姜黃素與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合用藥抗乳腺癌活性研究

廖友生 康小英

【摘 要】本文通過(guò)體外細(xì)胞和裸鼠皮下移植瘤模型來(lái)探討姜黃素與組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素與SAHA聯(lián)合用藥在體外細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型中均展現(xiàn)出了良好的抗乳腺癌活性，并強(qiáng)于姜黃素或SAHA單獨(dú)用藥;此外，姜黃素與SAHA聯(lián)合用較SAHA單獨(dú)用藥具有更高的安全性。這些結(jié)果為乳腺癌的聯(lián)合用藥提供了一定的參考，值得進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】： 姜黃素; 組蛋白去乙酰化酶抑制劑;聯(lián)合用藥; 抗乳腺癌活性

【中圖分類號(hào)】R539【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1005-0019（2020）08--01

乳腺癌已經(jīng)成為全球女性的頭號(hào)殺手，其發(fā)病率正在逐年升高，并年輕化。目前在臨床上主要采用激素替代治療法，但是長(zhǎng)期用藥容易出現(xiàn)耐藥性[1];此外，有約25%左右的乳腺癌患者是三陰性乳腺癌，由于缺乏治療靶點(diǎn)，傳統(tǒng)的激素替代治療法對(duì)其無(wú)效，并對(duì)化療不敏感，患者生存期較低[2]。因此，發(fā)展新型的治療方法對(duì)乳腺癌，尤其是三陰性乳腺癌，具有重要的意義。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，癌癥包括乳腺癌是一個(gè)多基因疾病，僅僅抑制單一靶點(diǎn)通常難以取得預(yù)期的治療效果，并很容易出現(xiàn)耐藥性。相應(yīng)地，從多個(gè)角度攻擊疾病可克服許多單靶點(diǎn)藥物的缺點(diǎn)，由此產(chǎn)生多靶點(diǎn)治療可以同時(shí)調(diào)節(jié)腫瘤網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的多個(gè)途徑，能夠提供治療效果并不易產(chǎn)生耐藥性，現(xiàn)已在很低重大疾病治療中開始應(yīng)用[3]。因此，在本研究中我們探討了在單獨(dú)使用時(shí)對(duì)乳腺癌均具有治療效果的姜黃素與組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA在聯(lián)合用藥后對(duì)乳腺癌的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與細(xì)胞株

姜黃素和伏立諾他 （SAHA）均購(gòu)置北京伊諾凱科技有限公司 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）;無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Hyclone公司;MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和VERO細(xì)胞株均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞典藏中心。Balb/c裸鼠，4-5 周齡，體重 16-22g，購(gòu)置北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SCXK（京） 2016-0011）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A三種細(xì)胞接種于75 mL的培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清的無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)液，在37 °C、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育進(jìn)行傳代。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞用胰酶消化后，離心并收集細(xì)胞，然后用Matrigel膠將MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行混懸。于裸鼠右側(cè)肩部皮下種植0.2 mL的MDA-MB-231細(xì)胞混懸液 （4×106 ～ 5 ×10 6細(xì)胞）。

1.4 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法對(duì)姜黃素、SAHA以及姜黃素和SAHA聯(lián)合用藥組進(jìn)行體外抗乳腺癌活性測(cè)試。其中乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株為測(cè)試細(xì)胞株，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和正常非洲綠猴腎細(xì)胞VERO為對(duì)照細(xì)胞株。將測(cè)試藥物用DMSO溶解后，再用無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A和VERO細(xì)胞鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL （4～8）×104個(gè)/mL的細(xì)胞混懸液。置于37 oC、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時(shí)后待細(xì)胞完全貼壁棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100 ?L含有不同濃度待測(cè)試藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育3天，加入30 μL 5 mg/mL 的MTT，繼續(xù)孵育4小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，每孔每孔加入100 μL 二甲亞砜 （DMSO）溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度（OD）值，并計(jì)算出藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。

