi)化合物含量較高，為26.19 mg/L，經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳中多糖含量較高，為34.17 mg/L。

表2 發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分及功能物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of fermentation strains on the content of nutrients and functional substances in fermented coix beverage

2.2 發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳質(zhì)構(gòu)特性的影響

表3 發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 3 Effect of fermentation strain on texture characteristics of fermented coix beverage

由表3可知，不同菌種發(fā)酵可以改變發(fā)酵薏米乳的質(zhì)構(gòu)特性，總體來(lái)看，經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳其粘力、膠著性以及黏度較大（P＜0.05），說(shuō)明保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳產(chǎn)粘性物質(zhì)較多，薏米乳的結(jié)構(gòu)較緊密，產(chǎn)品較穩(wěn)定，而經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳產(chǎn)品結(jié)構(gòu)較松散，瑞士乳桿菌發(fā)酵的薏米乳質(zhì)構(gòu)特性居中。該結(jié)果表明了使用保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳質(zhì)構(gòu)特性較好。

2.3 發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳電子舌味感的影響

對(duì)不同菌種發(fā)酵的發(fā)酵薏米乳樣品進(jìn)行電子舌味感分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同菌種發(fā)酵薏米乳電子舌味感雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of electronic tongue taste of fermented coix beverage by different strains

從圖1可以看出，不同發(fā)酵菌種發(fā)酵的薏米乳的味感指標(biāo)存在明顯差異，其中甜味、酸味、鮮味差異偏大（P＜0.05），苦味、澀味無(wú)明顯差異（P＞0.05）。經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵的薏米乳顯出較大的鮮味，保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳甜味值和酸味值相對(duì)較高（P＜0.05）。而保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳鮮味相似，沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）；瑞士乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳甜味和酸味相似，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

對(duì)于不同發(fā)酵菌種發(fā)酵的薏米乳樣品味感值的差異產(chǎn)生原因可能是不同菌種的代謝產(chǎn)物不同導(dǎo)致的。保加利亞乳桿菌通常被用于酸奶的發(fā)酵中，其在牛乳中進(jìn)行發(fā)酵，可以產(chǎn)生二乙酰和乙醛等香氣成分，從而產(chǎn)生獨(dú)特的口感[27]。試驗(yàn)中，保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳酸味值較高可能由于保加利亞乳桿菌更加適于在薏米乳中發(fā)酵，發(fā)酵條件適宜，生長(zhǎng)速度較快，所以產(chǎn)酸增多，導(dǎo)致薏米乳酸味值較大。而瑞士乳桿菌有較好的發(fā)酵適應(yīng)性，其發(fā)酵代謝的薏米乳中可能產(chǎn)生大量鮮味物質(zhì)。

2.4 發(fā)酵菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳代謝產(chǎn)物的影響

2.4.1 發(fā)酵薏米乳樣品主成分分析

分別對(duì)保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌以及植物乳桿菌發(fā)酵的發(fā)酵薏米乳樣品進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)的測(cè)定，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，可以得出三種不同發(fā)酵菌種發(fā)酵的薏米乳樣品的差異性結(jié)果見(jiàn)圖2，其中距離越大代表薏米乳樣品間的差異越大。由圖2可知，質(zhì)控樣本點(diǎn)基本重合，可以得出試驗(yàn)的穩(wěn)定性較高，具有可靠性。三組樣品組間顯示較大區(qū)別，組內(nèi)顯示出了一定的聚集性。特別地，植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品與其他兩組樣品差異較大，而保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌發(fā)酵的薏米乳差異較小。說(shuō)明經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳與其他兩組樣品的代謝產(chǎn)物差異較大，為下面的進(jìn)一步分析提供了可視化的依據(jù)。

圖2 正負(fù)離子模式下不同菌種發(fā)酵薏米乳樣品主成分分析得分圖Fig.2 Principal component analysis score chart of different strains of fermented coix beverage in positive and negative ion mode

2.4.2 不同菌種發(fā)酵薏米乳樣品的差異代謝產(chǎn)物分析

三組薏米乳樣品差異代謝集Venn圖見(jiàn)圖3。由圖3可知，重疊部分表示多個(gè)分組共有的差異代謝產(chǎn)物數(shù)目，沒(méi)有重疊部分代表了差異代謝組中所特有的差異代謝物數(shù)目。該圖從宏觀上反映了代謝產(chǎn)物的特性。其中植物乳桿菌中有31種特有的差異代謝產(chǎn)物。此外，三組差異代謝產(chǎn)物所共有的代謝產(chǎn)物有38種，說(shuō)明此38種代謝產(chǎn)物受發(fā)酵菌種的種類(lèi)影響較大。

