ACTB基因引物的設(shè)計(jì)及其在醫(yī)學(xué)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

宋輝 張婷 禹文峰

摘? 要：目的 針對(duì)ACTB基因設(shè)計(jì)引物，并在醫(yī)學(xué)本科分子生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）讓學(xué)生認(rèn)識(shí)真核基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。方法 通過在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)針對(duì)ACTB基因的引物，通過改變退火溫度，優(yōu)化PCR體系，同時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)教學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)引物的特異性。結(jié)果 針對(duì)ACTB基因外顯子3和外顯子4設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，引物1和引物2。引物1在退火溫度68℃時(shí)，表現(xiàn)出較高的特異性和PCR產(chǎn)量。以基因組DNA（gDNA）和cDNA為模板，PCR產(chǎn)物大小相差441bp。以此條件，引物1在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中也表現(xiàn)出較好的效果，目的基因擴(kuò)增成功率達(dá)到90%以上。結(jié)論 引物1在退火溫度68℃時(shí)，利用PCR技術(shù)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，學(xué)生們可以形象的理解真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，值得在醫(yī)學(xué)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。

關(guān)鍵詞：ACTB;PCR;真核基因結(jié)構(gòu);分子生物學(xué);實(shí)驗(yàn)教學(xué)

Abstract： Objective To design specific primer for ACTB and apply it in the molecular biology experiment teaching for medical undergraduate to help them understand the structure characteristics of eukaryotic genes with intron and exon through PCR. Methods ACTB primers were designed using online tool Primer-BLAST. PCR system was optimized by different annealing temperatures. Primer specificity was evaluated based on experiment teaching results. Results Two ACTB primers （primer 1 and primer 2） were designed spanning exon 3 and exon 4. Primer 1 showed high specificity and PCR yield at annealing temperature of 68 ℃. There was 441 bp difference of PCR product between genomic DNA （gDNA） and cDNA as template. Under this condition， we also obtained a satisfied experiment teaching result for primer 1， with more than 90% successful amplification rate of target gene. Conclusion Students can easily understand the structural characteristics of eukaryotic genes by PCR using primer 1 at annealing temperature of 68 ℃， which is worth popularizing in the molecular biology experiment course for medical undergraduates.

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，由變性、退火和延伸三步反應(yīng)組成，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[1]。目前，PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷、微生物檢測(cè)、法醫(yī)鑒定和基因工程等領(lǐng)域[2-5]。在醫(yī)學(xué)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，開設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)課有助于學(xué)生們將理論與實(shí)踐相結(jié)合，增強(qiáng)動(dòng)手能力。本實(shí)驗(yàn)以ACTB基因?yàn)槔?，從引物設(shè)計(jì)、PCR條件優(yōu)化、產(chǎn)物檢測(cè)、教學(xué)實(shí)踐等多個(gè)環(huán)節(jié)，讓學(xué)生們認(rèn)識(shí)真核基因中內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

一、材料和方法

（一）材料

HEK-293T細(xì)胞（ATCC），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），血清（四季青）。TRIzol（Invitrogen），基因組提取試劑盒（天根，#DP348-02），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，#K1622），Taq 酶（TaKaRa，#R001BM），引物合成（上海生工）。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)

EK-293T細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。48h后PBS沖洗一次，胰蛋白酶消化2min，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞，分裝成6管，直接或加入1ml TRIzol后，-80℃保存。

（三）基因組DNA提取

在所收集的細(xì)胞沉淀中加入300μl PBS，輕輕吹打，成細(xì)胞懸液。按照基因組提取試劑盒說明書，提取基因組DNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，-20℃保存。

（四）總RNA的提取和cDNA的合成

利用TRIzol法提取HEK-293T細(xì)胞的總RNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。取3μl RNA，按照表1配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件42℃ 60min，70℃ 5min，-20℃保存。

（五）引物設(shè)計(jì)

從NCBI中獲取ACTB基因（NM_001101.5）的mRNA序列，利用在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，送至上海生工進(jìn)行合成。

（六）PCR

按照表2配制反應(yīng)體系，混合均勻，在ABI PCR ProFlex儀上進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5min;變性95℃ 30s，退火68℃ 30s，延伸72℃ 40s，30個(gè)循環(huán);終末延伸72℃ 5min。

表2 PCR體系（25μl）

（七）瓊脂糖凝膠電泳

配制1%的瓊脂糖凝膠，加熱使融解，待冷卻至50℃左右，加入10mg/ml溴化乙錠（5μl/100ml 1%的瓊脂糖凝膠），混勻，倒入制膠板中，室溫放置45min，向25μl PCR產(chǎn)物中加入6×加樣緩沖液5μl，混勻后取8μl，點(diǎn)樣。120V，電泳45min，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）下拍照，記錄結(jié)果。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）引物設(shè)計(jì)