1.5 體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

向裸鼠接種MCF-7細(xì)胞后，待荷瘤體積長(zhǎng)至約50 mm3大小時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分成空白對(duì)照組、姜黃素組、SAHA組和姜黃素與SAHA的聯(lián)合用藥組，每組 4只，均進(jìn)行灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)組每組給予 25 mg/kg的劑量，對(duì)照組給予等體積的生理鹽水對(duì)照，每2天給藥一次，在給藥18天后將所有裸鼠的腫瘤取下，稱量腫瘤的重量，計(jì)算出腫瘤的抑制率。腫瘤抑制率 （%） = （1-T/C） × 100，T和C分別表示治療結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤的重量。

2 結(jié)果

2.1 體外抗腫瘤活性

體外抗乳腺癌的結(jié)果如表1所示，姜黃素和SAHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231均有明顯地抑制活性，其IC50均低于20 μM。當(dāng)姜黃素和SAHA聯(lián)合用藥時(shí)，其抗MCF-7和MDA-MB-231的活性較單獨(dú)用姜黃素或SAHA時(shí)均明顯地提高。這些結(jié)果說(shuō)明姜黃素和SAHA聯(lián)合用藥具有更強(qiáng)地抗腫瘤效果。更重要的是，盡管SAHA對(duì)正常的乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A沒(méi)有毒性，但是其對(duì)正常的VERO細(xì)胞卻展現(xiàn)出了一定的毒性 （IC50 = 4.1 μM），而采用聯(lián)合用藥后其毒性明顯地降低 （IC50 = 31.8 μM）。這個(gè)結(jié)果表明聯(lián)合用藥組較SAHA單獨(dú)用藥具有更高的安全性。

2.2 體內(nèi)抗腫瘤活性

在體外研究中，姜黃素與SAHA聯(lián)合用藥對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞展現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤活性。因此，我們構(gòu)建了MDA-MB-231動(dòng)物模型來(lái)研究聯(lián)合用藥在動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果如表2所示。姜黃素和SAHA對(duì)腫瘤的抑制率分別為21.1%和49.1%，而聯(lián)合用藥組的抑制率為53.1%。這些結(jié)果說(shuō)明姜黃素與SAHA聯(lián)合用藥的體內(nèi)抗腫瘤效果也要強(qiáng)于單獨(dú)用藥。

3 討論

姜黃素是從中藥姜黃的根莖中提取到的一類酚類色素，具有明顯地抗腫瘤活性。姜黃素的抗腫瘤活性具有多效性和途徑多樣性，對(duì)同一腫瘤能同時(shí)發(fā)揮多種效能，一類多靶點(diǎn)的藥物[4]。例如，在治療乳腺癌中能同時(shí)通過(guò)特異性誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡、抑制乳腺癌細(xì)胞代謝、影響乳腺干細(xì)胞等多途徑發(fā)揮治療效果[5]。此外，因其毒副作用小、安全性高等特點(diǎn)常和其他抗腫瘤藥物如卡鉑進(jìn)行聯(lián)合用藥來(lái)治療乳腺癌[6]。

組蛋白去乙酰化酶 （histone deacetylase， HDAC）是一類蛋白酶，對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾與基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中包括乳腺癌細(xì)胞HDAC呈現(xiàn)出過(guò)表達(dá)狀態(tài)[7]。HDAC抑制劑能夠HDAC的表達(dá)，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前已有多種HDAC抑制劑被開發(fā)用來(lái)治療不同的腫瘤[8]。但是，HDAC抑制劑通常具有一定的毒副作用[9]，這限制了其在臨床上的應(yīng)用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物不僅具有抗腫瘤活性，而且低毒，將其與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用將具有更好的療效和更高的安全性[10]。因此，在本研究中，我們將天然產(chǎn)物姜黃素與HDAC抑制劑SAHA聯(lián)用來(lái)治療乳腺癌。我們的結(jié)果表明，姜黃素與SAHA聯(lián)用后不僅較單獨(dú)使用姜黃素或SAHA提高了治療乳腺癌的效果，還較SAHA有更高的安全性。這為今后乳腺癌的聯(lián)合用藥治療提供了一定的參考意義。

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