圖3 不同菌種發(fā)酵薏米乳樣品維恩圖Fig.3 Venn diagram of fermented coix beverage by different strains

不同菌種發(fā)酵的薏米乳樣品的差異代謝產(chǎn)物聚類(lèi)熱圖見(jiàn)圖4。

圖4 不同菌種發(fā)酵的薏米乳樣品差異代謝產(chǎn)物聚類(lèi)熱圖Fig.4 Heat map of differential metabolites in fermented coix beverage by different strains

通過(guò)對(duì)不同菌種發(fā)酵的薏米乳樣品進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，共檢測(cè)到了947種差異代謝產(chǎn)物，采用T檢驗(yàn)結(jié)合正交最小偏二乘判別分析的方法，篩選出組間差異代謝物（同時(shí)滿(mǎn)足VIP＞1，P＜0.05），并對(duì)其進(jìn)行鑒定。由圖4可知，從總體上來(lái)看，植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳中代謝產(chǎn)物與其他兩組差異較大，該結(jié)果與PCA相符。其中經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品與保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品相比，共檢測(cè)出121種差異代謝產(chǎn)物。植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品與瑞士乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品相比，共檢測(cè)出97種差異代謝產(chǎn)物。其中植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品中代謝產(chǎn)物與其他兩組樣品相比，均呈顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物41種，包括短肽：精氨酸-谷氨酸-精氨酸-甘氨酸（Arg-Gln-Arg-Gly）；精氨酸-丙氨酸-賴(lài)氨酸-色氨酸（Arg-Ala-Lys-Trp）；脯氨酸-異亮氨酸-脯氨酸（Pro-Ile-Pro）；L-苯丙氨酸-L-脯氨酸（L-Phe-L-Pro）；吲哚乙酸、泛酸、亞油酸、β-檸檬酰-L-谷氨酸；脂類(lèi)：腦磷脂（即磷脂酰乙醇胺，phosphatidyl ethanolamine，PE）（16∶1（9Z）/P-18∶1（11Z））、PE（16∶1（5Z）/16∶1（5Z））、PE（15∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z））等。其中均呈顯著下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物23種。

通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵菌種發(fā)酵的薏米乳樣品進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析可以得出，與其他兩組相比植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳中的短肽類(lèi)物質(zhì)顯著增加，脂類(lèi)物質(zhì)有所減少。這可能是植物乳桿菌的發(fā)酵可以更多分解薏米乳中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成短肽以及氨基酸等物質(zhì)。短肽是薏米乳中的功能性物質(zhì)，研究表明短肽具有降血壓、抗氧化等多種功能性作用[28]，通過(guò)植物乳桿菌的發(fā)酵，其短肽的增多也一定程度地表明了植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳更具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究分別對(duì)不同菌種發(fā)酵薏米乳產(chǎn)品的品質(zhì)特性及差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行了較全面的分析，研究了菌種對(duì)薏米乳發(fā)酵產(chǎn)生的影響。植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳可以增加薏米乳中的三萜類(lèi)化合物含量，保加利亞乳桿菌發(fā)酵可以增加薏米乳中的多糖含量；從發(fā)酵薏米乳的品質(zhì)特性可以看出，保加利亞乳桿菌發(fā)酵的薏米乳具有較好的粘力、膠著性以及黏度，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高；瑞士乳桿菌發(fā)酵的薏米乳口感較好。代謝組學(xué)技術(shù)可以得到全面準(zhǔn)確性較高的差異代謝產(chǎn)物，為研究不同菌種對(duì)發(fā)酵薏米乳中代謝產(chǎn)物的影響提供理論依據(jù)。正負(fù)離子掃描下的基峰圖顯示三種不同發(fā)酵菌種發(fā)酵的薏米乳峰圖存在較大差異，其中非靶向代謝組學(xué)試驗(yàn)共檢測(cè)出947種代謝產(chǎn)物，其中植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳樣品中檢測(cè)到更多的短肽類(lèi)化合物、吲哚乙酸、泛酸、亞油酸、β-檸檬酰-L-谷氨酸以及腦磷脂PE（16∶1（9Z）/P-18∶1（11Z））、PE（16∶1（5Z）/16∶1（5Z））、PE（15∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z））等多種功能性成分，說(shuō)明植物乳桿菌發(fā)酵的薏米乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相對(duì)較高。