通過NCBI查找基因ACTB的mRNA序列，發(fā)現(xiàn)該基因含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其中外顯子3和外顯子4間隔441bp（圖1A）。因此，跨外顯子3和外顯子4設(shè)計(jì)引物，可以很好地鑒別內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。依據(jù)引物的特性，我們利用Primer-BLAST針對(duì)外顯子3和外顯子4的序列設(shè)計(jì)引物，我們獲得兩對(duì)引物，Primer 1（Forward primer：GGCATCCTCACCCTGAAGTA;Reverse primer：TAGCACAGCCTGGATAGCAA）和Primer 2（Forw

ard primer：CTGAAGTACCCCATCGAGCA;Reverse primer：AGCCTGGATAGCAACGTACA）（圖1B）。

（二）PCR條件優(yōu)化

我們所提取的總RNA濃度為1054.1ng/μl，gDNA濃度為440.7ng/μl。在不同退火溫度（56℃、60℃、64℃、68℃和70℃）條件下，對(duì)引物的特異性進(jìn)行了檢測(cè)。如圖2所示，以cDNA為模板，引物1和引物2均顯示出了較高的特異性;以gDNA為模板，引物1和引物2在68℃和70℃時(shí)表現(xiàn)出較高的特異性，但是在相同溫度下，引物1的目的DNA片段的擴(kuò)增效率高于引物2。因此，我們選擇引物1和退火溫度68℃，作為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的PCR條件。

（三）實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

本科生物技術(shù)和化學(xué)生物學(xué)專業(yè)學(xué)生合計(jì)153人，兩人一組，合計(jì)77組，分為7個(gè)班進(jìn)行授課。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，RNA濃度最低267.1ng/μl，最高2283.4ng/μl，800-1200ng/μl組數(shù)最多，占31.2%（23/77）（圖3A）;gDNA濃度最低25.5ng/μl，最高512.7ng/μl，200-300ng/μl組數(shù)最多，占27.3%（21/77）（圖3B）。如圖4所示，引物1在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中顯示出較好的效果，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，以cDNA為模板，目的DNA片段擴(kuò)增正確率92.2%（71/77），以gDNA為模板，目的DNA片段擴(kuò)增正確率90.9%（70/77），僅1組cDNA的PCR產(chǎn)物大小不正確，大小在400bp左右。通過瓊脂糖凝膠電泳，學(xué)生觀察到分別以gDNA和cDNA為模板，PCR產(chǎn)物大小相差400bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。

三、討論

人ACTB基因位于第7號(hào)染色體p22.1，長(zhǎng)度36，637bp，所編碼的蛋白β-actin大小約42kDa，屬于肌動(dòng)蛋白家族[6]。β-actin高度保守，分布廣泛，表達(dá)水平高，常用作內(nèi)參基因。然而，受一些生化刺激或在疾病狀態(tài)下，β-actin的表達(dá)水平也會(huì)發(fā)生變化[7]。研究發(fā)現(xiàn)，β-actin參與多種生物學(xué)過程，包括：細(xì)胞骨架形成，細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和遷移，組蛋白修飾和基因表達(dá)調(diào)控等[8-10]。ACTB表達(dá)異?；蛲蛔兣c腫瘤的發(fā)生，Baraitser-Winter綜合癥，血小板缺少癥以及貝克痣綜合征等密切相關(guān)[11-14]。

與原核生物不同，大多數(shù)真核生物基因都是斷裂基因，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要去除內(nèi)含子，將外顯子拼接成連續(xù)的序列。我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物時(shí)考慮到本實(shí)驗(yàn)的目的是認(rèn)識(shí)真核生物的結(jié)構(gòu)，因此上、下游引物必須跨外顯子。其次，為了更直觀的觀察到內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，最好只跨一個(gè)內(nèi)含子，這樣便于學(xué)生理解。再次，內(nèi)含子的大小，太大會(huì)延長(zhǎng)上課時(shí)間，太短無(wú)法直觀區(qū)分PCR產(chǎn)物大小的差異。因此，我們針對(duì)外顯子3和外顯子4設(shè)計(jì)上、下游引物。

PCR的溫度控制十分關(guān)鍵，尤其退火溫度。退火溫度主要影響PCR的特異性和產(chǎn)量：退火溫度過低，會(huì)出現(xiàn)非特異性雜帶;提高溫度可以提高引物特異性，但溫度過高，引物不能與模板的結(jié)合，PCR產(chǎn)量降低。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們也觀察到隨著退火溫度的提高，非特異性雜帶減少。對(duì)引物1和引物2來說，當(dāng)采用68℃和70℃的退火溫度時(shí)，非特異性條帶明顯減少，但70℃的PCR產(chǎn)量低于68℃。在同一溫度（68℃或70℃）下，引物2的PCR產(chǎn)量明顯低于引物1。因此，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，我們采用引物1和退火溫度68℃。

從教學(xué)結(jié)果來看，90%以上學(xué)生的結(jié)果與預(yù)期一致。在對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)漏加試劑成為實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因。由于每個(gè)學(xué)生操作的個(gè)體差異，總RNA和gDNA的濃度差異較大，成為影響PCR產(chǎn)量的重要原因。而在科學(xué)研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須具有良好的可重復(fù)性，應(yīng)盡量避免人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在未來的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，除了講解實(shí)驗(yàn)原理和步驟，應(yīng)在操作的規(guī)范方面加強(qiáng)訓(xùn)練。

四、結(jié)束語(yǔ)

從教學(xué)效果來看，我們所設(shè)計(jì)的ACTB引物1和本文所采用的PCR條件可以很好地讓學(xué)生理解真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn);同時(shí)，將PCR技術(shù)引入到醫(yī)學(xué)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，可以培養(yǎng)學(xué)生的科研思維，提高分析問題和解決問題的能力，值得在醫(yī)學(xué)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。

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